本發(fā)明屬于藥物合成領(lǐng)域，涉及映-三白草酮類衍生物及其制備方法以及在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，尤其是映-三白草酮類衍生物在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物方面的應(yīng)用或在制備抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)腫瘤，通過(guò)各種轉(zhuǎn)移方式到達(dá)繼發(fā)組織或器官后得以繼續(xù)增殖生長(zhǎng)，形成與原發(fā)腫瘤相同性質(zhì)的繼發(fā)腫瘤的全過(guò)程。癌轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，同時(shí)也是臨床上絕大多數(shù)腫瘤患者的致死因素。目前國(guó)內(nèi)沒有專門抑制癌轉(zhuǎn)移的藥物上市，尋求開發(fā)新型抗癌轉(zhuǎn)移藥物刻不容緩。

腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移現(xiàn)象主要包括以下十一個(gè)步驟：1.腫瘤細(xì)胞降解基底膜，侵襲周圍組織。2.腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)瘤。3.腫瘤細(xì)胞向周圍侵襲、遷移。4.腫瘤細(xì)胞侵入血管或淋巴管。上述四個(gè)步驟可以作為一個(gè)階段，即入血管前的階段。5.腫瘤細(xì)胞在血液、淋巴循環(huán)中運(yùn)行。6.腫瘤細(xì)胞在血液、淋巴循環(huán)中存活。由于血液里有一些免疫細(xì)胞和免疫因子，以及血液的剪切力等，因此并不太容易存活，有大量的細(xì)胞侵入，只有少部分能夠存活，存活下來(lái)的細(xì)胞才能繼續(xù)轉(zhuǎn)移。7.腫瘤細(xì)胞在靶部位與血管內(nèi)皮黏附。這三個(gè)步驟為在血管里的階段。8.腫瘤細(xì)胞穿出血管。9.腫瘤細(xì)胞與實(shí)質(zhì)器官組織黏附、生長(zhǎng)形成繼發(fā)瘤。10.繼發(fā)瘤向周圍侵襲。11.全身轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。最后四個(gè)步驟為穿出血管后的階段。其中，最可怕是最后的兩個(gè)步驟，即形成轉(zhuǎn)移瘤并全身轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。

映-三白草酮，是從三白草中分離純化出的一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的木脂素。分子式：C₂₀H₂₀O₆，分子量：356，性狀：白色晶體，其結(jié)構(gòu)式如下：

目前對(duì)于映-三白草酮的相關(guān)研究主要集中在抗炎，肝保護(hù)等方面。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一系列映-三白草酮類衍生物。

本發(fā)明的目的可通過(guò)以下措施來(lái)達(dá)到：

如式I所示的映-三白草酮類衍生物：

其中，n＝1-5。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述的映-三白草酮類衍生物為：2′-亞胺基-氧-乙酰羥胺-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-丙酰羥胺-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-丁酰羥胺-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-戊酰羥胺-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-己酰羥胺-映-三白草酮。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供式I所示的映-三白草酮類衍生物的制備方法，包括：以映-三白草酮為原料，與鹽酸羥胺(hydroxylamine hydrochioride)溶于吡啶(pyridine)溶劑中加熱回流反應(yīng)生成2′-肟基-映-三白草酮，在冰浴條件下，將2′-肟基-映-三白草酮與Br(CH₂)_nCOOCH₂CH₃(n＝1-5)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入氫化鈉(NaH)作為縛酸劑，反應(yīng)得到黃色粘稠物，將其溶于二氯甲烷/甲醇(1∶1V/V)混合溶劑中，加入鹽酸羥胺和氫氧化鈉(NaOH)，室溫反應(yīng)過(guò)夜，生成2′-亞胺基-氧-乙酰羥胺-映-三白草酮，其反應(yīng)式為：

