本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及基于磁珠的單增李斯特菌分離方法。
背景技術(shù)：
單增李斯特菌是自然界中普遍存在的一種致病菌，由單增李斯特菌引起的食源性疾病主要有腸胃炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、流產(chǎn)等。常見的單增李斯特菌污染的食品有生肉制品、蔬菜、牛奶、西紅柿等。在加拿大，100個碎牛肉零售樣本中單增李斯特菌的檢出率高達(dá)52％。由于單增李斯特菌在冰箱溫度4℃下仍可生長，使?jié)撛诘奈：π赃M(jìn)一步增大，嚴(yán)重威脅食品安全。因此，建立一種高效、快速檢測單增李斯特菌的新方法顯得尤為迫切。鑒于需要建立一種高效，快速的檢測方法，基于功能化的磁性納米粒子的分離技術(shù)在致病菌監(jiān)測中得到了迅速發(fā)展。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種捕獲效率高、簡便、分離時間短，低梯度磁場下從復(fù)雜基質(zhì)中快速、特異分離目的菌單增李斯特菌的方法。
單增李斯特菌的快速分離方法，包括以下步驟：(1)吸取2ml的磁珠，加入到8mlph＝7.4的滅菌的pbs溶液中，然后在外加磁場的作用下，將對磁珠進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，將洗滌好的磁珠重懸于10ml滅菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl滅菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl滅菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過的磁珠中，活化1h；(3)將活化后磁珠用滅菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml滅菌的pbs溶液中；(4)稱取牛血清白蛋白24mg，溶解到3ml滅菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁珠溶液中，反應(yīng)3h，然后用滅菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml滅菌的pbs溶液中，得到牛血清白蛋白修飾的磁珠；(5)稱取200mg萬古霉素，169.31mgedc和47.98mgnhss，分別溶于滅菌的pbs溶液中，然后混合通過碳化二亞胺法，活化萬古霉素表面羧基，活化10min；(6)將活化后的萬古霉素加入到牛血清白蛋白修飾的磁珠中，孵育6h；(7)反應(yīng)完畢后，用滅菌的pbs洗滌3次，重懸于10ml滅菌的pbs溶液中，得到濃度為2mg/ml的萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物，用于富集單增李斯特菌。(8)取10ml待測樣品溶液，加入0.7mg萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物，置于培養(yǎng)箱上，以200rpm的轉(zhuǎn)速37℃孵育45min；插入磁力架分離3min；(9)磁分離后，無菌pbs溶液清洗后，用無菌的pbs緩沖液混重懸即得富集有單增李斯特菌的單增李斯特菌-萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物。
所述牛血清白蛋白，其分子量為66000da。
所述磁珠粒徑為180nm，表面羧基。
由于牛血清白蛋白表面有多個氨基，故萬古霉素通過羧基與牛血清白蛋白的氨基相連，也可以牛血清白蛋白的氨基與磁珠表面的羧基相連，然后萬古霉素通過五個氫鍵與單增李斯特菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子相連。
具體原理見圖1。
本方法適用于從樣品基質(zhì)中的分離目的菌，特別適用從復(fù)雜基質(zhì)中分離目的菌。食品樣品包括各類新鮮或冷凍加工后的食品材質(zhì)，如新鮮蔬菜、肉類、海鮮類和奶類等產(chǎn)品。樣品處理按照常規(guī)處理方法即可，如將樣品粉碎后制成待測溶液。
采用本發(fā)明技術(shù)方案具有如下有益效果：
1、本發(fā)明采用的是180nm的磁性納米粒子，主要用于基質(zhì)中目標(biāo)菌的快速富集，而現(xiàn)有技術(shù)采用30nm或者50nm納米磁珠結(jié)合樹狀分子的富集方法是用于磁信號的放大。
2、本發(fā)明采用的萬古霉素是傳統(tǒng)的商業(yè)藥物，相比于抗體，具有穩(wěn)定好，成本低，質(zhì)量可控等優(yōu)點?；谏鲜鰞?yōu)點，在單次分離過程中，本發(fā)明構(gòu)建的分離萬古霉素-牛血清白蛋白-磁性納米粒子復(fù)合物在成本上比免疫磁分離陳本降低了195倍；在材料保存方面比免疫磁珠保質(zhì)期也更長。
3、在食品基質(zhì)或者血液中，是多種致病菌共存的環(huán)境。本發(fā)明采用的萬古霉素是廣譜的識別革蘭氏陽性菌的分子識別劑，用于分離基質(zhì)中的革蘭氏陽性菌是一種通用的分離策略，可以將基質(zhì)中的大多數(shù)革蘭氏陽性菌都分離出來，然后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或者選擇性培養(yǎng)進(jìn)行鑒別。相比之下，抗體因其只能專一的識別，從而分離出對應(yīng)的目標(biāo)菌，其他存在于機(jī)制中的致病菌無法鑒別。
4、本發(fā)明合成的萬古霉素-牛血清白蛋白-磁性納米粒子復(fù)合物是先將牛血清白蛋白偶聯(lián)到磁性納米粒子的表面，然后再將萬古霉素修飾到牛血清白蛋白-磁性納米粒子表面，相比于萬古霉素先與牛血清白蛋白偶聯(lián)后，再與結(jié)合多聚賴氨酸(pll)修飾磁性納米粒子的方法，本發(fā)明的萬古霉素-牛血清白蛋白-磁性納米粒子復(fù)合物不僅可以達(dá)更好的分離效率，而且在材料合成中耗時更短時間和成本更低。
