具有抗咪唑啉酮類除草劑活性的水稻蛋白質(zhì)、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法

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具有抗咪唑啉酮類除草劑活性的水稻蛋白質(zhì)、其編碼基因及應(yīng)用的制造方法與工藝

本發(fā)明屬于抗除草劑蛋白質(zhì)領(lǐng)域，具體涉具有抗咪唑啉酮類除草劑活性的水稻蛋白質(zhì)、其編碼基因及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，雜草在稻田中的危害愈演愈烈。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人力成本的提高，水稻種植方式由費(fèi)人工的插秧逐步向省人工的直播轉(zhuǎn)變，而直播方式的推廣使雜草在田間蔓延，成為影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。尤其是雜草稻，在水稻田不斷自生、延續(xù)，危害水稻生產(chǎn)，是水稻田中僅次于稗草、千金子的第三大惡性雜草。由于雜草稻與栽培稻親緣關(guān)系密切，尚沒有理想的除草劑可以區(qū)別雜草稻和栽培稻，而種植抗除草劑水稻則可以避免這個(gè)問題。

水稻內(nèi)源的抗除草劑乙酰羥基酸合成酶(acetohydroxy acid synthase，簡(jiǎn)稱AHAS)蛋白質(zhì)由ahas基因突變產(chǎn)生，表達(dá)抗除草劑AHAS蛋白質(zhì)可以使植物獲得抗除草劑活性，解決田塊中的雜草問題。AHAS蛋白質(zhì)主要分布在微生物和植物中，在動(dòng)物中幾乎不存在，AHAS抑制除草劑對(duì)人畜無害。因此，發(fā)掘和研究具有抗除草劑活性的水稻AHAS蛋白質(zhì)具有良好的創(chuàng)新性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前，培育抗AHAS抑制除草劑水稻的方法為以水稻種子或者植株為材料進(jìn)行化學(xué)或者物理誘變，進(jìn)行植物體內(nèi)基因組突變。這種方法獲得抗除草劑水稻的試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)(大于3年)，獲得新突變體難，突變結(jié)果為核苷酸單個(gè)堿基變化引起單個(gè)氨基酸的替換，容易與已經(jīng)存在的突變重復(fù)，而且成功幾率小，通常突變成功率小于百萬分之一，很多實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行超過5年的研發(fā)無法獲得新的突變體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供具有抗咪唑啉酮類除草劑活性的水稻蛋白質(zhì)、其編碼基因及應(yīng)用，其為水稻AHAS突變體蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有抗咪唑啉酮類除草劑的活性，其編碼基因轉(zhuǎn)化的植物具有抗咪唑啉酮類除草劑的活性。

與目前通過體內(nèi)突變獲得的氨基酸替換突變體不同，本發(fā)明采用氨基酸刪除策略，通過基因體外突變，改造水稻AHAS蛋白質(zhì)，獲得水稻AHAS突變體蛋白質(zhì)，使其具有抗除草劑活性。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

具有抗咪唑啉酮類除草劑活性的水稻蛋白質(zhì)，其為水稻AHAS突變體蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示。

本發(fā)明所述其氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的抗咪唑啉酮類除草劑活性的蛋白質(zhì)為前體全長(zhǎng)蛋白質(zhì),該前體全長(zhǎng)蛋白質(zhì)刪除信號(hào)肽后成為成熟蛋白質(zhì)，與氨基酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2對(duì)應(yīng)，其成熟氨基酸序列分別如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示。

具有抗咪唑啉酮類除草劑活性的基因，其為編碼所述具有抗抗咪唑啉酮類除草劑活性的水稻蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

進(jìn)一步，所述核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示。

本發(fā)明所述具有抗咪唑啉酮類除草劑活性的水稻蛋白質(zhì)用于培育抗咪唑啉酮類除草劑植物。

一種獲得抗咪唑啉酮類除草劑植物的方法，包括，將所述水稻AHAS突變體蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)化到植物中,使植物產(chǎn)生具有抗除草劑活性的水稻乙酰羥基酸合成酶的突變體蛋白質(zhì)。