所述的映-三白草酮與鹽酸羥胺的摩爾比為1∶1～2，優(yōu)選為1∶1.5。

所述的2′-肟基-映-三白草酮、氫化鈉、Br(CH₂)_nCOCH₂CH₃、鹽酸羥胺、氫氧化鈉的摩爾比為1∶1～3∶1～2∶1～3∶1～3，優(yōu)選為1∶2∶1.5∶2∶2.5。其中氫氧化鈉作為縛酸劑中和鹽酸羥胺中的鹽酸。

進(jìn)一步的，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液減壓濃縮，采用硅膠柱層析、以二氯甲烷/甲醇＝30∶1V/V為洗脫液進(jìn)行洗脫，得到式I所示的目標(biāo)化合物。

發(fā)明人細(xì)胞模型篩選實(shí)驗(yàn)，對(duì)合成的映-三白草酮類衍生物進(jìn)行了體外人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、HCCLM3細(xì)胞的細(xì)胞毒活性測(cè)試，化合物均表現(xiàn)出很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，且明顯強(qiáng)于姜黃素和映-三白草酮。進(jìn)一步對(duì)合成的衍生物以非細(xì)胞毒劑量進(jìn)行抗癌細(xì)胞遷移、侵襲活性測(cè)試，結(jié)果表明化合物在極低濃度下對(duì)SMMC-7721細(xì)胞表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制遷移、侵襲能力，具有明顯的抑制作用，且明顯強(qiáng)于映-三白草酮。

因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供式I所示的映-三白草酮類衍生物在制備治療腫瘤藥物方面的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述的應(yīng)用為在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物方面的應(yīng)用或所述的應(yīng)用為在制備抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物方面的應(yīng)用。所述的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移指腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲。

所述的腫瘤為肝癌。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明以活性成分映-三白草酮為先導(dǎo)，合成了一系列映-三白草酮類衍生物，合成的映-三白草酮類衍生物在抑制細(xì)胞增殖和抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面表現(xiàn)出極強(qiáng)的活性，有望成為治療腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面的新型候選藥物。

附圖說(shuō)明

圖1為化合物對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。

圖2為化合物抑制癌細(xì)胞遷移能力的測(cè)試結(jié)果量化分析圖。

圖3為化合物對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。

圖4為化合物抑制癌細(xì)胞侵襲能力的測(cè)試結(jié)果量化分析圖。

具體實(shí)施方式

結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1 2′-亞胺基-氧-乙酰羥胺-映-三白草酮(化合物1)的制備

在50mL單頸瓶中加入映-三白草酮350mg(0.010mol)，鹽酸羥胺100mg(0.015mol)，吡啶5mL，攪拌溶解，加熱回流10h。反應(yīng)液降至室溫，減壓回收溶劑，殘?jiān)?0mL水混懸，用二氯甲烷萃取3次，每次10mL。合并有機(jī)層，無(wú)水Na₂SO₄干燥，濃縮二氯甲烷，得粘稠狀物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷洗脫，得白色粉末結(jié)晶210mg，產(chǎn)率58.3％。經(jīng)鑒定為2′-肟基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：372.2[M+H]⁺相對(duì)分子質(zhì)量：371.2。

¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.94(1H，s)，6.87(1H，s)，6.40(1H，s)，6.34(1H，s)，5.95(1H，s)，5.90(1H，s)，5.61(1H，s)，5.54(1H，s)，3.09(1H，d，J＝3Hz)，2.81(1H，s)，2.51(1H，d，J＝6Hz)，2.30(1H，m)，1.91(1H，m)，1.88(1H，m)，1.68(1H，s)，1.24(3H，d，J＝6Hz)，0.77(3H，d，J＝6Hz)。

