本發(fā)明涉及一種基因啟動(dòng)子甲基化引物，尤其涉及一種檢測動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化引物。

背景技術(shù)：

動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)特異基因的啟動(dòng)子cpg區(qū)域的甲基化修飾與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和形成相關(guān)。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，會(huì)發(fā)生特異的基因的甲基化修飾，因此，動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)已經(jīng)成為一類重要的動(dòng)脈粥樣硬化疾病檢測的標(biāo)志物，可用于動(dòng)脈粥樣硬化早期檢測和評(píng)價(jià)。

巢式降落式甲基化聚合酶鏈反應(yīng)(nestedtouchdownmethylation-spciicpcr，ntms-pcr)是一種基于亞硫酸氫化修飾基礎(chǔ)上的甲基化檢測方法，用特殊設(shè)計(jì)的dna序列的引物可以區(qū)分甲基化片段和未甲基化片段，從而檢測基因啟動(dòng)子區(qū)dna甲基化狀態(tài)。將這個(gè)技術(shù)應(yīng)用于甲基化半定量分析，具有高效、成本低廉、操作簡單、無需標(biāo)記技術(shù)和特殊設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)。而傳統(tǒng)的dna測序方法操作繁瑣，成本昂貴，此外，對(duì)檢測儀器的需求也限制了其在臨床的實(shí)際應(yīng)用。因此，ntms-pcr方法有希望成為臨床常規(guī)檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種檢測動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化引物及pcr試劑、試劑盒和應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種檢測動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化引物為如下(1)或(2)：

(1)所述甲基化引物由引物對(duì)a～引物對(duì)f組成，其中，

所述引物對(duì)a由引物1：ttaggtagtttttgtttgaatttcg，如seqidno：1所示和引物2：ataaataccgattcttattcccgtt，如seqidno：2所示組成；

所述引物對(duì)b由引物3：taggtagtttttgtttgaattttgg，如seqidno：3所示和引物4：ataaataccaattcttattcccatt，如seqidno：4組成；

所述引物對(duì)c由引物5：aattttattggtgtttttggttgtc，如seqidno：5和引物6：atatcttaaaatccgcgatctacg如seqidno：6組成；

所述引物對(duì)d由引物7：aattttattggtgtttttggttgtt，如seqidno：7和引物8：caaatatcttaaaatccacaatctac，如seqidno：8組成；

所述引物對(duì)e由引物9：ttaattagtttggtttttggtcgtt，如seqidno：9和引物10：cttatataccaaatgcgaacgtct，如seqidno：10組成；

所述引物對(duì)f由引物11：ttaattatgtgtgtttggttttttg，如seqidno：11和引物12：tccaaattaaaatccaaactccata，如seqidno：12組成；

所述引物1～引物12的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1～12；

(3)所述甲基化引物為引物對(duì)a～引物對(duì)f中的至少一種。

進(jìn)一步，所述引物對(duì)a用于檢測timp-1基因的甲基化；

所述引物對(duì)b用于檢測timp-1基因的非甲基化狀態(tài)；

所述引物對(duì)c用于檢測abca1基因的甲基化；

所述引物對(duì)d用于檢測abca1基因的非甲基化狀態(tài)；

所述引物對(duì)e用于檢測acat1基因的甲基化；

所述引物對(duì)f用于檢測acat1基因的非甲基化。

進(jìn)一步，所述引物對(duì)a用于檢測timp-1基因cpg位點(diǎn)的甲基化；

所述引物對(duì)b用于檢測timp-1基因cpg位點(diǎn)的非甲基化狀態(tài)；

所述引物對(duì)c用于檢測abca1基因cpg位點(diǎn)的甲基化；

所述引物對(duì)d用于檢測abca1基因cpg位點(diǎn)的非甲基化狀態(tài)；

所述引物對(duì)e用于檢測acat1基因cpg位點(diǎn)的甲基化；

所述引物對(duì)f用于檢測acat1基因cpg位點(diǎn)的非甲基化狀態(tài)。

進(jìn)一步，所述cpg位點(diǎn)為ccgg。

本發(fā)明進(jìn)一步解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種檢測動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化引物的pcr試劑為如下(1)或(2)：

