本發(fā)明涉及醫(yī)學分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，是一種將血漿中的microrna作為生物標志物用于急性高山病的診斷。

背景技術(shù)：

急性高山病(acutemountainsickness，ams)，又稱作急性輕癥高原反應(yīng)，是人對高原自然環(huán)境未適應(yīng)而產(chǎn)生的頭痛，食欲減退，惡心，眩暈和疲勞等機體反應(yīng)。是急進高原人群中最常見的高原特發(fā)疾病?，F(xiàn)有研究由于人群年齡，進入高原海拔高度，速度以及ams診斷方法的不同，ams的發(fā)病率為16-100％(macinnismjetal.(2013)aprospectiveepidemiologicalstudyofacutemountainsicknessinnepalesepilgrimsascendingtohighaltitude(4380m)，《plosone》，8(10)，e75644.，mcdevittmetal.(2014)riskdeterminantsofacutemountainsicknessintrekkersinthenepalihimalaya：a24-yearfollow-up，《wildernessenvironmed》，25(2)，152-9.，gaillardsetal.(2004)awareness，prevalence，medicationuse，andriskfactorsofacutemountainsicknessintouriststrekkingaroundtheannapurnasinnepal：a12-yearfollow-up，《highaltmedbiol》，5(4)，410-9.)，在隨機對照研究中，ams的中位發(fā)病率為60％(waeberbetal.(2015)impactofstudydesignonreportedincidencesofacutemountainsickness：asystematicreview，《highaltmedbiol》，16(3)，204-15.)，是影響急進高原人群生活和工作的一個主要障礙。ams如果沒有得到及時有效的控制，可能進展為具有高致死率的高原腦水腫進而危及生命(basnyatbandmurdochdr(2003)high-altitudeillness，《lancet》，361(9373)，1967-74.)。

盡管近年來對ams的診斷進行了大量的研究，現(xiàn)階段國內(nèi)外對ams的診斷主要依據(jù)患者所表現(xiàn)出的相關(guān)臨床癥狀的嚴重程度進行評分診斷，現(xiàn)有的癥狀評分診斷系統(tǒng)有1980年提出的環(huán)境癥狀問卷計分診斷系統(tǒng)、1991年提出的中華人民共和國國家軍用標準gjb1098-91、1993年加拿大路易斯湖國際診斷標準以及1995年中華醫(yī)學會在國家軍用標準基礎(chǔ)上制定的急性輕癥高原病癥狀分度與評分系統(tǒng)。由于癥狀評分存在較大的主觀性，因此尋找更加可靠的客觀性診斷指標成為ams診斷的又一研究熱點。

microrna是一類廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性小分子非編碼rna，長度為18～24個核苷酸。microrna通過轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達，調(diào)控細胞分化、增殖、凋亡等生命活動，在胚胎發(fā)育、機體代謝、疾病發(fā)生發(fā)展等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。近年來，研究人員在血液、唾液、尿液等多種體液中檢測到microrna，提出循環(huán)microrna的概念。并且，microrna的表達水平的高低和其遺傳基因的差異性高度相關(guān)，大量研究表明，循環(huán)microrna對腫瘤、高血壓、卒中及一系列疾病的提前診斷和發(fā)病預(yù)測都有很好的特異性和敏感性。再者血液等體液標本易于獲得，臨床可操性強且創(chuàng)傷性小，而且循環(huán)microrna穩(wěn)定性好，檢測便利，因此，循環(huán)microrna具有作為ams無創(chuàng)性生物標志物的潛能。

而關(guān)于循環(huán)microrna與ams發(fā)病之間的相關(guān)性，尚未見報道。

更未見一種用于檢測血漿中的microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-193b-5p表達水平來診斷ams發(fā)病的報道。同樣，3者聯(lián)合診斷亦未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種用于檢測ams的microrna標志物，通過檢測被測者血清或者血漿中microrna-676-3p、microrna-181b-5p和microrna-193b-5p的含量，并與正常人血清或者血漿中的microrna-676-3p、microrna-181b-5p和microrna-193b-5p的水平進行分別比較來診斷ams，該microrna的靈敏度和精確度高

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是：一種診斷ams的microrna標志物，所述標志物為及特征序列如下：

microrna-676-3p：cuguccuaagguuguugaguu

microrna-181b-5p：aacauucauugcugucggugggu

microrna-193b-5p：cgggguuuugagggcgagauga

本發(fā)明的有益效果是：篩查出的microrna標志物，用于檢測ams的精確度和靈敏度高。

更進一步的，在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進。

本發(fā)明還包括一種診斷ams的microrna標志物在制備ams診斷試劑中的用途。

附圖說明

圖1.ams發(fā)病者和健康對照的血漿中目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-193b-5p)表達水平(即與cel-mir-39相比目的microrna的歸一化水平)。