進(jìn)一步，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示。

進(jìn)一步，所述咪唑啉酮類除草劑為咪唑乙煙酸、甲氧咪草煙或者甲基咪草煙，但不限于這幾種咪唑啉酮類除草劑。

進(jìn)一步，所述植物為水稻、玉米或棉花，但不限于這幾種植物。

本發(fā)明抗除草劑活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)為水稻(粳稻或秈稻)中經(jīng)過人工改造的AHAS突變體蛋白質(zhì)，源于其基因組中ahas1基因的表達(dá)，將水稻AHAS通過體外突變，獲得AHAS突變體蛋白質(zhì)，其氨基酸序列的特點(diǎn)為：與野生型水稻AHAS蛋白質(zhì)相比，缺失Ser627位點(diǎn)氨基酸，該突變體蛋白質(zhì)對(duì)咪唑啉酮類除草劑具有抗性。

將本發(fā)明獲得的AHAS突變體蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)化到植物中，在植物中進(jìn)行表達(dá)，使植物中含有AHAS突變體蛋白質(zhì)，可使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑的活性。

本發(fā)明的AHAS突變體蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列不限于水稻內(nèi)源序列，可以是表達(dá)所述蛋白質(zhì)的人工合成核苷酸序列。

在水稻、玉米或者棉花中表達(dá)水稻AHAS突變體，得到轉(zhuǎn)基因水稻R-AJM6和R-AIM6、轉(zhuǎn)基因玉米M-AJM6和M-AIM6、轉(zhuǎn)基因棉花C-AJM6和C-AIM6，在轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物苗期噴灑抗咪唑啉酮類除草劑，野生型植物植株全部死亡，轉(zhuǎn)基因植物全部存活。說明表達(dá)本發(fā)明水稻AHAS突變體的植物具有抗咪唑啉酮類除草劑的活性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1)本發(fā)明采用氨基酸刪除策略，對(duì)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，可對(duì)刪除氨基酸后的突變體蛋白質(zhì)進(jìn)行體外抗除草劑活性測(cè)定，為開發(fā)更多新型抗除草劑AHAS突變體蛋白質(zhì)提供基礎(chǔ)，具有操作簡(jiǎn)單，篩選過程簡(jiǎn)單、創(chuàng)新性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)掘了水稻內(nèi)源抗除草劑基因，增加抗除草劑基因的種類

2)本發(fā)明的AHAS突變體蛋白質(zhì)是通過體外突變獲得的，體外突變具有可設(shè)計(jì)性強(qiáng)、試驗(yàn)時(shí)間短、創(chuàng)新性強(qiáng)等體內(nèi)突變無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，獲得突變體時(shí)間小于2個(gè)月，同時(shí)，通過特定的突變?cè)O(shè)計(jì)，避免與已報(bào)道AHAS突變體蛋白質(zhì)重復(fù)。

3)將本發(fā)明AHSA突變體蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)后，獲得的AHAS全長(zhǎng)突變體蛋白質(zhì)和AHAS無信號(hào)肽成熟突變體蛋白質(zhì)均具有抗咪唑啉酮類除草劑的活性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中純化后的AHAS蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖；

其中，泳道1：純化后AJM6S的蛋白質(zhì)；泳道2：純化后的AIM6S蛋白質(zhì)；泳道3：純化后的AJWS蛋白質(zhì)；泳道4：純化后的AIWS蛋白質(zhì)；Mk:蛋白質(zhì)Marker，分子量已在圖上標(biāo)出。

圖2和圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中AJM6S和AIM6S及其對(duì)照AJWS和AIWS對(duì)咪唑啉酮類除草劑(咪唑乙煙酸和甲氧咪草煙)的抗性曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

以下實(shí)施例中，如無特殊說明為《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，2002年)所記載方法。

引物合成和測(cè)序委托生工上海生物工程股份有限公司進(jìn)行，試劑、菌株、載體等實(shí)驗(yàn)用品從杭州西格瑪生物技術(shù)公司購(gòu)買。

咪唑煙乙酸除草劑為山東先達(dá)公司的“豆說好”，稀釋濃度為稀釋200倍。甲基咪草煙除草劑為德國(guó)巴斯夫公司的“百壟通”，稀釋濃度為稀釋1000倍。甲氧咪草煙除草劑為美國(guó)氰胺公司的“金豆”，稀釋濃度為稀釋100倍。

實(shí)施例1獲得水稻(粳稻及秈稻)內(nèi)源乙酰乳酸合成酶突變體蛋白質(zhì)，包括以下步驟：

1.利用粳稻構(gòu)建刪除Ser627氨基酸的ahas基因

(1)通過多聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法，從粳稻基因組中擴(kuò)增出ahas基因ajw(NCBI序列號(hào)：NC_029257.1)。

