本發(fā)明屬于化學藥物領域，涉及一種Bola型三氮唑核苷化合物，還涉及其制備方法和應用。

背景技術：

核苷類似物是一類重要的抗病毒和抗癌藥物。它們具有與天然核苷類似的結構，并能夠模擬天然核苷，參與病毒和癌細胞的DNA/RNA合成，或與病毒和癌細胞中某些酶相互作用，從而達到抑制病毒復制和癌細胞生長的目的。人們通過對核苷的核糖部分或者堿基部分進行修飾，得到了各種具有抗病毒和抗癌活性的核苷藥物，如利巴韋林(ribavirin)、拉米夫定(Lamivudine)、吉西他濱(gemcitabine)、5-氟尿苷(floxuridine)和阿糖胞苷(cytarabine)等。其中利巴韋林作為核苷類藥物的杰出代表，具有廣譜抗病毒性質，對多種DNA病毒和RNA病毒都有很好的抑制作用，是目前治療丙型肝炎病毒感染(Hepatitis C Virus，HCV)的唯一小分子藥物，同時在近期也被證實可作為抗癌藥物治療急性骨髓性白血病。和常見的核苷類似物不同，利巴韋林是以非天然的雜環(huán)－1,2,4-三氮唑取代了天然核苷的堿基部分，這種特殊結構的優(yōu)勢在于不易被體內的核苷/核酸代謝酶識別，因而該類化合物在體內有更好的代謝穩(wěn)定性，同時三氮唑作為一種通用的堿基，有著介于嘌呤和嘧啶堿之間的特殊幾何構型以及廣泛的氫鍵結合能力。另外值得一提的是以利巴韋林為例，三氮唑核苷不僅具有抗病毒活性，同時也能調節(jié)生物體系的免疫反應，這為我們發(fā)展出同時具有抗代謝和調節(jié)免疫反應的藥物先導用于抗癌和抗病毒治療提供了研究基礎。近年來，為了進一步增加該類分子的芳基結合平面，從而提高其與生物靶標分子的結合能力，研究者們嘗試向三氮唑核苷的堿基上引入芳香基團，得到新的芳基三氮唑核苷類似物并將其作為藥物先導廣泛應用于各種病毒和癌癥相關疾病的治療。但是和大多數(shù)核苷類似物一樣，三氮唑核苷化合物也面臨水溶性差和起效劑量大的問題，使得其進入臨床研究的可能性受到影響，這也是目前發(fā)展該類化合物作為藥物先導中一個待以解決的難題。另外，作為小分子藥物，在癌癥治療中對正常組織和腫瘤缺乏選擇性，難以真正作用于病變部位也是制約該類藥物療效，并導致藥物毒副作用的根本原因。因此發(fā)展水溶性的新型三氮唑核苷衍生物，并基于其結構通過小分子自組裝將其轉化為納米藥物是改善這類化合物的物理化學性質，并增強其靶向病灶組織的能力，從而減少對正常組織和細胞傷害的重要途徑。

Bola型的兩親分子是將兩個極性頭基用疏水鏈連接起來，這種特殊結構賦予了Bola型分子獨特的性質，如在質膜中具有更好的穩(wěn)定性和兼容性等。目前Bola型兩親分子被廣泛應用于表面活性劑，其自組裝形成的囊泡結構也被作為一種理想的載體用于藥物傳遞。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種Bola型三氮唑核苷化合物及其制備方法和應用。

為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種Bola型三氮唑核苷化合物，結構如通式I所示：

式中：

R₁為其中R₅和R₆各自獨立為-H，-OH，-NH₂，-NHCH₃，-N(CH₃)₂或氨基酸其中的一種，R₇為-OH，-NH₂，-NHCH₃，-N(CH₃)₂或氨基酸其中的一種；

