本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，涉及一個(gè)能顯著提高海島棉鈴重的陸地棉染色體片段及其ssr標(biāo)記引物和應(yīng)用。技術(shù)背景棉花是世界性的重要經(jīng)濟(jì)作物，是紡織業(yè)的重要材料。我國(guó)也是產(chǎn)棉大國(guó)，產(chǎn)棉區(qū)覆蓋16個(gè)省、市(自治區(qū))，每年總產(chǎn)量500萬(wàn)噸以上。棉花產(chǎn)量性狀中比較重要的一個(gè)指標(biāo)是籽棉產(chǎn)量，其構(gòu)成的重要因素之一是單鈴重。棉花單鈴重性狀是典型的數(shù)量性狀，易受環(huán)境條件影響，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)棉花單鈴重進(jìn)行了大量的qtl定位研究。于雯雯(2006)利用海陸雜交f2群體在3個(gè)染色體上檢測(cè)到3個(gè)鈴重qtl，可以解釋12-15％的表型變異；張先亮(2007)利用陸地棉品種間ril群體，定位3個(gè)鈴重qtl；王沛政(2007)利用3個(gè)陸地棉品種間雜交f2群體，檢測(cè)到5個(gè)鈴重的qtl，可以解釋14.2-39.2％的表型變異；尤春英(2007)利用海陸雜交f2群體，檢測(cè)到5個(gè)鈴重qtl，可以解釋10.3-18.3％的表型變異；秦鴻德(2007)利用一個(gè)陸地棉品種間三交群體，檢測(cè)到1個(gè)鈴重qtl；張保才(2006)利用海陸雜交bc1s1、bc1f1和bc2f13個(gè)世代群體，檢測(cè)到2個(gè)鈴重qtl，可以解釋8.5-11.2％的表型變異；張培通等(2006)利用泗棉3號(hào)和西班牙陸地棉栽培品種carmen的ril群體，檢測(cè)到1個(gè)鈴重qtl；saranga等(2004)利用海陸雜交組合的f2、f3群體，檢測(cè)到13個(gè)鈴重qtl，可以解釋4.4-23.1％的表型變異；wang等(2007)利用中棉所12×8891重組自交系群體在三個(gè)環(huán)境下的平均值資料，檢測(cè)到3個(gè)鈴重qtl，解釋4.79-6.39％的表型變異；錢能(2009)利用陸地棉品種間雜交得到的四交群體檢測(cè)到一個(gè)解釋14.1％表型變異的鈴重qtl；yu等(2013)利用陸地棉和埃及棉的包含146個(gè)株系的bil群體檢測(cè)到8個(gè)鈴重qtl；gore等(2014)利用tm-1和nm24016(來(lái)源于海島棉片段的導(dǎo)入系)創(chuàng)建ril群體定位了5個(gè)鈴重的qtls。海島棉生育期長(zhǎng)，成熟晚，鈴小，產(chǎn)量低于陸地棉，但纖維細(xì)強(qiáng)，是紡高支紗原料，因此，改良海島棉的產(chǎn)量性狀，在育種上具有重要意義。傳統(tǒng)的雜交育種因海陸f2代分離嚴(yán)重而很難進(jìn)行，因此，利用導(dǎo)入系進(jìn)行海島棉產(chǎn)量性狀改良成為海島棉育種的重要手段。染色體片段導(dǎo)入系(chromosomesegmentintrogressionlines，csil)是利用雜交，回交和分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assistedselection,mas)構(gòu)建的覆蓋作物整個(gè)基因組的一系列近等基因系。它的基因組內(nèi)只有來(lái)自供體親本的一個(gè)純合的染色體片段，而基因組的其余部分與輪回親本相同。它是進(jìn)行基因組研究，特別是qtl定位和分子設(shè)計(jì)育種的理想材料。eshed和zamir(1995)利用覆蓋番茄全基因組的50個(gè)染色體片段導(dǎo)入系定位了個(gè)番茄品質(zhì)性狀的qtl。他們發(fā)現(xiàn)利用染色體片段導(dǎo)入系對(duì)番茄果實(shí)總固形物含量和果實(shí)重量進(jìn)行qtl定位時(shí)比利用常規(guī)分離群體定位的qtl數(shù)要多出1倍；raeetal.(1999)在研究十字花科植物開(kāi)花期qtl時(shí)發(fā)現(xiàn)，利用導(dǎo)入系鑒定的qtl數(shù)比利用常規(guī)分離群體鑒定的qtl數(shù)多。arbelaez等(2015)利用兩個(gè)野生種稻和一個(gè)共同的輪回親本構(gòu)建了導(dǎo)入系。此外在大豆(wang等2013；lee等2014)，玉米(burton等2015)，苧麻(liu等2014)中都有相關(guān)報(bào)道。wang等(2012)利用陸地棉和海島棉構(gòu)建了105個(gè)漸滲系，用278個(gè)多態(tài)性標(biāo)記鑒定，導(dǎo)入片段長(zhǎng)度333.5cm，覆蓋染色體片段的6.7％。