本發(fā)明涉及表觀遺傳學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種用于表觀遺傳分析的設(shè)備和方法。

背景技術(shù)：

表觀遺傳(epigenetics)是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。這種改變是細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)發(fā)生的改變，且這種改變在發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞。用于表觀遺傳測試的當(dāng)前方法涉及全分子分析。結(jié)果代表來自遺傳物質(zhì)的多個拷貝的復(fù)合信號，這不同于單分子分析。組蛋白修飾通常使用染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)(ChIP)來探測，在ChIP中，修飾特異性抗體用于免疫沉淀相關(guān)的DNA，該DNA然后通過雜交至微陣列(Ren等人(2000)Scienc，290，2306-2309)(ChIP-ChIP)或深度測序(Barski等人(2007)Cell，129，823-837)(ChIP-seq)來探測。DNA甲基化還可以通過使用甲基胞嘧啶抗體的免疫沉淀反應(yīng)(Weber等人(2005)Nature Genetics，37，853-862)或采用提供DNA甲基化狀態(tài)的更全面分析的亞硫酸氫鹽測序(Zhang等人(2006)Cell，126，1189-1201)來探測。使用抗體的全基因組表觀遺傳分析常常使用大約106至107個細(xì)胞。ChIP使用少至100個細(xì)胞，然而，使用該少的細(xì)胞，分析是基因座特異性的而不是全基因組的(O′Neill等人(2006)NatureGenetics，38，835-841)。當(dāng)研究設(shè)法確定兩個或更多個表觀遺傳標(biāo)記是否在基因組內(nèi)重合或是否存在于單件遺傳物質(zhì)例如單一染色質(zhì)上時，遭遇更多顯著局限性。每一個表觀遺傳標(biāo)記的分析需要獨立的免疫沉淀反應(yīng)。當(dāng)用不同的抗體使染色質(zhì)從細(xì)胞總體沉淀時，難以從總體內(nèi)的多個種群的存在區(qū)分被探測的標(biāo)記的真正重合，每一個具有不同的表觀遺傳特征。這可以用序列ChIP來稍微克服，序列ChIP中通過一種抗體沉淀的材料用第二抗體再ChIP(Bernstein等人(2006)Cell，125，315-326)。然而，這些技術(shù)經(jīng)不起全基因組分析或調(diào)查多于兩種表觀遺傳標(biāo)記的研究。此外，全分析技術(shù)報告種群的平均值且并不考慮單分子水平的變化形式。因此，對提供更可靠的全基因組表觀遺傳分析的可選擇的方法和組合物仍存在相當(dāng)大的需求。本發(fā)明滿足該需求并提供相關(guān)的優(yōu)點，鑒于上述提到的問題，本發(fā)明設(shè)計一種用于表觀遺傳分析的設(shè)備和方法，以解決上述提到的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于表觀遺傳分析的設(shè)備和方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的這些技術(shù)經(jīng)不起全基因組分析或調(diào)查多于兩種表觀遺傳標(biāo)記的研究，全分析技術(shù)報告種群的平均值且并不考慮單分子水平的變化形式的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種用于表觀遺傳分析的設(shè)備，包括箱體，所述箱體的內(nèi)腔設(shè)置有通道，所述通道的內(nèi)腔頂部設(shè)置有光源裝置，所述通道的內(nèi)腔底部設(shè)置有接觸裝置，所述箱體的頂部左右兩側(cè)分別設(shè)置有控制器和顯示屏，所述箱體的左側(cè)設(shè)置有激光器，所述控制器分別與光源裝置、接觸裝置、顯示屏和激光器電性連接。

優(yōu)選的，所述通道為亞微米通道。

優(yōu)選的，所述激光器的右壁安裝有激發(fā)濾光器。

優(yōu)選的，所述接觸裝置為微流控設(shè)備。

一種用于表觀遺傳分析的方法，該種用于表觀遺傳分析的方法步驟如下：

S1：提取染色質(zhì)樣品：挑單菌落，接種于YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，將YPD培養(yǎng)基置于25-30℃下保存，取一只150mL燒瓶，將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋至40-60mL,然后將燒瓶在25-30℃下培養(yǎng)，用終濃度為2％的甲醛交聯(lián)細(xì)胞30-40min，加入終濃度為125mM的甘氨酸，反應(yīng)4-10min，使反應(yīng)猝熄，收集細(xì)胞，用20-30mL的PBS緩沖液清洗菌體1-2次，重懸菌體，取一只15mL的圓錐試管，將菌體重懸于組成的溶液中，加入終濃度為0.20-0.30mg/mL的酵母裂解酶進(jìn)行震蕩，得到原生質(zhì)體，向原生質(zhì)體溶液中加入微球菌核酸酶稀釋，再加入SDS和EDTA終止反應(yīng)，在60-70℃過夜保存，再用氯仿抽取DNA，用無水乙醇沉淀DNA，再加入80-100μl的TE溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