R₂為-H，-Cl，-Br，-I或-Ar；

R3為-CH₂-或-O-；

R₄為-CH₂-，-S-S-，

n獨立地表示等于2～10的整數(shù)。

如通式I化合物的納米顆粒，取通式I化合物加水，超聲溶解后用0.45μm濾膜過濾得Bola型三氮唑核苷化合物納米顆粒。

如通式I化合物的制備方法：按摩爾比為1：2～10分別取通式II化合物和通式III化合物反應得到通式I所示Bola型三氮唑核苷化合物；

通式II所示化合物中X為-CH₂-，-S-S-，Y為炔基或羥基；n為2～10整數(shù)；

通式III所示化合物中R₁為其中R₅和R₆各自獨立為-H，-OH，-NH₂，-NHCH₃，-N(CH₃)₂或氨基酸其中的一種，R₇為-OH，-NH₂，-NHCH₃，-N(CH₃)₂或氨基酸其中的一種；R₂為-H，-Cl，-Br，-I或-Ar；R₈為-N₃或-Br。

進一步，當通式II中Y為炔基，通式III中R₈為疊氮基時，如通式1化合物制備方法為：按摩爾比為1：2～10分別取通式II化合物和通式III化合物混合后用體積比為1:1～5四氫呋喃和水的混合溶劑溶解，再加入抗壞血酸鈉溶液和五水硫酸銅溶液，80℃下反應0.5～6小時，旋干溶劑，柱層析分離得通式I所示Bola型三氮唑核苷化合物。

進一步，當通式II中Y為炔基，通式III中R₈為-Br時，如通式1化合物制備方法為：按摩爾比為1：2～10分別取通式II化合物和通式III化合物混合后用體積比為1:1～5二氧六環(huán)和水的混合溶劑溶解，再加入四三苯基膦鈀、碘化亞銅和碳酸鋰，100℃微波反應15～60分鐘，旋干溶劑后柱層析分離，分離產物在氫氣作用下還原得到通式I所示Bola型三氮唑核苷化合物，所述四三苯基膦鈀、碘化亞銅、碳酸鋰和通式III化合物的摩爾比為1:1:40:20。

進一步，當通式II中Y為羥基，通式III中R₈為-Br時，如通式I化合物制備方法為：按摩爾比為1：2～10分別取通式II化合物和通式III化合物混合后用二甲基甲酰胺作溶劑，再加入Cs2CO3，攪拌8～24小時，旋干溶劑柱層析得到通式I所示Bola型三氮唑核苷化合物，所述Cs₂CO₃和通式III化合物的摩爾比為3:1。

進一步，所述通式II化合物碳鏈上的H原子可替換為F原子。

通式I所示Bola型三氮唑核苷化合物或通式I所示Bola型三氮唑核苷化合物納米顆粒在抑制細胞生長藥物的應用。

進一步，所述細胞為癌細胞。

進一步，所述癌細胞為前列腺癌細胞PC-3、肝癌細胞HepG2、宮頸癌細胞Hela、卵巢癌細胞SKOV3、胰腺癌細胞BxPC-3和Panc-1。

本發(fā)明的有益效果在于：基于三氮唑核苷利巴韋林進行結構優(yōu)化所制備的bola型三氮唑核苷化合物均具有抑制癌細胞增殖的活性。且在相同濃度下，這一類化合物的抑制癌細胞增殖的活性均優(yōu)于利巴韋林，其中化合物I-1對所有癌細胞增殖的抑制效果都遠優(yōu)于相應的臨床用藥。化合物I-2在相同濃度下與臨床用藥多西紫杉醇對前列腺癌PC-3細胞的抑制效果相當，比肝癌臨床用藥五氟尿嘧啶對HepG2細胞的抑制效果要好，比宮頸癌臨床用藥順鉑對Hela細胞的抑制效果要好，也比胰腺癌臨床用藥吉西他濱對BxPC-3和Panc-1細胞的抑制效果要好?；衔颕-3在相同濃度下與臨床用藥多西紫杉醇對前列腺癌PC-3細胞的抑制效果相當，比肝癌臨床用藥五氟尿嘧啶對HepG2細胞的抑制效果要好，也比胰腺癌臨床用藥吉西他濱對BxPC-3和Panc-1細胞的抑制效果要好。因此本發(fā)明提供一類新型的抗腫瘤藥物先導。同時這類化合物有在水溶液中自組裝形成納米尺度顆粒的能力，也使其能因為實體瘤的高通透性和滯留效應(Enhanced Permeability and Retention effect，EPR)更易聚集在腫瘤組織內部實現(xiàn)靶向給藥，同時作為納米藥物載體還可以包封其他小分子藥物而達到聯(lián)合用藥的效果。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明：