5、本發(fā)明將牛血清白蛋白分子先偶聯(lián)在磁性納米粒子表面，然后再將萬古霉素分子偶聯(lián)于牛血清白蛋白包被的磁性納米粒子上，避免了常規(guī)方法中將萬古霉素分子偶聯(lián)于磁珠表面或者直接將萬古霉素分子直接接在磁性納米粒子表面，導(dǎo)致萬古霉素或者萬古霉素分子活性降低和空間位阻大的缺點。同時牛血清白蛋白作為分子臂具有很好的靈活性，有利于萬古霉素分子與單增李斯特菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子相連，提高了捕獲效率。相比于直接偶聯(lián)或者借助萬古霉素分子中氨基作為反應(yīng)基團(tuán)的方法，該方法分離單增李斯特菌能力更強(qiáng)，特別適用于復(fù)雜樣品單增李斯特菌的分離，如食品樣品、全血樣品等。
6、磁性納米粒子偶聯(lián)萬古霉素時，一般采用疏水吸附或化學(xué)偶聯(lián)方式將具有活性的萬古霉素聯(lián)接在磁性納米粒子表面。萬古霉素與磁性納米粒子表面距離太近，磁性納米粒子本身性質(zhì)及其表面殘留的疏水或強(qiáng)親水基團(tuán)容易引起萬古霉素空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致萬古霉素生物活性下降。然而本實驗方案在偶聯(lián)過程中引入牛血清白蛋白分子，其具有一定的空間長度，從而使萬古霉素分子遠(yuǎn)離磁性納米粒子和磁性納米粒子表面，避免了磁性納米粒子本身性質(zhì)及表面對萬古霉素分子的影響。同時，引入牛血清白蛋白卻不會影響萬古霉素分子的空間構(gòu)象，從而起到了保護(hù)萬古霉素分子生物活性的作用。
7、本發(fā)明采用牛血清白蛋白分子，提高磁性納米粒子在溶液的穩(wěn)定性，避免發(fā)生沉淀，增加復(fù)合物的水溶性和生物相容性。
附圖說明
圖1本發(fā)明所涉及的磁分離技術(shù)的操作流程圖；
具體實施方式
為了使本發(fā)明更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
磁珠(180nm)購買于上海奧潤有限公司。
牛血清白蛋白66000da，購自于威海晨源化工新材料有限公司。
萬古霉素分子購自于上海阿拉丁有限公司。
n-羥基丁二酰亞胺nhss，乙基3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽edc等均為常規(guī)試劑，不再贅述。
0.01mpbs配制方法：8.0gnacl、0.2gkcl、0.24gkh2po4、1.44gna2hpo4溶解于800ml蒸餾水中，用5mnaoh調(diào)整ph至7.4，再定容至1000ml即得0.01mpbs。
實施例1
1.萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物，按照如下步驟制備:
(1)取2mg磁珠，懸浮于8ml磷酸緩沖液(pbs，0.01mol/l，ph7.4)中，洗滌3次，加5.8mgedc，溶于290μl滅菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl滅菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過的磁珠中，活化1h；；
(2)稱取牛血清白蛋白24mg，溶解到3ml滅菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁珠溶液中，反應(yīng)2h，然后用滅菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml滅菌的pbs溶液中，得到牛血清白蛋白修飾的磁珠；
(3)稱取200mg萬古霉素，169.31mgedc和47.98mgnhss，分別溶于滅菌的pbs溶液中，然后混合通過碳化二亞胺法，活化萬古霉素表面羧基，活化10min；將活化后的萬古霉素加入到牛血清白蛋白修飾的磁珠中，孵育6h；
(4)反應(yīng)完畢后，用滅菌的pbs洗滌3次，重懸于10ml滅菌的pbs溶液中，得到濃度為2mg/ml的萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物，用于富集單增李斯特菌。
2.富集捕獲：取待測樣品溶液10ml，加入0.7mg萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min形成單增李斯特菌-萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物復(fù)合物；將離心管插入常規(guī)磁力架分離3min；
3.去離子水輕輕清洗后，用pbs緩沖液混重懸即得富集有單增李斯特菌的單增李斯特菌-萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物。
實施例2富集效果實驗
(1)取1ml濃度為105cfu/ml的單增李斯特菌菌于1.5ml無菌離心管中，12000rpm離心5min，棄上清，用等體積無菌pbs溶液重懸。
(2)富集捕獲：分別設(shè)置本發(fā)明技術(shù)方案組：牛血清白蛋白-磁珠組、萬古霉素-磁珠、萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠組富集目的菌。
(3)磁分離后，將上清液倒入無菌離心管中，而分離出來捕獲有單增李斯特菌的萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠則用pbs清洗兩次，混合均勻，并用1ml無菌pbs溶液重懸單增李斯特菌-萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠。