對(duì)漸滲系材料各個(gè)性狀和多態(tài)性標(biāo)記間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，有40對(duì)ssr標(biāo)記關(guān)聯(lián)到5個(gè)纖維品質(zhì)相關(guān)性狀，平均貢獻(xiàn)率：6.31％。wang等(2012)構(gòu)建了以陸地棉(tm-1)為背景，海島棉(h7124)為供體親本的漸滲系，共有169個(gè)家系，單片段導(dǎo)入系有51個(gè)，占30.18％，在bc5群體中檢測(cè)到23個(gè)顯著性標(biāo)記，其中纖維品質(zhì)的17個(gè)，產(chǎn)量組分(單鈴重和衣分)6個(gè)。在bc5s1群體中檢測(cè)到27顯著性標(biāo)記，其中纖維品質(zhì)的22個(gè)，產(chǎn)量組分(單鈴重和衣分)5個(gè)。在csil群體中檢測(cè)到14個(gè)顯著性標(biāo)記，其中纖維品質(zhì)的12個(gè)，產(chǎn)量組分(單鈴重和衣分)2個(gè)。cao等(2014)已利用由陸地棉tm-1(輪回親本)和海7124(非輪回親本)構(gòu)建的染色體片段置換系進(jìn)行了分子育種的實(shí)踐，利用4個(gè)含海島棉優(yōu)異纖維品質(zhì)qtls的導(dǎo)入系(il019-d6-1，il019-a2-6，il088-a7-3和il040-a4-1)改良了四個(gè)新疆早熟棉品種(系)(新陸早26、新陸早41、新陸早42和0768)的纖維品質(zhì)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)能顯著提高海島棉鈴重的陸地棉染色體片段。本發(fā)明的另一目的是提供該陸地棉染色體片段a1-6的ssr分子標(biāo)記引物。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一個(gè)能顯著提高海島棉鈴重的陸地棉染色體片段a1-6，此陸地棉染色體片段a1-6來(lái)自于陸地棉品種tm-1，通過(guò)4個(gè)ssr標(biāo)記：bnl2440185，nau2437235，nau3901245，dpl0526260標(biāo)記；使用所述的4個(gè)ssr標(biāo)記引物擴(kuò)增陸地棉品種tm-1基因組dna，同時(shí)含有4個(gè)分子標(biāo)記目的片段的染色體片段即為陸地棉染色體片段a1-6；所述的4個(gè)ssr標(biāo)記引物及擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度如下：bnl2440185的正向引物序列為seqidno.1，反向引物序列為seqidno.2，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為185bp的dna片段；nau2437235的正向引物序列為seqidno.3，反向引物序列為seqidno.4，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為235bp的dna片段；nau3901245的正向引物序列為seqidno.5，反向引物序列為seqidno.6，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為245bp的dna片段；dpl0526260的正向引物序列為seqidno.7，反向引物序列為seqidno.8，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為260bp的dna片段。本發(fā)明所述的陸地棉染色體片段a1-6在提高棉花鈴重育種中的應(yīng)用。利用本發(fā)明染色體片段a1-6獲得鈴重顯著提高的陸地棉導(dǎo)入系il-a1-6的方法，包含以下步驟：(1)海島棉品種新海25(♂)和陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系tm-1(♀)雜交產(chǎn)生f1代，然后以新海25為輪回親本，回交3次，自交4次產(chǎn)生bc3s4種子。