圖1為動態(tài)光散射表征本發(fā)明化合物I-1自組裝形成的納米尺度的顆粒；

圖2為本發(fā)明化合物I-1～I-3隨濃度升高對前列腺癌PC-3細胞增殖的抑制能力；

圖3為本發(fā)明化合物I-1～I-3隨濃度升高對肝癌細胞HepG2增殖的抑制能力；

圖4為本發(fā)明化合物I-1～I-3隨濃度升高對胰腺癌細胞Panc-1增殖的抑制能力；

圖5為本發(fā)明化合物I-1和I-2隨濃度升高對胰腺癌細胞BxPC-3增殖的抑制能力；

圖6為本發(fā)明化合物I-1和I-2隨濃度升高對宮頸癌Hela細胞增殖的抑制能力；

圖7為本發(fā)明化合物I-1隨濃度升高對卵巢癌SKOV3細胞增殖的抑制能力。

具體實施方式

下面將結合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。

實施例1

反應中間體II-1的制備

將3.3mL II-1a(1,8-二溴辛烷)溶解在3mL二甲基甲酰胺中，滴加含1.6g乙炔鈉的二甲苯溶液，反應24小時后過濾反應液，旋干溶劑，減壓蒸餾，得產物II-1b。在圓底燒瓶中分別加入630mg化合物II-1b和660mg硫代乙酸鉀，加DMF作溶劑，室溫下反應4小時后旋干溶劑，加入二氯甲烷和水后分離有機層，旋干溶劑后經柱層析分離，得化合物II-1c。將100mg化合物A3溶解于DMF，室溫下滴加80μL水合肼，再滴加100μL乙酸，室溫下反應30分鐘后加入水和乙酸乙酯萃取，有機相經無水硫酸鈉干燥，旋干溶劑，得化合物II-1d。II-1d與2,6-二氟苯甲醛混合后加入二氯甲烷溶解，再在反應體系中滴加三氟化硼的乙醚溶液，0℃下反應1小時后，反應液用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，旋干溶劑后分離得到化合物II-1。

II-1:¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.23-7.18(m,1H),6.89(t,J＝8Hz,2H),5.15(s,1H),2.63(t,J＝8Hz,4H),2.19-2.15(m,4H),1.94(s,2H),1.62-1.56(m,4H),1.54-1.47(m,4H),1.43-1.27(m,16H).

實施例2

反應中間體II-2的制備

將75mg化合物II-1b和9.5mg磷酸鉀溶解在5mL乙腈中，通入氧氣，室溫下反應5h。旋干溶劑，柱層析分離，得化合物II-2，產率77.8％。

II-2：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ2.68(t,J＝8Hz,4H),2.18(t,J＝4Hz,4H),1.94(s,2H),1.71-1.63(m,4H),1.56-1.50(m,4H),1.39-1.31(m,16H).