S2：序列特異性探針標(biāo)記染色質(zhì)：先用適量的DNaseI在二價鎂離子存在下，在雙鏈染色質(zhì)上打開單個單鏈缺口，利用DNA聚合酶的核酸外切酶活性在切處將舊鏈從末端逐步切除，同時在DNA聚合酶活性的作用下，順序?qū)⑻禺愋蕴结樳B接到切口的末端氫氧基上，以互補(bǔ)的DNA單鏈為模板合成新的DNA單鏈；

S3：MBD1標(biāo)記染色質(zhì)：將MBD1的甲基化敏感的結(jié)合域MBD被克隆到pET-30b質(zhì)粒，以產(chǎn)生在IPTG誘發(fā)下表達(dá)的His-tag融合蛋白，溶解IPTG誘發(fā)的大腸桿菌，且純化并在鎳柱上再折疊融合蛋白，在純化之后，使用標(biāo)記游離胺的微刻度標(biāo)記試劑盒用Alexa488來標(biāo)記融合蛋白，進(jìn)行三次另外的樹脂純化循環(huán)以更好地將游離標(biāo)記純化掉，用Southwestern槽的印跡來測定所標(biāo)記的MBD探針的完整性，以50ng/μL懸浮在1x的Tris緩沖鹽水中的甲基化的DNA和未甲基化的DNA的混合物中，我們使用TOTO-3來進(jìn)行DNA染色，然后，將約1μg的經(jīng)標(biāo)記的DNA稀釋到包含具有2％牛血清蛋白和0.1％TritonX-100(v/v)的1x的TBS的20μL的緩沖液中，然后，將以280ng/μL儲存的且用AlexaFluor488標(biāo)記的1μL的MBD1的容積添加到DNA以便在摩爾過量的條件下進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)；結(jié)合反應(yīng)在室溫下發(fā)生2-3小時；

S4：染色質(zhì)樣品與通道接觸：將樣品保持在它們相應(yīng)的儲存緩沖液中，直到DNA標(biāo)記和MBD結(jié)合反應(yīng)，在這些反應(yīng)之后，連續(xù)地將樣品稀釋在1x的TBE，89mM的TRIS硼酸鹽和2mM的EDTA，最終的稀釋將樣品懸浮在600pM的估計濃度，標(biāo)稱為對于染色質(zhì)樣品為1-2ng/μL，且對于甲基化的DNA樣品為約0.25ng/μL，緩沖液中的聚合物添加劑用于限制電滲流并防止與流控通道壁的非特異性相互作用而不使得蛋白質(zhì)變性，我們將50μL的樣品溶液加載到流控通道陣列的輸入儲器中，且然后連接到陰極，輸出儲器僅包含緩沖液溶液，且連接到陽極，對于所有的染色質(zhì)樣品，在偏置電壓下，且對于所有的甲基化的DNA樣品，在偏置電壓下，使得樣品在20-30min的預(yù)流時間期間建立穩(wěn)定的電動流動，以確保在數(shù)據(jù)收集之前已經(jīng)實現(xiàn)穩(wěn)態(tài)流條件，檢查每一種樣品達(dá)總計15min，總是使用陣列內(nèi)的相同流控通道，在單分子探測之后，在加載下一個樣品之前，反復(fù)沖洗流控通道陣列達(dá)總計30min，且然后檢查以驗證熒光標(biāo)記的分子的消失；

S5：測試與分析：將序列特異性探針標(biāo)記的染色質(zhì)和MBD1標(biāo)記的染色質(zhì)流過通道，利用光源裝置照亮通道以產(chǎn)生多個探詢?nèi)莘e，每一個探詢?nèi)莘e由通道的壁和光束限制，探測來自多個的相同或不同探詢?nèi)莘e的至少一個標(biāo)記和一個其他標(biāo)記，以產(chǎn)生至少一個標(biāo)記和至少一個其他標(biāo)記的時間相關(guān)的分辨率，利用激光器在通道內(nèi)的溶液中的DNA樣品流動、用高斯形狀的激光剖面照亮樣品和探測表示組蛋白或DNA組分的熒光事件，控制器被編程為提供來自一個或多個探詢?nèi)莘e的至少兩種類型的信號的實時的時間相關(guān)的分辨率，由此表征物體，顯示屏其配置成接收來自處理器的數(shù)據(jù)和顯示數(shù)據(jù)，其中數(shù)據(jù)包括關(guān)于來自一個或多個探詢?nèi)莘e的至少兩種類型的信號的信息。