其中ams是ams發(fā)病者、non-ams為健康對照。*：p＜0.05，即有顯著統(tǒng)計學差異，**：p＜0.01，即有極顯著統(tǒng)計學差異，***：p＜0.001，即有極顯著統(tǒng)計學差異。

圖2為ams患者血漿3個目的microrna單獨用于診斷的的工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，簡稱roc曲線)，該圖中的很好的顯示了ams發(fā)病者的roc曲線、曲線下面積(areaunderthecurve，auc)、靈敏性(sensitivity)、特異性(specificity)，其中auc反映了診斷效能(auc＝0.5，沒有診斷學效能；0.5＜auc＜0.7很小的診斷價值；0.7＜auc＜0.9相當準確的診斷價值；0.9＜auc＜1，很準確的診斷價值)。

圖3為ams患者血漿3個目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-193b-5p)聯(lián)合診斷的的工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，簡稱roc曲線)，該圖中的很好的顯示了ams發(fā)病者的roc曲線、曲線下面積(areaunderthecurve，auc)、靈敏性(sensitivity)、特異性(specificity)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行描述，所列舉的實施例僅僅是用來解釋本發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1血漿標本目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-193b-5p)的表達與ams發(fā)病的相關(guān)性研究。

一、材料與標本收集描述

ams患者血漿標本收集自急進高原人群中的ams患者，合計37例。正常人群的血漿標本收集自急進高原人群中的正常健康人群，合計31例。ams的診斷是通過國際通用診斷標準-路易斯湖評分來確認的。ams患者在取血之前沒有服用任何藥物。每個樣本用edta-na抗凝管合計收集2ml血液。

二、樣品處理和rna提取

在靜脈血采集后10min內(nèi)，在3000×g，25攝氏度下離心10分鐘之后，用無rna酶和無細菌的吸頭取上層血漿于無rna酶和無細菌的ep管中-80℃保存?zhèn)溆?。血漿中的rna通過德國凱杰技術(shù)有限公司的血漿microrna柱式抽提試劑盒(mirneasyserum/plasmakit，貨號：217184)按照說明書操作步驟進行提取和純化。

三、實時熒光定量pcr(sybr染料法)

運用中國上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司的microrna實時熒光定量pcr試劑盒(hairpin-ittmmirnasrt-pcrquantitationkit，貨號：e01008)對目的microrna和外參cel-mir-39進行擴增；分別得到ct值(cyclethreshold)，通過公式：表達量＝2^{ct(cel-mir-39)-ct(目的microrna)}在分別計算每例標本的目的microrna的表達水平，具體操作過程見說明書。每個樣本重復(fù)三次實驗。目的microrna和cel-mir-39引物序列見表3.

四、統(tǒng)計分析方法。

運用統(tǒng)計學軟件spss19.0進行統(tǒng)計。正態(tài)性檢驗采用shapiro-wilk法，顯著性差異用mann-whitney檢驗(mann-whitneytest)，工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，簡稱roc曲線)及線下面積(areaunderthecurve，auc)用于評價目的microrna的診斷效能。當p＜0.05時認為有統(tǒng)計學差異。

運用二元logistic回歸，建立目的microrna的相關(guān)方程，得到預(yù)測概率p，并以預(yù)測概率p為檢驗變量進行roc曲線分析，繼而評價目的microrna聯(lián)合運用的診斷效能。當p＜0.05時認為有統(tǒng)計學差異。

五、結(jié)果分析

1.microrna-3591-3p在ams及正常人群中的表達

如圖1所示，與外參cel-mir-39的水平相比的血漿目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-193b-5p)的歸一化水平在ams發(fā)病組和正常人群組之間具有顯著性差異(p＜0.001)。

2.ams中目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-193b-5p)的水平都可以作為作為生物標志物的診斷值，且聯(lián)合診斷效能優(yōu)于單獨使用。

ams患者血漿目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-193b-5p)單獨作為生物標志物的診斷效能通過roc曲線(圖2)可知。ams患者血漿microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-193b-5p單獨作為生物標志物的診斷表現(xiàn)良好，其auc分別為：0.713(95％ci，0.588-0.838)、0.735(95％ci，0.614-0.855)、0.650(95％ci，0.519-0.780)。

3.microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-193b-5p聯(lián)合運用的診斷效能優(yōu)于單獨運用，作為生物標志物的診斷效能通過roc曲線(圖3)可知其auc為0.804(95％ci，0.703-0.905)。

六、結(jié)論

血中microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-193b-5p的水平可以作為生物標志物來篩查和診斷ams，并且聯(lián)合運用診斷效能優(yōu)于單獨使用。

表1ams發(fā)病組和健康對照組中血漿目的microrna的表達水平

**ams發(fā)病組vs健康對照組：p＜0.01，數(shù)據(jù)以中位數(shù)(25％-75％分位數(shù))表

表2microrna基本信息

表3目的和cel-mir-39引物信息