實施例3

反應中間體II-3的制備

將5.1mL三甲基硅基乙炔溶解在45mL四氫呋喃中，在-78℃下滴加23.2mL丁基鋰。15分鐘后，加入28mL DMPU，在-78℃下攪拌1小時。隨后加入2.8g化合物II-3a的四氫呋喃溶液2mL，在室溫下反應過夜。反應液用1N的鹽酸調節(jié)pH值至1-2，并用乙酸乙酯萃取3次。合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干溶劑，柱層析分離得化合物II-3b。將1.6g化合物II-3b溶解在TBAF的四氫呋喃溶液中，在室溫下反應3h。用氯化銨溶液淬滅反應，并用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干溶劑，柱層析分離得化合物II-3c。將1.0g化合物II-3c溶解在2mL四氫呋喃中，在0℃下滴加1.13g氫化鋰鋁的四氫呋喃懸浮液30mL，在室溫下反應3h。用氯化銨溶液淬滅反應，過濾，濃縮濾液，柱層析分離得化合物II-3d-1。另將將3.84g PCC和0.145g乙酸鈉溶解在15mL二氯甲烷中，在0℃下加入1.5g化合物II-3d-1，在室溫下反應6小時。旋干溶劑，柱層析分離得化合物II-3e-1。將1.0g化合物II-3c溶解在8.6mL乙醇中，加入0.1mL濃硫酸，回流反應6小時。反應液用乙醚萃取3次，合并有機相，旋干溶劑，柱層析分離得化合物II-3d-2。將168mg化合物II-3d-2和1.1mmol水合肼溶解在50mL乙醇中，回流反應6小時。冷卻至室溫，放置過夜，收集固體，用乙醇重結晶得化合物II-3e-2。將138mg化合物II-3e-1和184mg化合物II-3e-2溶解在5mL乙醇中，加入0.2mL乙酸，回流反應2小時。柱層析分離得化合物II-3。

實施例4

反應中間體III-1的制備

在圓底燒瓶中加入86mg化合物III-1a，360mg對甲苯磺酰氯，6mg 4-二甲氨基吡啶和0.3mL三乙胺，然后加入二氯甲烷使之溶解。室溫下反應3小時，旋干溶劑后柱層析分離，得化合物III-1b。140mg化合物III-1b和360mg溴化鋰混合后，加入丙酮使之溶解。回流反應3小時后，旋干溶劑，柱層析分離得化合物III-1c。100mg化合物III-1c和450mg二甲胺水溶液混合后，再加入DMF使之溶解。在室溫下反過夜，旋干溶劑后分離得到化合物III-1。III-1：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.71(s,1H),5.46(s,2H),3.58(t,J＝4Hz,2H),2.46(t,J＝4Hz,2H),2.18(s,6H).

實施例5

反應中間體III-2的制備

將600mg化合物III-2a溶解在4mL含有216mg NaOH的水溶液中，加入0.3mL液溴，緩慢升溫至100℃，保溫反應20小時。冷卻至室溫，用飽和NaHSO₃溶液淬滅，用乙醚萃取后合并有機相，無水硫酸鈉干燥。旋干溶劑，得877mg化合物III-2b。在圓底燒瓶中分別加入190mg化合物III-2b，440mg乙酰基保護的2-(羥基甲氧基)乙醇，2mg水合對甲苯磺酸，140℃下反應1h。柱層析分離，得化合物III-2c。在980mg的化合物III-2c中加入25mL飽和氨的甲醇溶液，室溫下反應48小時。旋干溶劑，柱層析分離，得化合物化合物III-2。

III-2:1H NMR(400MHz,CDCl₃):δ5.48(s,2H),3.75(t,J＝4Hz,2H),3.73(t,J＝4Hz,2H).

實施例6

反應中間體III-3的制備

將200mg化合物III-1溶解在5mL甲醇中，在鈀碳/氫氣的條件下，攪拌2小時，過濾，旋干溶劑，得到化合物III-3a。將100mg化合物III-3a溶解在5mL的20％硫酸溶液中，在0℃下滴加含有37mg NaNO₂的水溶液0.4mL，0℃下反應30分鐘后，再滴加含有80mg CuBr的水溶液，室溫下反應2小時。然后用乙酸乙酯萃取并合并有機相，無水硫酸鈉干燥以后，旋干溶劑，柱層析分離得化合物III-3。

實施例7

化合物I-1的制備

65mg化合物II-1和60mg化合物III-1混合后用體積比為1:2的四氫呋喃和水的混合溶劑溶解，再加入抗壞血酸鈉溶液0.2mL和五水硫酸銅溶液0.2mL，80℃下反應2小時。旋干溶劑，柱層析分離，得化合物82mg化合物I-1。

I-1：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.94(s,2H),8.43(s,2H),7.42-7.35(m,1H),7.10(t,J＝8Hz,2H),5.61(s,4H),5.17(s,1H),3.63(t,J＝4Hz,4H),3.69(t,J＝8Hz,4H),2.65-2.55(m,4H),2.50(s,12H),2.39(t,J＝4Hz,4H),1.67-1.60(m,4H),1.54-1.47(m,4H),1.29-1.24(m,16H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO):δ155.60,148.17,147.14,130.43,121.48,118.11,112.56,112.35,78.69,67.77,58.31,45.83,42.15,33.19,29.09,29.03,28.98,28.86,28.81,28.40,25.10；MS(ESI)m/z:887.64[M+H].