其中，進(jìn)行PCR反應(yīng)使用的引物為：

RA1F：5'atggctacgaccgccgcggc；

RA1R：5'ttaatacacagtcctgccatcacca。

PCR反應(yīng)體系為：2×高保真聚合酶預(yù)混液50μl、引物RA1F(10μM)4μl、引物RA1R(10μM)4μl、野生型水稻基因組DNA 1μl和去離子水41μl，總體積為100μl。

PCR程序：a)95℃，10分鐘；b)95℃，40秒；c)52℃，40秒；d)68℃，2分鐘；e)循環(huán)步驟2-4，25次；f)68℃，10分鐘；g)16℃，保存。

(2)通過瓊脂糖電泳分離、純化出PCR產(chǎn)物，即ajw基因片段，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆(pGEMT，美國(guó)Promega公司)，獲得T-AJW。

(3)以T-AJW為模板，使用引物OsA627F和OsA627R，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，獲得刪除Ser627氨基酸的突變體克隆T-AJM6。

其中，PCR反應(yīng)體系和程序中，除模板和引物外其它條件與步驟1(1)相同。

引物的具體序列為：

OsA627F：5'gcatgtgctgcctatgatcccagggggcgcattcaaggacatg；

OsA627R：5'catgtccttgaatgcccccctgggatcataggcagcacatgc。

其中，AJM6的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.利用秈稻構(gòu)建刪除Ser627氨基酸的ahas基因：

使用與上述利用粳稻構(gòu)建刪除Ser627氨基酸的ahas基因時(shí)所使用的引物及實(shí)驗(yàn)過程。通過PCR方法，使用引物RA1F和RA1R從秈稻基因組中擴(kuò)增出ahas基因aiw(NCBI序列號(hào)：EU548084)，獲得T-AIW，再以T-AIW為模板，使用引物OsA627F和OsA627R，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，獲得刪除Ser627氨基酸的突變體克隆T-AIM6，其中，AIM6的DNA序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.表達(dá)、純化刪除信號(hào)肽的AHAS成熟蛋白質(zhì)

(1)以上述步驟1(2)中獲得的T-AJW為模板，使用引物OsABam和OsAEco進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，獲得刪除信號(hào)肽的粳稻克隆T-AJWS。

其中，PCR反應(yīng)體系和程序中，除模板和引物外其它條件與上述步驟1(1)相同，引物的具體序列為：

OsABam：5'ggatccacgccgctccggccgtgggggcc；

OsAEco：5'gaattcttaatacatagtcctgccatcac。

(2)構(gòu)建蛋白質(zhì)表達(dá)載體，將AJWS克隆入pGEX4T2，獲得表達(dá)無信號(hào)肽的AHAS野生型蛋白質(zhì)的載體4T2-AJWS。

(3)將表達(dá)無信號(hào)肽的AHAS野生型蛋白質(zhì)的載體4T2-RA1WS轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Rosetta中，培養(yǎng)、收獲細(xì)胞，超聲波破碎細(xì)胞，將離心獲得上清液通過GST柱，清洗GST柱，洗脫，獲得成熟的粳稻野生型蛋白質(zhì)AJWS。

用與上述步驟3(1)-(3)同樣的方法，以T-AIW為模板，使用引物OsABam和OsAEco，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，構(gòu)建蛋白質(zhì)表達(dá)載體，獲得無信號(hào)肽的秈稻野生型AHAS蛋白質(zhì)的載體4T2-AIWS，再通過表達(dá)菌株Rosetta進(jìn)行表達(dá)，獲得無信號(hào)肽的成熟秈稻野生型蛋白質(zhì)AIWS。

用與上述步驟3(1)-2(3)同樣的方法，以T-AJM6為模板，使用引物OsABam和OsAEco，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，構(gòu)建蛋白質(zhì)表達(dá)載體，獲得無信號(hào)肽而且刪除Ser627氨基酸的表達(dá)成熟粳稻AHAS突變體蛋白質(zhì)的載體4T2-AJM6S，再通過表達(dá)菌株Rosetta進(jìn)行表達(dá)，獲得無信號(hào)肽而且刪除Ser627氨基酸的成熟粳稻AHAS突變體蛋白質(zhì)AJM6S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，DNA序列如SEQ ID NO.7所示。