優(yōu)選的，所述步驟S1中組成的溶液為50mM的TRIS、山梨醇、和10mM的β-巰基乙醇。

優(yōu)選的，所述步驟S3中的1x的TBS為50mM晶體氯化氫和138mM氯化鈉和2.7mM氯化鈉。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：該種用于表觀遺傳分析的設(shè)備和方法，結(jié)構(gòu)簡單，增設(shè)了全基因組分析或調(diào)查多于兩種表觀遺傳標(biāo)記的研究，提供了更可靠的全基因組表觀遺傳分析可選擇的方法，滿足了組合物的需求，大大減少了成本，使得人們在表觀遺傳學(xué)上更好的進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

附圖說明

圖1為本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明分析方法步驟圖。

圖中：1 箱體、2 通道、3 光源裝置、4 接觸裝置、5 控制器、6 顯示屏、7 激光器。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

請參閱圖1-2，本發(fā)明提供一種技術(shù)方案：一種用于表觀遺傳分析的設(shè)備，包括箱體1，箱體1的內(nèi)腔設(shè)置有通道2，其配置成保持所述物體，通道2的內(nèi)腔頂部設(shè)置有光源裝置3，其配置成照亮所述通道以產(chǎn)生一個或多個探詢?nèi)莘e，通道2的內(nèi)腔底部設(shè)置有接觸裝置4，箱體1的頂部左右兩側(cè)分別設(shè)置有控制器5和顯示屏6，控制器5被編程為提供來自所述一個或多個探詢?nèi)莘e的所述至少兩種類型的信號的實時的時間相關(guān)的分辨率，由此表征所述物體，顯示屏6為用戶界面，其配置成接收來自所述處理器的數(shù)據(jù)和顯示所述數(shù)據(jù)，其中所述數(shù)據(jù)包括關(guān)于來自所述一個或多個探詢?nèi)莘e的所述至少兩種類型的信號的信息，箱體1的左側(cè)設(shè)置有激光器7，其配置成探測表示來自所述一個或多個探詢?nèi)莘e的所述物體的兩種不同的特性的至少兩種類型的信號，控制器5分別與光源裝置3、接觸裝置4、顯示屏6和激光器7電性連接。

其中，通道2為亞微米通道，其配置成保持所述物體，激光器7的右壁安裝有激發(fā)濾光器，接觸裝置4為微流控設(shè)備。

一種用于表觀遺傳分析的方法，該種用于表觀遺傳分析的方法步驟如下：

S1：提取染色質(zhì)樣品：挑單菌落，接種于YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，將YPD培養(yǎng)基置于25-30℃下保存，取一只150mL燒瓶，將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋至40-60mL,然后將燒瓶在25-30℃下培養(yǎng)，用終濃度為2％的甲醛交聯(lián)細(xì)胞30-40min，加入終濃度為125mM的甘氨酸，反應(yīng)4-10min，使反應(yīng)猝熄，收集細(xì)胞，用20-30mL的PBS緩沖液清洗菌體1-2次，重懸菌體，取一只15mL的圓錐試管，將菌體重懸于組成的溶液中，加入終濃度為0.20-0.30mg/mL的酵母裂解酶進(jìn)行震蕩，得到原生質(zhì)體，向原生質(zhì)體溶液中加入微球菌核酸酶稀釋，再加入SDS和EDTA終止反應(yīng)，在60-70℃過夜保存，再用氯仿抽取DNA，用無水乙醇沉淀DNA，再加入80-100μl的TE溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

S2：序列特異性探針標(biāo)記染色質(zhì)：先用適量的DNaseI在二價鎂離子存在下，在雙鏈染色質(zhì)上打開單個單鏈缺口，利用DNA聚合酶的核酸外切酶活性在切處將舊鏈從末端逐步切除，同時在DNA聚合酶活性的作用下，順序?qū)⑻禺愋蕴结樳B接到切口的末端氫氧基上，以互補(bǔ)的DNA單鏈為模板合成新的DNA單鏈；

S3：MBD1標(biāo)記染色質(zhì)：將MBD1的甲基化敏感的結(jié)合域MBD被克隆到pET-30b質(zhì)粒，以產(chǎn)生在IPTG誘發(fā)下表達(dá)的His-tag融合蛋白，溶解IPTG誘發(fā)的大腸桿菌，且純化并在鎳柱上再折疊融合蛋白，在純化之后，使用標(biāo)記游離胺的微刻度標(biāo)記試劑盒用Alexa488來標(biāo)記融合蛋白，進(jìn)行三次另外的樹脂純化循環(huán)以更好地將游離標(biāo)記純化掉，用Southwestern槽的印跡來測定所標(biāo)記的MBD探針的完整性，以50ng/μL懸浮在1x的Tris緩沖鹽水中的甲基化的DNA和未甲基化的DNA的混合物中，我們使用TOTO-3來進(jìn)行DNA染色，然后，將約1μg的經(jīng)標(biāo)記的DNA稀釋到包含具有2％牛血清蛋白和0.1％TritonX-100(v/v)的1x的TBS的20μL的緩沖液中，然后，將以280ng/μL儲存的且用AlexaFluor488標(biāo)記的1μL的MBD1的容積添加到DNA以便在摩爾過量的條件下進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)；結(jié)合反應(yīng)在室溫下發(fā)生2-3小時；

S4：染色質(zhì)樣品與通道接觸：將樣品保持在它們相應(yīng)的儲存緩沖液中，直到DNA標(biāo)記和MBD結(jié)合反應(yīng)，在這些反應(yīng)之后，連續(xù)地將樣品稀釋在1x的TBE，89mM的TRIS硼酸鹽和2mM的EDTA，最終的稀釋將樣品懸浮在600pM的估計濃度，標(biāo)稱為對于染色質(zhì)樣品為1-2ng/μL，且對于甲基化的DNA樣品為約0.25ng/μL，緩沖液中的聚合物添加劑用于限制電滲流并防止與流控通道壁的非特異性相互作用而不使得蛋白質(zhì)變性，我們將50μL的樣品溶液加載到流控通道陣列的輸入儲器中，且然后連接到陰極，輸出儲器僅包含緩沖液溶液，且連接到陽極，對于所有的染色質(zhì)樣品，在偏置電壓下，且對于所有的甲基化的DNA樣品，在偏置電壓下，使得樣品在20-30min的預(yù)流時間期間建立穩(wěn)定的電動流動，以確保在數(shù)據(jù)收集之前已經(jīng)實現(xiàn)穩(wěn)態(tài)流條件，檢查每一種樣品達(dá)總計15min，總是使用陣列內(nèi)的相同流控通道，在單分子探測之后，在加載下一個樣品之前，反復(fù)沖洗流控通道陣列達(dá)總計30min，且然后檢查以驗證熒光標(biāo)記的分子的消失；

S5：測試與分析：將所述序列特異性探針標(biāo)記的染色質(zhì)和MBD1標(biāo)記的染色質(zhì)流過通道2，利用光源裝置3照亮所述通道2以產(chǎn)生多個探詢?nèi)莘e，每一個探詢?nèi)莘e由所述通道2的壁和光束限制，探測來自所述多個的相同或不同探詢?nèi)莘e的至少一個標(biāo)記和一個其他標(biāo)記，以產(chǎn)生所述至少一個標(biāo)記和所述至少一個其他標(biāo)記的時間相關(guān)的分辨率，利用激光器7在通道2內(nèi)的溶液中的DNA樣品流動、用高斯形狀的激光剖面照亮樣品和探測表示組蛋白或DNA組分的熒光事件，控制器5被編程為提供來自所述一個或多個探詢?nèi)莘e的所述至少兩種類型的信號的實時的時間相關(guān)的分辨率，由此表征所述物體，顯示屏6其配置成接收來自所述處理器的數(shù)據(jù)和顯示所述數(shù)據(jù)，其中所述數(shù)據(jù)包括關(guān)于來自所述一個或多個探詢?nèi)莘e的所述至少兩種類型的信號的信息。

其中，所述步驟S1中組成的溶液為50mM的TRIS、山梨醇、和10mM的β-巰基乙醇，所述步驟S3中的1x的TBS為50mM晶體氯化氫和138mM氯化鈉和2.7mM氯化鈉。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。