實施例8

化合物I-2的制備

120mg化合物II-1和136mg化合物III-2混合后用體積比為1:2的四氫呋喃和水的混合溶劑溶解，再加入抗壞血酸鈉溶液0.2mL和五水硫酸銅溶液0.2mL，80℃下反應2小時。旋干溶劑，柱層析分離得146mg化合物I-2。

I-2：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.99(s,2H),7.23-7.17(m,1H),6.89(t,J＝8Hz,2H),5.65(s,4H),5.15(s,1H),4.74(t,J＝4Hz,2H),3.82-3.79(m,8H),2.79(t,J＝8Hz,4H),2.63(t,J＝8Hz,4H),2.07(s,2H),1.74-1.66(m,4H),1.61-1.55(m,4H),1.37-1.29(m,16H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO):δ155.32,148.36,132.14,130.44,121.48,118.11,112.56,112.36,79.10,71.88,60.25,42.16,33.20,29.09,29.03,28.98,28.84,28.81,28.41,25.08；MS(ESI):m/z 989.36[M+H].

實施例9

化合物I-3的制備

在圓底燒瓶中分別加入20mg II-1和15.8mg的III-4，隨后用體積比為1:2的四氫呋喃和水的混合溶劑溶解。再加入新制的抗壞血酸鈉溶液0.1mL和五水硫酸銅溶液0.1mL，80℃下反應2小時。旋干溶劑，柱層析分離，得25mg化合物I-3。

I-3：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.94(s,2H),8.43(s,2H),7.42-7.35(m,1H),7.11(t,J＝8Hz,2H),5.63(s,4H),5.17(s,1H),4.72(t,J＝4Hz,2H),3.59(t,J＝4Hz,4H),3.51(t,J＝8Hz,4H),2.69(t,J＝8Hz,4H),2.64-2.55(m,4H),1.67-1.62(m,4H),1.54-1.47(m,4H),1.29-1.24(m,16H).實施例10

化合物I-4的制備

在圓底燒瓶中分別加入76mg化合物III-1，58mg化合物II-2，隨后加入體積比為1:2的四氫呋喃和水的混合溶劑使之溶解。加入新制的抗壞血酸鈉溶液0.2mL和五水硫酸銅溶液0.2mL，80℃下反應2小時。旋干溶劑，柱層析分離，得76.5mg化合物I-4。

I-4：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.94(s,2H),8.43(s,2H),5.61(s,4H),3.63(t,J＝4Hz,4H),2.72-2.66(m,8H),2.39(t,J＝4Hz,4H),2.11(s,12H),1.67-1.57(m,8H),1.30-1.24(m,16H).

實施例11

化合物I-5的制備

在圓底燒瓶中分別加入37mg化合物III-1，60mg化合物II-3，隨后加入體積比為1:2的四氫呋喃和水的混合溶劑使之溶解。加入新制的抗壞血酸鈉溶液0.2mL和五水硫酸銅溶液0.2mL，80℃下反應2小時。旋干溶劑，柱層析分離，得68mg化合物I-5。

實施例12

化合物I-6的制備

取1,9-癸二炔60mg，化合物III-5 200mg加入微波反應瓶用體積比為3:1的二氧六環(huán)和水的混合溶劑溶解，再加入四三苯基膦鈀51.6mg，氮化亞銅8.6mg及碳酸鋰197mg，100℃下微波反應1小時后，旋干溶劑，柱色譜層析分離得到104mg產物I-6a。60mg化合物I-6a在氫氣/鈀碳條件下，還原得到化合物I-6 54.8mg.