用與上述步驟3(1)-(3)同樣的方法，以T-AIM6為模板，使用引物OsABam和OsAEco，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T克隆，構(gòu)建蛋白質(zhì)表達(dá)載體，獲得無信號(hào)肽且刪除Ser627氨基酸的表達(dá)成熟秈稻AHAS突變體蛋白質(zhì)的載體4T2-AIM6S，再通過表達(dá)菌株Rosetta進(jìn)行表達(dá)，獲得無信號(hào)肽且刪除Ser627氨基酸的成熟秈稻AHAS突變體蛋白質(zhì)AIM6S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，DNA序列如SEQ ID NO.8所示。

將獲得的野生型蛋白質(zhì)AJWS、AIWS和成熟的AHAS突變體蛋白質(zhì)AJM6S、AIM6S進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，獲得蛋白質(zhì)膠，蛋白質(zhì)膠參見圖1。

由圖1可見，泳道1至泳道4中的AHAS蛋白質(zhì)在90kDa位置具有明顯條帶，此位置與蛋白質(zhì)的理論大小相符，同時(shí)，該蛋白質(zhì)條帶在整個(gè)泳道的蛋白質(zhì)條帶中占主要比例，說明獲得了高純度的AHAS蛋白質(zhì)。

實(shí)施例2檢測(cè)AHAS突變體蛋白質(zhì)對(duì)除草劑的抗性

分別以實(shí)施例1獲得的變體蛋白質(zhì)AJM6S和AIM6S、野生型蛋白質(zhì)AJWS和AIWS為檢測(cè)主體，水為空白對(duì)照處理，以濃度在0-100μM的不同品種除草劑(咪唑煙乙酸和甲氧咪草煙)為影響因素，進(jìn)行抗除草劑生物測(cè)定。

在2ml離心管中配置溶液反應(yīng)體系：450μl測(cè)定緩沖液，10μl AHAS蛋白質(zhì)(AJM6S、AIM6S、AJWS或AIWS，0.5μg/μl)，40μl影響因素溶液(水為空白對(duì)照處理，除草劑為影響因素)，總體積500μl。

AHAS活性測(cè)定緩沖液：100mM丙酮酸鈉，10mM氯化鎂，1mM TPP，50μM FAD，50mM磷酸鹽，pH7.4。

反應(yīng)程序：將含有不同影響因素反應(yīng)體系的離心管置于37℃反應(yīng)1小時(shí)；20μl30％硫酸終止反應(yīng)，60℃反應(yīng)0.5小時(shí)，加入250μl 1.7％α-萘酚，0.17％肌酸，60℃顯色0.5小時(shí)。從離心管中取出200μl，檢測(cè)含有不同影響因素的溶液在525nm吸光度值。

檢測(cè)結(jié)果：以除草劑濃度為0(影響因素溶液為水對(duì)照)的野生型蛋白質(zhì)AJWS處理的525nm吸光度值為100％活性，計(jì)算野生型和突變體蛋白質(zhì)在不同影響因素條件下的活性比例，繪制曲線圖，結(jié)果參見圖2-圖3。

由圖2-圖3可見，隨著咪唑啉酮類除草劑的增加，野生型蛋白質(zhì)AJWS、AIWS的活性降低至0；而突變體蛋白質(zhì)AJM6S、AIM6S的活性在高濃度除草劑中依然保持接近100％活性。

因此，本發(fā)明的突變體蛋白質(zhì)AJM6S和AIM6S對(duì)咪唑啉酮類除草劑具有抗性。

實(shí)施例3水稻ahas突變體基因在植物中的轉(zhuǎn)化及表達(dá)

1.構(gòu)建AHAS突變體蛋白質(zhì)的表達(dá)元件

為了在單子葉及雙子葉植物中表達(dá)AHAS突變體蛋白質(zhì)，以pCambia 1300載體(簡(jiǎn)稱1300)為載體，用辣椒斑駁病毒35S(簡(jiǎn)稱35S)啟動(dòng)子和終止子構(gòu)建AHAS表達(dá)元件，35S啟動(dòng)子和終止子DNA序列見http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pCAMBIA1300/，具體步驟如下：