(2)種植bc3s4種子產(chǎn)生植株，應(yīng)用ctab法提取dna，采用分子標(biāo)記引物對(duì)bnl2440185，nau2437235，nau3901245，dpl0526260進(jìn)行pcr擴(kuò)增，各分子標(biāo)記的引物及擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度如下：bnl2440185的正向引物序列為seqidno.1，反向引物序列為seqidno.2，在陸地棉品種tm-1中可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為185bp的dna片段；nau2437235的正向引物序列為seqidno.3，反向引物序列為seqidno.4，在陸地棉品種tm-1中可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為235bp的dna片段；nau3901245的正向引物序列為seqidno.5，反向引物序列為seqidno.6，在陸地棉品種tm-1中可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為245bp的dna片段；dpl0526260的正向引物序列為seqidno.7，反向引物序列為seqidno.8，在陸地棉品種tm-1中可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為260bp的dna片段。選擇同時(shí)含有4個(gè)分子標(biāo)記位點(diǎn)(分子量分別是185bp；235bp；245bp；260bp)的染色體片段即為海島棉染色體片段a1-6；(3)將含有該染色體片段的導(dǎo)入系il-a1-6，分別于2013年和2014年種植在新疆阿克蘇地區(qū)和巴音郭楞蒙古自治州庫(kù)爾勒市試驗(yàn)基地，種植兩行，行長(zhǎng)2米，膜寬0.75米，三次重復(fù)，同時(shí)種植tm-1和新海25，待棉花收取每行材料的25個(gè)棉鈴，稱重，計(jì)算單鈴重。經(jīng)過(guò)實(shí)際測(cè)量后得出的數(shù)據(jù)是：含有陸地棉染色體片段a1-6的導(dǎo)入系il-a1-6的鈴重為4.00-4.51g，輪回親本新海25的鈴重3.48-3.90g。本發(fā)明所述的分子標(biāo)記引物在篩選陸地棉染色體片段a1-6以提高棉花鈴重中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用優(yōu)選使用所述的4個(gè)ssr標(biāo)記引物擴(kuò)增陸地棉品種tm-1基因組dna，同時(shí)含有4個(gè)分子標(biāo)記擴(kuò)增的目的片段的即為陸地棉染色體片段a1-6，選擇含有陸地棉染色體片段a1-6的材料留種。一種篩選陸地棉染色體片段a1-6的方法，包括使用所述的4個(gè)ssr標(biāo)記引物擴(kuò)增陸地棉品種tm-1基因組dna，同時(shí)含有4個(gè)分子標(biāo)記擴(kuò)增的目的片段的染色體片段即為陸地棉染色體片段a1-6。有益效果1、本發(fā)明所提供了一個(gè)顯著提高棉花鈴重的陸地棉染色體片段a1-6，利用該染色體片段能夠培育得到一個(gè)能顯著提高海島棉鈴重的陸地棉染色體片段導(dǎo)入系il-a1-6，經(jīng)過(guò)2年2點(diǎn)的3次重復(fù)試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)該染色體片段能顯著提高海島棉鈴重，兩年兩點(diǎn)分別比對(duì)照新海25增加12.64％和12.86％(表2)。因此il-a1-6染色體片段導(dǎo)入系中的海島棉染色體片段能顯著提高海島棉鈴重，在海島棉育種中有重要意義。2、本發(fā)明所提供的海島棉染色體片段a1-6的4個(gè)ssr分子標(biāo)記及其引物能提高海島棉鈴重的選擇效率(圖1)。分子標(biāo)記輔助目標(biāo)片段選擇，可加快新品種培育進(jìn)程。附圖說(shuō)明圖14個(gè)ssr引物在新海25和tm-1中的擴(kuò)增位點(diǎn)具體實(shí)施方式實(shí)施例1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所以海島棉新海25為輪回親本，陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系tm-1品種為供體親本(非輪回親本)，回交3次，自交4次產(chǎn)生bc3s4種子。bc3s4植株，每株采集3-4片未展開(kāi)的葉片放入1.5ml的離心管中，并加入預(yù)冷的新鮮配制的提取緩沖液600μl，用研磨儀研磨，應(yīng)用ctab法(patersonah,brubakercl,wendeljf.arapidmethodforextractionofcotton(gossypiumspp.)genomicdnasuitableforrflporpcranalysis[j].plantmolecularbiologyreporter,1993,11(2):122-127.)