實施例13

化合物I-7的制備

取1,9-壬二醇50mg，加入碳酸銫610mg以及化合物III-3 156mg，以二甲基甲酰胺作溶劑，室溫下攪拌反應16小時，除去溶劑后柱層析得到57mg化合物I-6。

實施例14

化合物I-8的制備

在圓底燒瓶中分別加入42mg化合物III-2，40mg化合物II-1c，隨后加入體積比為1:2的四氫呋喃和水的混合溶劑使之溶解。再加入新制的抗壞血酸鈉溶液0.2mL和五水硫酸銅溶液0.2mL以后，80℃下反應2小時。旋干溶劑，柱層析分離，得到57mg化合物I-8。

I-8：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):8.49(s,1H),5.62(s,2H),4.75(t,J＝4Hz,1H),3.62(t,J＝4Hz,2H),3.51(t,J＝4Hz,2H),2.81(t,J＝4Hz,2H),2.70(t,J＝8Hz,2H),2.31(s,3H),1.67-1.63(m,2H),1.50-1.47(m,2H),1.28-1.23(m,8H).

實施例15

化合物I-1通過自組裝形成納米顆粒。

實施方法：取2mg化合物1加水10ml，超聲溶解后用0.45μM濾膜過濾后，在水溶液中觀察到丁達爾現(xiàn)象，用動態(tài)光散射儀測量本發(fā)明化合物I-1自組裝形成的納米尺度的顆粒結果如圖1所示，結果顯示該化合物在水溶液自組裝形成的顆粒的平均粒徑是46nm。

實施例16

本發(fā)明化合物I-1用于抗癌活性實驗

前列腺癌細胞PC-3用含10％FBS的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，肝癌細胞HepG2和宮頸癌細胞Hela用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，卵巢癌細胞SKOV3用含10％FBS的McCoy's 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，胰腺癌細胞BxPC-3和Panc-1用含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后在96孔觀察板上均以10000每孔的密度種植上述細胞。細胞經過24h增殖后，加入不同濃度的待測化合物，以未加任何藥物為負對照，利巴韋林為以上所有細胞的正對照，同時PC-3選取多西紫杉醇作為正對照，HepG2選取五氟尿嘧啶為正對照，Hela和SKOV3選取順鉑為正對照，BxPC-3和Panc-1選取吉西他濱為正對照。在37℃以及5％CO₂條件下經過48小時培養(yǎng)后，用比色法測定存活的細胞數(shù)目(染色劑為3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT，又稱噻唑藍)?；衔颕-1及上述正對照藥物在同樣濃度(5μM)下對各種癌細胞的抑制率如表1所示，化合物I-1隨濃度升高對前列腺癌PC-3細胞增殖的抑制能力如圖2所示；化合物I-1隨濃度升高對肝癌細胞HepG2增殖的抑制能力如圖3所示；化合物I-1隨濃度升高對胰腺癌細胞Panc-1增殖的抑制能力如圖4所示；化合物I-1隨濃度升高對胰腺癌細胞BxPC-3增殖的抑制能力如圖5所示；化合物I-1隨濃度升高對宮頸癌Hela細胞增殖的抑制能力如圖6所示；化合物I-1隨濃度升高對卵巢癌SKOV3細胞增殖的抑制能力如圖7所示。