(1)所述pcr試劑包括pcr試劑a1～pcr試劑f1，其中

所述pcr試劑a1由所述引物對(duì)a、dntps、pcr擴(kuò)增緩沖液和dna聚合酶組成；

所述pcr試劑b1由所述引物對(duì)b、dntps、pcr擴(kuò)增緩沖液和dna聚合酶組成；

所述pcr試劑c1由所述引物對(duì)c、dntps、pcr擴(kuò)增緩沖液和dna聚合酶組成；

所述pcr試劑d1由所述引物對(duì)d、dntps、pcr擴(kuò)增緩沖液和dna聚合酶組成；

所述pcr試劑f1由所述引物對(duì)e、dntps、pcr擴(kuò)增緩沖液和dna聚合酶組成；

所述pcr試劑f1由所述引物對(duì)f、dntps、pcr擴(kuò)增緩沖液和dna聚合酶組成；

(3)所述pcr試劑包括pcr試劑a1～pcr試劑f1中的至少一種。

進(jìn)一步，所述pcr試劑由pcr試劑a1～pcr試劑f1組成。

進(jìn)一步，所述dntps由dgtp、datp、dctp和dttp組成。

進(jìn)一步，每條所述引物在對(duì)應(yīng)的所述pcr試劑中的終濃度均為100nm。

本發(fā)明進(jìn)一步解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種含檢測動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化引物或含檢測動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化引物pcr試劑的試劑盒。

本發(fā)明進(jìn)一步解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種檢測動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化引物或檢測動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化引物的pcr試劑在制備檢測或輔助檢測動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)品中的應(yīng)用。

各引物均獨(dú)立包裝，每一種pcr試劑均為獨(dú)立包裝。

用于檢測甲基化特異性pcr方法的基本原理和步驟涉及亞硫酸氫化修飾基礎(chǔ)上的甲基化檢測方法。用重亞硫酸鹽可以使cpg位點(diǎn)中未甲基化的胞嘧啶(c)經(jīng)脫氨基作用轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(u)，而甲基化的胞嘧啶不變，用特殊設(shè)計(jì)的dna序列的引物可以區(qū)分待測dna的甲基化狀態(tài)和未甲基化狀態(tài)。巢式降落式甲基化特異性pcr(nestedtouchdownmethylation-spciicpcr，ntms-pcr)，是針對(duì)經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后的dna序列設(shè)計(jì)一對(duì)非特異的外引物，即是巢氏，該引物避開cg二核苷酸，既能與dna的甲基化片段結(jié)合，也能與非甲基化片段結(jié)合。操作時(shí)首先用外引物對(duì)修飾后的dna樣本進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用第一輪pcr產(chǎn)物作為模板加入特異性的甲基化和非甲基化引物繼續(xù)第二輪擴(kuò)增。降落pcr(td-pcr)的方法，是在pcr擴(kuò)增開始時(shí)先在tm值允許范圍內(nèi)選擇高于tm值的退火溫度，每個(gè)循環(huán)都依次降低溫度，最終使退火溫度低于非特異性雜交的tm值，此時(shí)擴(kuò)增目的片段的數(shù)量已占絕對(duì)優(yōu)勢，可對(duì)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生競爭性抑制，從而提高pcr的特異性和效率。巢式和降落式甲基化特異性pcr的聯(lián)合運(yùn)用增加了目的片段的擴(kuò)增效率，且提高了擴(kuò)增特異性。

本發(fā)明檢測dna甲基化的引物包含了兩個(gè)或者兩個(gè)以上的5’-ccgg-3’序列，能夠真實(shí)特異地反應(yīng)該基因的甲基化狀態(tài)，而且在引物的設(shè)計(jì)方面也避免了鏈內(nèi)和鏈間互補(bǔ)問題，降低背景干擾。此外，通過優(yōu)化引物的堿基組成和長度來控制引物tm值使其在60℃，保證pcr產(chǎn)物的特異性和擴(kuò)增效率，它們能高效地檢測動(dòng)脈粥樣硬化血液樣本的甲基化狀態(tài)。

附圖說明

圖1為檢測樣本的timp-1基因組dna瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，lane1：dl2000；lane2-5：基因組dna。

圖2為應(yīng)用引物3、4和引物5、6行pcr擴(kuò)增檢測樣本timp-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化和未甲基化的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，lane1：dl2000；lane2：正常人timp-1啟動(dòng)子區(qū)甲基化pcr產(chǎn)物；lane3：正常人timp-1啟動(dòng)子區(qū)未甲基化pcr產(chǎn)物；lane4：動(dòng)脈粥樣硬化患者timp-1啟動(dòng)子區(qū)甲基化pcr產(chǎn)物；lane5：動(dòng)脈粥樣硬化患者timp-1啟動(dòng)子區(qū)未甲基化pcr產(chǎn)物。