提取dna，用ssr引物bnl2440，nau2437，nau3901，dpl0526(表1)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增體系10μl，dna模板1μl，94℃預(yù)變性5min，94℃變性0.5min，57℃復(fù)性0.5min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：凝膠濃度為8％，電泳緩沖液為0.5倍tbe，220v恒壓電泳1小時(shí)。選擇同時(shí)含有4個(gè)分子標(biāo)記條帶(在tm-1中分子量分別是185bp；235bp；245bp；260bp)的染色體片段即為陸地棉染色體片段a1-6。表1a1-6染色體片段上的ssr分子標(biāo)記注:bnl編號(hào)的引物來(lái)自美國(guó)researchgenetics公司(http://www.resgen.com)；nau編號(hào)的引物由本實(shí)驗(yàn)室從est-ssr序列中開(kāi)發(fā)(zhaol,yuandal,caipingc,etal.towardallotetraploidcottongenomeassembly:integrationofahigh-densitymoleculargeneticlinkagemapwithdnasequenceinformation[j].bmcgenomics,2012,13(1):539.).dpl編號(hào)的引物來(lái)自美國(guó)monsanto公司(http://www.monsanto.com)。所有的引物信息可以從網(wǎng)站www.cottonmarker.org上下載。將含有該染色體片段的導(dǎo)入系il-a1-6，分別于2013年和2014年種植在新疆阿克蘇地區(qū)和庫(kù)爾勒市試驗(yàn)基地，種植兩行，行長(zhǎng)2米，膜寬0.75米，三次重復(fù)，同時(shí)種植tm-1和新海25，待棉花吐絮，收取每行材料的25個(gè)棉鈴，稱重，計(jì)算單鈴重。經(jīng)過(guò)實(shí)際測(cè)量后得出的數(shù)據(jù)是：含有陸地棉染色體片段a1-6的導(dǎo)入系il-a1-6的鈴重為4.00-4.51g，輪回親本新海25的鈴重3.48-3.90g，含有陸地棉染色體片段a1-6的導(dǎo)入系il-a1-6的鈴重比對(duì)照新海25分別增加12.64％和12.86％。因此a1-6的陸地棉染色體片段應(yīng)用于棉花分子育種，能顯著地提高海島棉鈴重。表2導(dǎo)入系a1-6在不同年份、不同環(huán)境中鈴重表現(xiàn)sequencelisting<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一個(gè)能顯著提高海島棉鈴重的陸地棉染色體片段及其ssr標(biāo)記引物和應(yīng)用<160>8<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列<223>分子標(biāo)記bnl2440正向引物<400>1tgttaagcatacattagtttcactcg26<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<223>分子標(biāo)記bnl2440反向引物<400>2ccggcaccacaaaagtaaat20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<223>分子標(biāo)記nau2437正向引物<400>3cttggaaaaaggaagagcag20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<223>分子標(biāo)記nau2437反向引物<400>4ttaaaagaccaaaggcaagg20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<223>分子標(biāo)記nau3901正向引物<400>5aagacaaaaggcaaggacac20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<223>分子標(biāo)記nau3901反向引物<400>6cttggaaaaaggaagagcag20<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列<223>分子標(biāo)記dpl0526正向引物<400>7gttcttggtcatgctggtaagaaa24<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<223>分子標(biāo)記dpl0526反向引物<400>8tagccatatccaccttagcagatt24當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12