表1化合物I-1及各種抗癌臨床用藥的濃度一致條件下對不同癌細胞的抑制率

NA：no activity

實施例17

實驗例2本發(fā)明化合物I-2用于抗癌活性實驗

前列腺癌細胞PC-3用含10％FBS的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，肝癌細胞HepG2和宮頸癌細胞Hela用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，胰腺癌細胞BxPC-3和Panc-1用含10％FB S的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后在96孔觀察板上均以10000每孔的密度種植上述細胞。細胞經過24h增殖后，加入不同濃度的待測化合物，以未加任何藥物為負對照，利巴韋林為以上所有細胞的正對照，同時PC-3選取多西紫杉醇作為正對照，HepG2選取五氟尿嘧啶為正對照，Hela選取順鉑為正對照，BxPC-3和Panc-1選取吉西他濱為正對照。在37℃以及5％CO₂條件下經過48小時培養(yǎng)后，用比色法測定存活的細胞數(shù)目(染色劑為3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT，又稱噻唑藍)?；衔颕-2及上述正對照藥物在同樣濃度下(25μM)對各種癌細胞的抑制率如表2所示，化合物I-2隨濃度升高對前列腺癌PC-3細胞增殖的抑制能力如圖2所示；化合物I-2隨濃度升高對肝癌細胞HepG2增殖的抑制能力如圖3所示；化合物I-2隨濃度升高對胰腺癌細胞Panc-1增殖的抑制能力如圖4所示；化合物I-2隨濃度升高對胰腺癌細胞BxPC-3增殖的抑制能力如圖5所示；化合物I-2隨濃度升高對宮頸癌Hela細胞增殖的抑制能力如圖6所示。

表2化合物I-2及各種抗癌臨床用藥的濃度一致條件下對不同癌細胞的抑制率

實施例18

實驗例3本發(fā)明化合物I-3用于抗癌活性實驗

前列腺癌細胞PC-3用含10％FBS的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，肝癌細胞HepG2用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，胰腺癌細胞BxPC-3和Panc-1用含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后在96孔觀察板上均以10000每孔的密度種植上述細胞。細胞經過24h增殖后，加入不同濃度的待測化合物，以未加任何藥物為負對照，利巴韋林為以上所有細胞的正對照，同時PC-3選取多西紫杉醇作為正對照，HepG2選取五氟尿嘧啶為正對照，BxPC-3和Panc-1選取吉西他濱為正對照。在37℃以及5％CO₂條件下經過48小時培養(yǎng)后，用比色法測定存活的細胞數(shù)目(染色劑為3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT，又稱噻唑藍)?；衔颕-3及上述正對照藥物在同樣濃度下(50μM)對各種癌細胞的抑制率如表3所示，化合物I-3隨濃度升高對前列腺癌PC-3細胞增殖的抑制能力如圖2所示；化合物I-3隨濃度升高對肝癌細胞HepG2增殖的抑制能力如圖3所示；化合物I-3隨濃度升高對胰腺癌細胞Panc-1增殖的抑制能力如圖4所示。

表3化合物I-3及各種抗癌臨床用藥的濃度一致條件下對不同癌細胞的抑制率

實施例19

實驗例4本發(fā)明化合物I-8用于抗癌活性實驗

前列腺癌細胞PC-3用含10％FBS的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，肝癌細胞HepG2用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，卵巢癌細胞SKOV3用含10％FBS的McCoy's 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，胰腺癌細胞BxPC-3和Panc-1用含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后在96孔觀察板上均以10000每孔的密度種植上述細胞。細胞經過24h增殖后，加入不同濃度的待測化合物，以未加任何藥物為負對照，利巴韋林為以上所有細胞的正對照，同時PC-3選取多西紫杉醇作為正對照，HepG2選取五氟尿嘧啶為正對照，SKOV3選取順鉑為正對照，BxPC-3和Panc-1選取吉西他濱為正對照。在37℃以及5％CO₂條件下經過48小時培養(yǎng)后，用比色法測定存活的細胞數(shù)目(染色劑為3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT，又稱噻唑藍)。化合物I-8及上述正對照藥物在同樣濃度下(50μM)對各種癌細胞的抑制率如表4所示。

表4化合物I-8及各種抗癌臨床用藥的濃度一致條件下對不同癌細胞的抑制率

NA：no activity

綜上，從表1-4的結果可以看出，本發(fā)明所制備的bola型三氮唑核苷化合物I-1～I-3均具有明顯的抗癌細胞增殖的活性，在同樣濃度條件下，對腫瘤細胞生長的抑制效果要優(yōu)于利巴韋林，同時也比部分抗癌臨床用藥的活性要好，因此是一類極有潛力的抗腫瘤藥物先導。而非bola型的化合物I-8除了在BxPC-3上有一定的抑制癌細胞生長的活性，在其他的細胞系上均無明顯的抑制活性，進一步說明了Bola型結構對提高該類化合物生物活性的重要性。

最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍。