本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種木本植物花粉基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
花粉基因的遺傳轉(zhuǎn)化對研究其性質(zhì)、功能及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程都具有重要的意義，常規(guī)的研究方法是待轉(zhuǎn)基因植株到開花的階段，取出轉(zhuǎn)基因花粉進(jìn)行體外培養(yǎng)觀察。這不僅需要很長的生長周期，且由于蘋果等薔薇科高等木本果樹轉(zhuǎn)基因效率極低且遺傳背景復(fù)雜，因此直接對花粉進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因，可以縮短研究生殖細(xì)胞的周期。目前對于蘋果花粉瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法已有報(bào)道，如PEG介導(dǎo)或者電擊介導(dǎo)轉(zhuǎn)化花粉原生質(zhì)體，由于細(xì)胞壁組分復(fù)雜，造成游離效率低且再生困難，因此科研人員一直致力于尋求高效的轉(zhuǎn)化方式。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用于木本植物花粉基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種高效木本植物花粉基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種用于木本植物花粉基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的試劑盒，包括以下試劑組合：
用于配制金粉懸液的試劑：粒徑為0.08～1.0μm的金粉、70％～75％乙醇和質(zhì)量百分含量為50％～60％的甘油；用于制備DNA子彈的試劑：2～2.5M CaCl2、0.1～0.15M亞精胺、70％乙醇和無水乙醇；
花粉液體培養(yǎng)基：由0.08～0.1g/ml葡萄糖、0.25～0.3mg/ml CaCl2和0.08～0.1mg/ml硼酸組成。
優(yōu)選地，所述試劑盒包括以下試劑組合：
用于配制金粉懸液的試劑：粒徑為1.0μm的金粉、70％乙醇和質(zhì)量百分含量為50％的甘油；
用于制備DNA子彈的試劑：2M CaCl2、0.15M亞精胺、70％乙醇和無水乙醇；
花粉液體培養(yǎng)基：由0.1g/ml葡萄糖、0.3mg/ml CaCl2和0.1mg/ml硼酸組成。
本發(fā)明還提供利用所述試劑盒進(jìn)行木本植物花粉基因槍高效瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的方法，包括以下步驟：
1)配制金粉懸液；
2)制備DNA子彈；
3)用培養(yǎng)皿體外培養(yǎng)花粉，收集完成水合的花粉；
4)將水合完畢的花粉平鋪于用花粉液體培養(yǎng)基濕潤的NC尼龍膜上；
5)裝配可裂膜，打開基因槍裝置，將氦氣壓力大小調(diào)至高于可裂膜壓力，進(jìn)行基因槍轟擊；
6)取出轟擊后的花粉，用花粉液體培養(yǎng)基將花粉洗脫，暗培養(yǎng)后觀察。
前述方法步驟1)中，所述金粉用量為80mg，加入1.5ml 70％乙醇，震蕩25min；1200rpm離心15s，棄上清；加入1.5ml無菌水，繼續(xù)震蕩10min；1200rpm離心15s，棄上清；用1.5ml 50％甘油將金粉重懸，震蕩10min，得到終濃度為60mg/ml的金粉懸液，保存于4℃。
前述方法步驟2)中，用分光光度計(jì)(NANODROP 1000)測定攜帶有外源目的基因的質(zhì)粒濃度約為1000ng/μl；取6μl步驟1)的金粉懸液，加入8μl上述質(zhì)粒；加入8倍質(zhì)粒體積的2M CaCl2后加入48μl的0.15M亞精胺；震蕩儀上震蕩10min；12000rpm離心20s，棄去上清；
加入300μl 70％乙醇，12000rpm離心20s，棄去上清；此清洗操作步驟重復(fù)2次；
加入10μl無水乙醇，進(jìn)行重懸。
前述方法中，步驟3)采用直徑為2cm的培養(yǎng)皿，向1g花粉中加入2ml花粉液體培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉40min，直至花粉管長度為5μm。
前述方法中，步驟4)用槍頭吸取培養(yǎng)基底部水合完畢的花粉，平鋪于用花粉液體培養(yǎng)基濕潤的NC尼龍膜上，此操作在10cm的玻璃培養(yǎng)皿中進(jìn)行，且培養(yǎng)皿中放置大小合適的浸濕的濾紙；在超凈臺(tái)中通風(fēng)吹至NC膜上的花粉呈潮濕狀態(tài)，此時(shí)大量液體培養(yǎng)基被吹干。
前述方法中，步驟5)具體操作如下：打開基因槍裝置，將氦氣壓力的大小調(diào)到高于可裂膜壓力的100-200psi；裝配1100psi的可裂膜；將涂有包被金粉的承載膜置于裝置的由上至下第二格，花粉置于第三格，抽真空到26mm Hg，進(jìn)行基因槍轟擊；抽真空以及轟擊的操作步驟重復(fù)2次。
前述方法中，步驟6)將轟擊后的花粉用700ml花粉液體培養(yǎng)基進(jìn)行洗脫，洗脫至直徑為2cm的盛有固體培養(yǎng)基的平皿中，23℃黑暗培養(yǎng)2h后，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。
本發(fā)明中所用固體培養(yǎng)基是向所述花粉液體培養(yǎng)基中加入濃度為0.01～0.08g/ml(優(yōu)選0.01g/ml)的瓊脂。
本發(fā)明中，所述木本植物包括蘋果。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明提供了一種高效木本植物花粉基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法及其試劑盒。可實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、準(zhǔn)確性高、簡便地驗(yàn)證木本植物材料花粉管基因的功能。本發(fā)明以蘋果花粉為試材，通過水合花粉、DNA子彈制備以及利用氦氣轟擊剛萌發(fā)的花粉粒，進(jìn)行高效的基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，為直觀鑒定木本植物花粉管內(nèi)基因表達(dá)及功能驗(yàn)證提供技術(shù)體系。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中花粉基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化檢測結(jié)果。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