(1)以實(shí)施例1獲得的T-AJM6為模板，使用引物RABam2和RASac，通過PCR和BamH1/Sac1雙酶切，獲得ahas突變體片段AJM6T。

其中，引物序列為：

RABam2：5'gtgggatccatggctacgaccgccgcggc；

RASac：5'gtggagctcttaatacatagtcctgccatcac。

(2)以1300載體為模板，使用引物35S-Hind和35S-Bam，通過PCR和BamH1/Hind3雙酶切，獲得啟動(dòng)子片段35S；

其中，引物序列為：

35S-Hind：5'gcgaagcttcatggagtcaaagattcaaa；

35S-Bam：5'gtgggatccagtcccccgtgttctct ccaaatgaa。

(3)以1300載體為模板，使用引物ter-Sac和ter-Kpn，通過PCR和BamH1/Hind3雙酶切，獲得終止子片段ter；

其中，引物序列為：

ter-Sac：5’gtggagctcagtagatgccgaccg gatctgt；

ter-Kpn：5'cagggtacccgccgaattaattcggggga。

(4)將1300進(jìn)行HindIII/SacI雙酶切，獲得片段1300HS，與35S和AJM6T進(jìn)行連接、克隆，獲得1300-35S-AJM6。

(5)將1300-35S-AJM6進(jìn)行SacI/KpnI雙酶切，與ter連接、克隆，獲得表達(dá)粳稻AHAS突變體的載體1300-AJM6。

同理，以T-AIM6為模板，通過與本實(shí)施例步驟1(1)-(5)相同步驟和引物，獲得表達(dá)粳稻AHAS突變體的載體1300-AIM6。

(6)將獲得的載體1300-AJM6和載體1300-AIM6分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4044中，獲得表達(dá)AHAS突變體蛋白質(zhì)的植物轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。

2.獲得表達(dá)AHAS突變體蛋白質(zhì)的植物

轉(zhuǎn)基因植物的獲得方法為現(xiàn)有成熟技術(shù)，轉(zhuǎn)基因植物制備委托上海博祈生物科技有限公司進(jìn)行。

使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將載體1300-AJM6和1300-AIM6分別轉(zhuǎn)入水稻、玉米和棉花中，獲得轉(zhuǎn)基因水稻R-AJM6和R-AIM6、轉(zhuǎn)基因玉米M-AJM6和M-AIM6、轉(zhuǎn)基因棉花C-AJM6和C-AIM6。

在所獲得的轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因水稻R-AJM6和R-AIM6、轉(zhuǎn)基因玉米M-AJM6和M-AIM6、轉(zhuǎn)基因棉花C-AJM6和C-AIM6和對(duì)應(yīng)野生型植物的苗期噴除草劑，十天后，統(tǒng)計(jì)死亡率，結(jié)果參見表1。

表1

由表1可知，野生型植物植株全部死亡，而轉(zhuǎn)基因植物全部存活，說明表達(dá)本發(fā)明的水稻AHAS突變體蛋白質(zhì)的植物具有抗咪唑啉酮類除草劑活性。

<110> 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 具有抗咪唑啉酮類除草劑活性的水稻蛋白質(zhì)、其編碼基因及應(yīng)用

<130> 1711037

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> SEQ ID NO.1

<211> 643

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa L. spp. japanica）

<400> 1

Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro

20 25 30

Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser

35 40 45

Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro

50 55 60

Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala

65 70 75 80

Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala

85 90 95

Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn

100 105 110

His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr

115 120 125

Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro

130 135 140

Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser

145 150 155 160

Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly

165 170 175

Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile

180 185 190

Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val

195 200 205

Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val

210 215 220

Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val

225 230 235 240

Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys

245 250 255

Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu

260 265 270

Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly

275 280 285

Asp Glu Leu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr

290 295 300

Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu

305 310 315 320

Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp

325 330 335

Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val

340 345 350

Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile

355 360 365

Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser

370 375 380

Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu

385 390 395 400

Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn

405 410 415

Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe

420 425 430

Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu

435 440 445

Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met

450 455 460

Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser

465 470 475 480

Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly

485 490 495

Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp

500 505 510

Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu

515 520 525

Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met

530 535 540

Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr

545 550 555 560

Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val

565 570 575

Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys

580 585 590

Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro

595 600 605

Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met

610 615 620

Ile Pro Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly Arg

625 630 635 640

Thr Val Tyr

<210> SEQ ID NO.2

<211> 643

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa L. spp. japanica）

<400> 2

Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Ser Ala Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro

20 25 30

Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser

35 40 45

Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro

50 55 60

Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala

65 70 75 80

Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala

85 90 95

Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn

100 105 110

His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr

115 120 125

Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro

130 135 140

Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser

145 150 155 160

Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly

165 170 175

Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile

180 185 190

Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val

195 200 205

Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val

210 215 220

Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val

225 230 235 240

Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys

245 250 255

Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu

260 265 270

Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly

275 280 285

Asp Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr

290 295 300

Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu

305 310 315 320

Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp

325 330 335

Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val

340 345 350

Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile

355 360 365

Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser

370 375 380

Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu

385 390 395 400

Asp Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn

405 410 415

Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe

420 425 430

Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu

435 440 445

Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met

450 455 460

Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser

465 470 475 480

Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly

485 490 495

Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp

500 505 510

Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu

515 520 525

Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met

530 535 540

Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr

545 550 555 560

Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val

565 570 575

Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys

580 585 590

Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro

595 600 605

Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met

610 615 620

Ile Pro Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly Arg

625 630 635 640

Thr Val Tyr

<210> SEQ ID NO.3

<211> 1932

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L. spp. japanica）

<400> 3

atggctacga ccgccgcggc cgcggccgcc gccctgtccg ccgccgcgac ggccaagacc 60

ggccgtaaga accaccagcg acaccacgtc cttcccgctc gaggccgggt gggggcggcg 120

gcggtcaggt gctcggcggt gtccccggtc accccgccgt ccccggcgcc gccggccacg 180

ccgctccggc cgtgggggcc ggccgagccc cgcaagggcg cggacatcct cgtggaggcg 240

ctggagcggt gcggcgtcag cgacgtgttc gcctacccgg gcggcgcgtc catggagatc 300

caccaggcgc tgacgcgctc cccggtcatc accaaccacc tcttccgcca cgagcagggc 360

gaggcgttcg cggcgtccgg gtacgcgcgc gcgtccggcc gcgtcggggt ctgcgtcgcc 420

acctccggcc ccggggcaac caacctcgtg tccgcgctcg ccgacgcgct gctcgactcc 480

gtcccgatgg tcgccatcac gggccaggtc ccccgccgca tgatcggcac cgacgccttc 540

caggagacgc ccatagtcga ggtcacccgc tccatcacca agcacaatta ccttgtcctt 600

gatgtggagg acatcccccg cgtcatacag gaagccttct tcctcgcgtc ctcgggccgt 660

cctggcccgg tgctggtcga catccccaag gacatccagc agcagatggc cgtgccggtc 720

tgggacacct cgatgaatct accagggtac atcgcacgcc tgcccaagcc acccgcgaca 780

gaattgcttg agcaggtctt gcgtctggtt ggcgagtcac ggcgcccgat tctctatgtc 840

ggtggtggct gctctgcatc tggtgacgaa ttgcgctggt ttgttgagct gactggtatc 900

ccagttacaa ccactctgat gggcctcggc aatttcccca gtgacgaccc gttgtccctg 960

cgcatgcttg ggatgcatgg cacggtgtac gcaaattatg ccgtggataa ggctgacctg 1020

ttgcttgcgt ttggtgtgcg gtttgatgat cgtgtgacag ggaaaattga ggcttttgca 1080

agcagggcca agattgtgca cattgacatt gatccagcag agattggaaa gaacaagcaa 1140

ccacatgtgt caatttgcgc agatgttaag cttgctttac agggcttgaa tgctctgcta 1200

caacagagca caacaaagac aagttctgat tttagtgcat ggcacaatga gttggaccag 1260

cagaagaggg agtttcctct ggggtacaaa acttttggtg aagagatccc accgcaatat 1320

gccattcagg tgctggatga gctgacgaaa ggtgaggcaa tcatcgctac tggtgttggg 1380

cagcaccaga tgtgggcggc acaatattac acctacaagc ggccacggca gtggctgtct 1440

tcggctggtc tgggcgcaat gggatttggg ctgcctgctg cagctggtgc ttctgtggct 1500

aacccaggtg tcacagttgt tgatattgat ggggatggta gcttcctcat gaacattcag 1560

gagctggcat tgatccgcat tgagaacctc cctgtgaagg tgatggtgtt gaacaaccaa 1620

catttgggta tggtggtgca atgggaggat aggttttaca aggcgaatag ggcgcataca 1680

tacttgggca acccggaatg tgagagcgag atatatccag attttgtgac tattgctaag 1740

gggttcaata ttcctgcagt ccgtgtaaca aagaagagtg aagtccgtgc cgccatcaag 1800

aagatgctcg agactccagg gccatacttg ttggatatca tcgtcccgca ccaggagcat 1860

gtgctgccta tgatcccagg gggcgcattc aaggacatga tcctggatgg tgatggcagg 1920

actgtgtatt aa 1932

<210> SEQ ID NO.4

<211> 1932

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L. spp. japanica）

<400> 4

atggctacga ccgccgcggc cgcggccgcc accttgtccg ccgccgcgac ggccaagacc 60