(4)捕獲率計算：將各組富集的目的菌重懸液進(jìn)行梯度稀釋后，用平板對每個梯度計數(shù)，通過捕獲效率公式計算目標(biāo)菌的捕獲效率，每次實驗重復(fù)三次。各組捕獲效率的計算公式如下：[被富集吸附的菌落總數(shù)/(上清液中菌落總數(shù)+被富集吸附的菌落總數(shù))]×100％。
所述各組富集捕獲目的菌的方案如下：
a.本發(fā)明技術(shù)方案組(萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠組)富集捕獲目的菌方案如實施例1，具體如下：
將0.7mg萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物加入到含目標(biāo)菌離心管中，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。將離心管插入常規(guī)磁力架分離3min。
b.萬古霉素-磁珠組富集捕獲目的菌方案具體如下：
將0.7mg制備好的萬古霉素-磁珠加入到含目標(biāo)菌離心管中，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。最后，將離心管插入常規(guī)磁力架分離3min。
所述萬古霉素修飾的磁珠制備：(1)取2ml的磁珠，加入到8mlph＝7.4的無菌的pbs溶液中，然后在外加磁場的作用下，將對磁珠進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，將洗滌好的磁珠重懸于10ml無菌的pbs溶液；(2)5.8mgedc，溶于290μl無菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl無菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過的磁珠中，活化1h；(3)將活化后磁珠用無菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無菌的pbs溶液中；(4)稱取200mg萬古霉素溶于無菌的pbs溶液中，然后活化好的磁珠孵育2h；(7)反應(yīng)完畢后，用無菌的pbs洗滌3次，重懸于10ml無菌的pbs溶液中，得到濃度為2mg/ml的萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物，用于富集單增李斯特菌。
c.牛血清白蛋白-磁珠組
(1)取2ml磁珠，懸浮于8ml磷酸緩沖液(pbs，0.01mol/l，ph7.4)中，洗滌3次，加5.8mgedc，溶于290μl滅菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl滅菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過的磁珠中，活化1h；
(2)稱取牛血清白蛋白24mg，溶解到3ml滅菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁珠溶液中，反應(yīng)2h，然后用滅菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml滅菌的pbs溶液中，得到牛血清白蛋白修飾的磁珠；
(3)磁架回收牛血清白蛋白-磁珠，pbs洗滌三次，10mlpbs(ph＝7.4),得到濃度為2mg/ml的萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物，用于富集單增李斯特菌。
各組捕獲率如下：
實驗結(jié)果表明，萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠組的捕獲效率明顯高于萬古霉素修飾的磁珠組捕獲效率，這說明牛血清白蛋白作為載體分子增加了萬古霉素與目標(biāo)菌的結(jié)合機(jī)會，使得目標(biāo)菌的表面結(jié)合了更多的納米粒子，因此，在短時間內(nèi)就能分離富集較多的目標(biāo)菌。牛血清白蛋白-磁珠組的捕獲效率很低，說明牛血清白蛋白同時也能很好的降低非特異性吸附。通過以上三組實驗數(shù)據(jù)，說明以牛血清白蛋白作為分子，不僅可以提高分離效率，同時也能很好的降低非特異性吸附。說明用萬古霉素分子來捕獲目標(biāo)菌具有良好的效果。
實施例3
無菌果汁為樣品待測樣品溶液，加入單增李斯特菌調(diào)節(jié)菌落濃度至105cfu/ml備用。
將制備好萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠(0.7mg)分別加入到樣品溶液中，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。然后常規(guī)磁力架分離3min。磁分離后，將上清液倒入無菌離心管中，而分離出來捕獲有單增李斯特菌-古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物則用無菌pbs清洗兩次，混合均勻，并用1ml無菌pbs溶液重懸單增李斯特菌-萬古霉素-牛血清白蛋白-磁珠復(fù)合物。捕獲率如實施例2方法獲得，其余同實施例2。結(jié)果見表1，表明本方案能高效富集分離樣品中的單增李斯特菌。
實施例4
無菌牛奶為樣品待測樣品溶液，加入單增李斯特菌調(diào)節(jié)菌落濃度至105cfu/ml。其余同實施例3。
實施例5
無菌飲用水為樣品待測樣品溶液，加入單增李斯特菌調(diào)節(jié)菌落濃度至105cfu/ml。
實施例6
待測樣品為無菌全血，加入單增李斯特菌調(diào)節(jié)菌落濃度至105cfu/ml。其余同實施例3。
表1不同實際樣品中單增李斯特菌分離效果的比較
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。