本發(fā)明試劑中各組分濃度如無特殊說明，均指終濃度。
乙醇的配比為70％(70ml的無水乙醇：30ml水)；直徑為1.0μm金粉；甘油的配比為50％(50ml的甘油：50ml水)。
DNA溶液的濃度為1000ng/μl(1000ng DNA：1μl水)，所述CaCl2的濃度為2mol/l(0.22196g CaCl2:1ml水)，所述亞精胺的濃度為0.15mol/l(0.021792g亞精胺:1ml水)。
葡萄糖濃度為0.1g/ml(10g葡萄糖：100ml水)，CaCl20.3mg/ml(30mg CaCl2：100ml水)，硼酸0.1mg/ml(10mg硼酸：100ml水)，瓊脂糖0.01g/ml(1g瓊脂糖：100ml水)。
金粉(目錄號為1652262)、1100psi可裂膜(目錄號為1652329)，承載膜(目錄號為1652323)購于美國Bio-rad公司，亞精胺(目錄號124209)購于Sigma公司，其他常規(guī)生化試劑購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)公司和北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司。離心管等一般耗材購于Axygen公司。
實(shí)施例1 蘋果花粉管基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法
由于本發(fā)明人前期克隆獲得了一個(gè)蘋果‘國光’花粉管中的基因，并經(jīng)載體構(gòu)建獲得用于基因槍轉(zhuǎn)化的DNA，選擇‘國光’花粉為研究對象?；ǚ刍驑屗矔r(shí)表達(dá)的流程：金粉的預(yù)處理—DNA子彈的制備—基因槍轟擊—花粉收集—花粉培養(yǎng)—激光共聚焦顯微鏡觀察，因此分別從以上各個(gè)步驟設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來確定花粉基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的方法。
一、蘋果花粉基因槍的制備
1、蘋果花粉的培養(yǎng)
將蘋果花粉分散于液體培養(yǎng)基表面，置于23℃培養(yǎng)箱中暗培40min，期間利用體式顯微鏡觀察花粉管的長度，待花粉管長度長至5μm，可停止萌發(fā)培養(yǎng)。
2、DNA子彈的制備
向直徑為1.0μm 80mg金粉中加入1.5ml 70％乙醇，震蕩25min。1200rpm離心15s，棄上清。加入1.5ml無菌水，繼續(xù)震蕩10min。1200rpm離心15s，棄上清。用1.5ml 50％甘油將金粉重懸，震蕩10min，得到終濃度為60mg/ml金粉懸液。質(zhì)粒由小量質(zhì)粒提取試劑盒提取。吸取6μl處理好的金粉懸液A，加入8μl濃度為1000ng/μl DNA質(zhì)粒(攜帶有外源目的基因)。加入64μl濃度為2.0M CaCl2后加入48μl濃度為0.15M亞精胺；震蕩儀上震蕩10min。12000rpm離心20s，棄去上清；加入300μl 70％乙醇，12000rpm離心20s，棄去上清(此步驟重復(fù)2次)。加入10μl無水乙醇，進(jìn)行重懸。
3、基因槍轟擊
用槍頭吸取培養(yǎng)基底部水合完畢的花粉，平鋪于用花粉液體培養(yǎng)基濕潤的NC尼龍膜上，此操作在10cm的玻璃培養(yǎng)皿中進(jìn)行，且培養(yǎng)皿中放置大小合適的浸濕的濾紙。在超凈臺(tái)中通風(fēng)吹到NC膜上的花粉呈潮濕狀態(tài)，此時(shí)大量液體培養(yǎng)基被吹干；打開基因槍裝置，將氦氣壓力的大小調(diào)到高于可裂膜壓力(1100psi)100-200psi；裝配1100psi的可裂膜；將涂有包被金粉的承載膜置于裝置的由上至下第二格，花粉置于第三格，抽真空到26mm Hg；抽真空進(jìn)行基因槍轟擊(此操作步驟重復(fù)2次)。
4、花粉收集
將上述轟擊過的花粉用700ml花粉液體培養(yǎng)基進(jìn)行洗脫，洗脫至直徑為2cm的盛有固體培養(yǎng)基的平皿中，在超凈臺(tái)吹干至粘稠狀態(tài)。
5、花粉培養(yǎng)
將含有花粉的固體培養(yǎng)基置于潮濕的15cm大號的玻璃皿中，在23℃黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，期間利用光學(xué)顯微鏡觀察花粉管生長狀態(tài)，可微調(diào)培養(yǎng)時(shí)間。
6、激光共聚焦顯微鏡觀察
將上述培養(yǎng)充分的花粉管置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，根據(jù)基因所連接熒光蛋白的不同選擇不同的激發(fā)光進(jìn)行觀察。圖1所示1為明場下的花粉管；2表示基因槍成功瞬時(shí)轉(zhuǎn)化了GFP熒光蛋白；3表示基因槍成功瞬時(shí)轉(zhuǎn)化了mcherry熒光蛋白；4表示基因槍成功瞬時(shí)轉(zhuǎn)化了基因MVG融合表達(dá)GFP熒光蛋白；5表示基因槍成功瞬時(shí)轉(zhuǎn)化了基因lifeact融合表達(dá)GFP熒光蛋白；6表示對照實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)有的基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化lifeact融合表達(dá)GFP熒光蛋白，熒光蛋白表達(dá)的效率低。說明本方法能夠高效率的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化花粉管基因，可以進(jìn)行后續(xù)研究。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。