圖3為應(yīng)用引物3、4和引物5、6行pcr擴(kuò)增檢測樣本timp-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化比率圖。其中，**，p＜0.01vsmatchedcontrolgroup。

圖4為檢測樣本的abca1基因組dna瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，lane1：dl2000；lane2-5：基因組dna。

圖5為應(yīng)用引物9、10和引物11、12行pcr擴(kuò)增檢測樣本abca1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化和未甲基化的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，lane1：dl2000；lane2：正常人abca1啟動(dòng)子區(qū)甲基化pcr產(chǎn)物；lane3：正常人abca1啟動(dòng)子區(qū)未甲基化pcr產(chǎn)物；lane4：動(dòng)脈粥樣硬化患者abca1啟動(dòng)子區(qū)甲基化pcr產(chǎn)物；lane5：動(dòng)脈粥樣硬化患者abca1啟動(dòng)子區(qū)未甲基化pcr產(chǎn)物。

圖6為應(yīng)用引物9、10和引物11、12行pcr擴(kuò)增檢測樣本abca1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化比率圖。其中，**，p＜0.01vsmatchedcontrolgroup。

圖7為檢測樣本的acat1基因組dna瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，lane1：dl2000；lane2-5：基因組dna。

圖8為應(yīng)用引物15、16和引物17、18行pcr擴(kuò)增檢測樣本acat1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化和未甲基化的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，lane1：dl2000；lane2：正常人timp-1啟動(dòng)子區(qū)甲基化pcr產(chǎn)物；lane3：正常人acat1啟動(dòng)子區(qū)未甲基化pcr產(chǎn)物；lane4：動(dòng)脈粥樣硬化患者acat1啟動(dòng)子區(qū)甲基化pcr產(chǎn)物；lane5：動(dòng)脈粥樣硬化患者timp-1啟動(dòng)子區(qū)未甲基化pcr產(chǎn)物。

圖9為應(yīng)用引物15、16和引物17、18行pcr擴(kuò)增檢測樣本acat1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化比率圖。其中，**，p＜0.01vsmatchedcontrolgroup。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，對(duì)于下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、引物的設(shè)計(jì)

1、候選基因的選擇

選定與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的甲基化發(fā)生頻率較高的候選基因，選定timp-1(nm_003380)，abca1(xm_003483574)，acat1(nm_016192)啟動(dòng)子區(qū)dna序列。通過http：//www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hggateway鏈接，可以查找到這些基因啟動(dòng)子區(qū)的序列。擴(kuò)增序列的位點(diǎn)分別如下表：

表1-擴(kuò)增序列的位點(diǎn)表

2、引物設(shè)計(jì)

尋找和確定上述基因中富含cpg島序列(cpg位點(diǎn)：ccgg)，然后以該段序列為模板，設(shè)計(jì)、合成引物。設(shè)計(jì)的引物如下表：

表2動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增序列和pcr產(chǎn)物相關(guān)信息表

上述引物由上海生物技術(shù)公司合成，純化級(jí)別為page級(jí)別。

實(shí)施例2、引物的應(yīng)用

一、timp-1引物的應(yīng)用

1、待測dna的提取

分別提取50個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化患者樣本(來源于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心內(nèi)科就診者經(jīng)頸動(dòng)脈多普勒超聲確診為動(dòng)脈粥樣硬化)和50個(gè)正常體檢者的樣本(離體血液，受試者知情同意)的基因組dna，進(jìn)行基因組dna質(zhì)量的鑒定。

(1)基因組dna的電泳檢測

取出dna溶液5μl，與1μl電泳加樣緩沖液(含0.25％溴酚蘭，40％蔗糖)混合，混勻后加入到1％瓊脂糖凝膠加樣孔中，電泳25min后，在紫外凝膠成像分析儀中觀察，見圖1。

(2)dna的純度和濃度檢測

用te溶液稀釋待測的dna樣品，將te溶液：待測dna樣品＝1∶10，充分混勻。使用te溶液調(diào)零：紫外分光光度計(jì)波長260nm處，讀數(shù)為零。調(diào)零后分別測定各個(gè)dna樣品在260nm處的od值，每個(gè)樣品重復(fù)測定三次。

dna樣品純度判斷依據(jù)od260/od280，od260/od280是指dna在260nm和280nm的od值的比值，用于判斷dna樣品純度。od260/od280為1.8～2.0之間的dna溶液可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

dna樣品濃度計(jì)算公式為：dna＝10×od260×稀釋倍數(shù)(μg/ml)。

2、基因組dna的甲基化處理

(1)將130μlct轉(zhuǎn)換試劑加入pcr管，再加入20μldna溶液(如果dna樣品的體積小于20μl，加水補(bǔ)足差量)。通過輕彈管壁或上下吹打混勻樣品，然后離心使液體至試管底部。

(2)將樣品管放入熱循環(huán)儀(pcr儀)上，按以下步驟操作：

a)98℃10min

b)64℃2.5h

c)立即進(jìn)行下述操作；

(3)加入600μlm-bindingbuffer到zymo-spin旋轉(zhuǎn)柱中，將柱子放到試劑盒里已經(jīng)提供的2ml收集管中。

(4)將第二步中的樣品加到含m-bindingbuffer的旋轉(zhuǎn)柱中，蓋上蓋子，上下顛倒充分混勻。

(5)混勻后，12000g，全速離心30s，然后棄去上清。

(6)加100μlm-washbuffer到旋轉(zhuǎn)柱中，全速離心30s；

(7)加200μlm-desulphonationbuffer到旋轉(zhuǎn)柱中，室溫(20～30℃)放置15～20min后，12000g的速度，離心30s。

(8)加入200μlm-washbuffe到旋轉(zhuǎn)柱中，12000g，離心30s，該步驟可重復(fù)操作一次。

(9)將旋轉(zhuǎn)柱放到另一個(gè)新的1.5ml的離心管中，直接加10μlm-elutionbuffer到柱中，12000g離心，30s，洗脫dna。

3、ntms-pcr檢測dna甲基化

(1)引物設(shè)計(jì)

dna甲基化主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)cpg島中的胞嘧啶上，設(shè)計(jì)引物前首先在ucsc(http：//www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hggateway)網(wǎng)站中尋找基因啟動(dòng)子區(qū)序列，使用在線甲基化引物設(shè)計(jì)軟件(htty：//www.urogene.org/methprimer)，設(shè)計(jì)各基因的引物，每個(gè)基因共設(shè)計(jì)三對(duì)引物，分別設(shè)計(jì)一對(duì)外引物和兩對(duì)內(nèi)引物，即甲基化引物和非甲基化引物(引物由上海生工生物工程公司合成)，序列如下，f：taggtagtttttgtttgaattttgg，r：ataaataccaattcttattcccatt。

(2)pcr擴(kuò)增

首先擴(kuò)增外引物，pcr反應(yīng)體系為基因組dna4μl，mix(promega公司)12.5μl，引物1和2各1μl(引物的終濃度均為100nm)，去離子水6.5μl。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；然后95℃，30s，tm60℃，30s，72℃，30s，每個(gè)循環(huán)降0.5℃，循環(huán)20次；再以恒定的退火溫度下進(jìn)行94℃變性，30s，56℃退火，30s，72℃延伸，30s，20次循環(huán)；最后72℃繼續(xù)延伸7min，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖2。

以外引物擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪擴(kuò)增中的模板，加入timp-1的甲基化(引物3和引物4)/非甲基化(引物5和引物6)引物進(jìn)行繼續(xù)擴(kuò)增。本試驗(yàn)中直接取外引物pcr產(chǎn)物2μl做模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，第二輪內(nèi)引物擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；然后采用降落式pcr程序，95℃，30s，64℃，30s，72℃，30s，依然是每個(gè)循環(huán)降0.5℃，20次循環(huán)；再于恒定的退火溫度下進(jìn)行94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，共20次循環(huán)；72℃再延伸7min。

(3)計(jì)算

最終取5μlpcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，恒壓100v，25min。電泳結(jié)束后用凝膠成像儀紫外線照像分析各個(gè)條帶的光密度值(od值)，按如下公式計(jì)算結(jié)果：甲基化％＝甲基化(od值)/[甲基化(od值)+非甲基化(od值)]。

結(jié)果如圖3所示，可知50個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化樣本的timp-1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度高于正常人樣本。

結(jié)果如圖4所示，可知50個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化樣本甲基化比值高于50個(gè)正常人的dna甲基化比值。

二、abca1引物的應(yīng)用

1、待測dna的提取

分別提取50個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化患者樣本(來源于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心內(nèi)科就診者經(jīng)頸動(dòng)脈多普勒超聲確診為動(dòng)脈粥樣硬化)和50個(gè)正常體檢者的樣本(離體血液，受試者知情同意)的基因組dna，進(jìn)行基因組dna質(zhì)量的鑒定

(1)基因組dna的電泳檢測

取出dna溶液5μl，與1μl電泳加樣緩沖液(含0.25％溴酚蘭，40％蔗糖)混合，混勻后加入到1％瓊脂糖凝膠加樣孔中，電泳25min后，在紫外凝膠成像分析儀中觀察，見圖5。

(2)dna的純度和濃度檢測

用te溶液稀釋待測的dna樣品，te溶液：待測dna樣品＝1∶10，充分混勻。使用te溶液調(diào)零：紫外分光光度計(jì)波長260nm處，讀數(shù)為零。調(diào)零后分別測定各個(gè)dna樣品在260nm處的od值，每個(gè)樣品重復(fù)測定三次。

dna樣品純度判斷依據(jù)od260/od280，od260/od280是指dna在260nm和280nm的od值的比值，用于判斷dna樣品純度。od260/od280為1.8-2.0之間的dna溶液可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

dna樣品濃度計(jì)算公式為：dna＝10×od260×稀釋倍數(shù)(μg/ml)

2、基因組dna的甲基化處理

(1)將130μlct轉(zhuǎn)換試劑加入pcr管，再加入20μldna溶液(如果dna樣品的體積小于20μl，加水補(bǔ)足差量)。通過輕彈管壁或上下吹打混勻樣品，然后離心使液體至試管底部。

(2)將樣品管放入熱循環(huán)儀(pcr儀)上，按以下步驟操作：

a)98℃10min

b)64℃2.5h

c)立即進(jìn)行下述操作；

(3)加入600μlm-bindingbuffer到zymo-spin旋轉(zhuǎn)柱中，將柱子放到試劑盒里已經(jīng)提供的2ml收集管中。

(4)將第二步中的樣品加到含m-bindingbuffer的旋轉(zhuǎn)柱中，蓋上蓋子，上下顛倒充分混勻。

(5)混勻后，12000g，全速離心30s，然后棄去上清。

(6)加100μlm-washbuffer到旋轉(zhuǎn)柱中，全速離心30s；

(7)加200μlm-desulphonationbuffer到旋轉(zhuǎn)柱中，室溫(20-30℃)放置15-20min后，12000g的速度，離心30s。

(8)加入200μlm-washbuffe到旋轉(zhuǎn)柱中，12000g，離心30s，該步驟可重復(fù)操作一次。

(9)將旋轉(zhuǎn)柱放到另一個(gè)新的1.5ml的離心管中，直接加10μlm-elutionbuffer到柱中，12000g離心，30s，洗脫dna。

3、ntms-pcr檢測dna甲基化

(1)引物設(shè)計(jì)

dna甲基化主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)cpg島中的胞嘧啶上，設(shè)計(jì)引物前首先在ucsc(http：//www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hggateway)網(wǎng)站中尋找基因啟動(dòng)子區(qū)序列，使用在線甲基化引物設(shè)計(jì)軟件(htty：//www.urogene.org/methprimer)，設(shè)計(jì)各基因的引物，每個(gè)基因共設(shè)計(jì)三對(duì)引物，分別設(shè)計(jì)一對(duì)外引物和兩對(duì)內(nèi)引物，即甲基化引物和非甲基化引物(引物由上海生工生物工程公司合成)，序列如下f：aattttattggtgtttttggttgtt，r：caaatatcttaaaatccacaatctac。

(2)pcr擴(kuò)增

首先擴(kuò)增外引物，pcr反應(yīng)體系為基因組dna4μl，mix(promega公司)12.5μl，引物7和8各1μl(引物的終濃度均為100nm)，去離子水6.5μl。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；然后95℃，30s，tm60℃，30s，72℃，30s，每個(gè)循環(huán)降0.5℃，循環(huán)20次；再以恒定的退火溫度下進(jìn)行94℃變性，30s，56℃退火，30s，72℃延伸，30s，20次循環(huán)；最后72℃繼續(xù)延伸7min，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖6。

以外引物擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪擴(kuò)增中的模板，加入abca1的甲基化(引物9和引物10)/非甲基化引物(引物11和引物12)進(jìn)行繼續(xù)擴(kuò)增。本試驗(yàn)中直接取外引物pcr產(chǎn)物2μl做模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，第二輪內(nèi)引物擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；然后采用降落式pcr程序，95℃，30s，64℃，30s，72℃，30s，依然是每個(gè)循環(huán)降0.5℃，20次循環(huán)；再于恒定的退火溫度下進(jìn)行94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，共20次循環(huán)；72℃再延伸7min。

(3)計(jì)算

最終取5μlpcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，恒壓100v，25min。電泳結(jié)束后用凝膠成像儀紫外線照像分析各個(gè)條帶的光密度值(od值)，按如下公式計(jì)算結(jié)果：甲基化％＝甲基化(od值)/[甲基化(od值)+非甲基化(od值)]。

結(jié)果如圖7所示，可知50個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化樣本的abca1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度高于正常人樣本。

結(jié)果如圖8所示，可知50個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化樣本甲基化比值高于50個(gè)正常人的dna甲基化比值。

三、acat1引物的應(yīng)用

1、待測dna的提取

分別提取50個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化患者樣本(來源于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心內(nèi)科就診者經(jīng)頸動(dòng)脈多普勒超聲確診為動(dòng)脈粥樣硬化)和50個(gè)正常體檢者的樣本(離體血液，受試者知情同意)的基因組dna，進(jìn)行基因組dna質(zhì)量的鑒定

(1)基因組dna的電泳檢測

取出dna溶液5μl，與1μl電泳加樣緩沖液(含0.25％溴酚蘭，40％蔗糖)混合，混勻后加入到1％瓊脂糖凝膠加樣孔中，電泳25min后，在紫外凝膠成像分析儀中觀察，見圖9。

(2)dna的純度和濃度檢測

用te溶液稀釋待測的dna樣品，te溶液∶待測dna樣品＝1∶10，充分混勻。使用te溶液調(diào)零：紫外分光光度計(jì)波長260nm處，讀數(shù)為零。調(diào)零后分別測定各個(gè)dna樣品在260nm處的od值，每個(gè)樣品重復(fù)測定三次。

dna樣品純度判斷依據(jù)od260/od280，od260/od280是指dna在260nm和280nm的od值的比值，用于判斷dna樣品純度。od260/od280為1.8～2.0之間的dna溶液可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

dna樣品濃度計(jì)算公式為：dna＝10×od260×稀釋倍數(shù)(μg/ml)。

2、基因組dna的甲基化處理

(1)將130μlct轉(zhuǎn)換試劑加入pcr管，再加入20μldna溶液(如果dna樣品的體積小于20μl，加水補(bǔ)足差量)。通過輕彈管壁或上下吹打混勻樣品，然后離心使液體至試管底部。

(2)將樣品管放入熱循環(huán)儀(pcr儀)上，按以下步驟操作：

a)98℃10min

b)64℃2.5h

c)立即進(jìn)行下述操作；

(3)加入600μlm-bindingbuffer到zymo-spin旋轉(zhuǎn)柱中，將柱子放到試劑盒里已經(jīng)提供的2m1收集管中。

(4)將第二步中的樣品加到含m-趴ndingbuffer的旋轉(zhuǎn)柱中，蓋上蓋子，上下顛倒充分混勻。

(5)混勻后，12000g，全速離心30s，然后棄去上清。

(6)加100μlm-washbuffer到旋轉(zhuǎn)柱中，全速離心30s；

(7)加200μlm-desulphonationbuffer到旋轉(zhuǎn)柱中，室溫(20-30℃)放置15-20min后，12000g的速度，離心30s。

(8)加入200μlm-washbuffe到旋轉(zhuǎn)柱中，12000g，離心30s，該步驟可重復(fù)操作一次。

(9)將旋轉(zhuǎn)柱放到另一個(gè)新的1.5ml的離心管中，直接加10μlm-elutionbuffer到柱中，12000g離心，30s，洗脫dna。

3、ntms-pcr檢測dna甲基化

(1)引物設(shè)計(jì)

dna甲基化主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)cpg島中的胞嘧啶上，設(shè)計(jì)引物前首先在ucsc(http：//www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hggateway)網(wǎng)站中尋找基因啟動(dòng)子區(qū)序列，使用在線甲基化引物設(shè)計(jì)軟件(htty：//www.urogene.org/methprimer)，設(shè)計(jì)各基因的引物，每個(gè)基因共設(shè)計(jì)三對(duì)引物，分別設(shè)計(jì)一對(duì)外引物和兩對(duì)內(nèi)引物，即甲基化引物和非甲基化引物(引物由上海生工生物工程公司合成)，序列如下，f：ttaattatgtgtgtttggttttttg，r：tccaaattaaaatccaaactccata。

(2)pcr擴(kuò)增

首先擴(kuò)增外引物，pcr反應(yīng)體系為基因組dna4μl，mix(promega公司)12.5μl，引物13和14各1μl(引物的終濃度均為100nm)，去離子水6.5μl。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；然后95℃，30s，tm60℃，30s，72℃，30s，每個(gè)循環(huán)降0.5℃，循環(huán)20次；再以恒定的退火溫度下進(jìn)行94℃變性，30s，56℃退火，30s，72℃延伸，30s，20次循環(huán)；最后72℃繼續(xù)延伸7min，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖8。

以外引物擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪擴(kuò)增中的模板，加入abca1的甲基化(引物15和引物16)/非甲基化引物(引物17和引物18)進(jìn)行繼續(xù)擴(kuò)增。本試驗(yàn)中直接取外引物pcr產(chǎn)物2μl做模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。第二輪內(nèi)引物擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；然后采用降落式pcr程序，95℃，30s，64℃，30s，72℃，30s，依然是每個(gè)循環(huán)降0.5℃，20次循環(huán)；再于恒定的退火溫度下進(jìn)行94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，共20次循環(huán)；72℃再延伸7min。

(3)計(jì)算

最終取5μlpcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，恒壓100v，25min。電泳結(jié)束后用凝膠成像儀紫外線照像分析各個(gè)條帶的光密度值(od值)，按如下公式計(jì)算結(jié)果：甲基化％＝甲基化(od值)/[甲基化(od值)+非甲基化(od值)]。

結(jié)果如圖9所示，可知50個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化樣本的acat1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度高于正常人樣本，50個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化樣本甲基化比值高于50個(gè)正常人的dna甲基化比值。

上述3個(gè)基因可以同時(shí)檢測以確定待測樣本的甲基化狀態(tài)。

sequencelisting

<110>寧夏醫(yī)科大學(xué)

<120>一種檢測動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化引物

<130>2016

<160>15

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

ttaggtagtttttgtttgaatttcg25

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

ataaataccgattcttattcccgtt25

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

taggtagtttttgtttgaattttgg25

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

ataaataccaattcttattcccatt25

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

aattttattggtgtttttggttgtc25

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工合成

<400>6

atatcttaaaatccgcgatctacg24

<210>7

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>7

aattttattggtgtttttggttgtt25

<210>8

<211>26

<212>dna

<213>人工合成

<400>8

caaatatcttaaaatccacaatctac26

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>9

ttaattagtttggtttttggtcgtt25

<210>10

<211>24

<212>dna

<213>人工合成

<400>10

cttatataccaaatgcgaacgtct24

<210>11

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>11

ttaattatgtgtgtttggttttttg25

<210>12

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>12

tccaaattaaaatccaaactccata25

<210>13

<211>116

<212>dna

<213>timp-1

<400>13

tgccaggtagcctctgtttgaatcccggccatgccctgtgatcttaggaaaattctacag60

ttcctctacgccccatatttcctcatccgtaaaacgggaataagaaccggtaccca116

<210>14

<211>141

<212>dna

<213>abca1

<400>14

aaattccactggtgcccttggctgccgggaacgtggactagagagtctgcggcgcagccc60

cgagcccagcgcttcccgcgcgtcttaggccggcgggcccgggcgggggaaggggacgca120

gaccgcggaccctaagacacc141

<210>15

<211>128

<212>dna

<213>acat1

<400>15

agcctctgggcaacatggtgaaaacccgtctctactaaaatacaaaagattagccaggct60

tggcagcgtgcgcctgtaatcccagctactcgtgaggctgaggcgaactcaggaggcaga120

ggttgcag128