將2′-肟基-映-三白草酮200mg(0.540mmol)溶解在5mL DMF中，冰浴下加入氫化鈉12.9mg(1.080mmol)，溴乙酸乙酯65.6μL(0.594mmol)，攪拌反應(yīng)2h，TLC監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用10mL二氯甲烷/甲醇混合溶劑將其溶解，加入鹽酸羥胺74.9mg(1.08mmol)，氫氧化鈉43.1mg(1.08mmol)，室溫反應(yīng)過(guò)夜。TLC監(jiān)測(cè)至反應(yīng)結(jié)束，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝30∶1V/V洗脫，得黃色油狀物52.6mg，產(chǎn)率22.0％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-乙酰羥胺-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：467.2[M+Na]⁺，相對(duì)分子質(zhì)量為444.2

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.85(1H，s)，6.49(1H，s)，6.18(1H，s)，5.93(1H，s)，5.89(1H，s)，5.61(1H，s)，5.54(1H，s)，4.65(2H，s)，3.09(1H，d，J＝3Hz)，2.77(1H，m)，2.50(1H，m)，2.30(1H，m)，1.97(1H，m)，1.89(1H，m)，1.69(1H，m)，1.25(3H，d，J＝6Hz)，0.76(3H，d，J＝6Hz).

實(shí)施例2化合物體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法)

1、實(shí)驗(yàn)方法

(1)細(xì)胞株及試劑

人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；

人肝癌細(xì)胞株HCCLM3，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；

高糖DMEM培養(yǎng)液，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；

胎牛血清，購(gòu)自杭州四季青公司；

胰酶細(xì)胞消化液，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；

噻唑藍(lán)(MTT)，購(gòu)自sigma公司。

PBS緩沖鹽溶液：磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)0.27g，磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄)1.42g，氯化鈉(NaCl)8g，氯化鉀(KCl)0.2g，加去離子水約800mL充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1L，高溫高壓滅菌后置于4℃冰箱保存待用。

(2)受試藥品溶液

以姜黃素對(duì)照藥，姜黃素、映-三白草酮、化合物1分別用DMSO溶解配制成80mM的溶液，用高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋為80μM的母液，在此基礎(chǔ)上依次用高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋得80，60，40，20，10，5，2.5，1，0.5μM的受試藥品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，HCCLM 3在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5％CO₂保持飽和濕度培養(yǎng)，2-3天傳代一次。

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期癌細(xì)胞一瓶，加入胰酶細(xì)胞消化液消化，使貼壁細(xì)胞脫落，配制成濃度為5×10⁴個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液(每孔5×10³個(gè)細(xì)胞)，板置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖鹽溶液清洗2次，受試組每孔加入100μL相應(yīng)的含不同濃度受試藥品溶液的高糖DMEM培養(yǎng)液；陰性對(duì)照組只加等量高糖DMEM培養(yǎng)液。

96孔板置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO溶解，搖床10分鐘輕輕混勻；每孔的吸光度(OD值)用1500酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算抑制率和IC₅₀值。

抑制率(％)＝(陰性對(duì)照組OD值-受試組OD值)/陰性對(duì)照組OD值×100％

應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件計(jì)算IC₅₀。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1化合物1對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活力測(cè)試結(jié)果

由表1可知，與姜黃素和映-三白草酮相比，化合物1對(duì)肝癌SMMC-7721，HCCLM3細(xì)胞表現(xiàn)出非常強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用，且明顯強(qiáng)于姜黃素和映-三白草酮。

實(shí)施例3體外細(xì)胞水平檢測(cè)化合物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721遷移能力的影響

1、實(shí)驗(yàn)方法

運(yùn)用細(xì)胞劃痕法，以姜黃素作、映-三白草酮為對(duì)照藥，對(duì)姜黃素、映-三白草酮、以及化合物1進(jìn)行體外抗肝癌細(xì)胞SMMC-7721遷移活性篩選。具體實(shí)驗(yàn)步驟為：用marker筆在6孔板背后，用直尺比著均勻的劃?rùn)M線；將培養(yǎng)在含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)單層細(xì)胞至100％，使用無(wú)菌槍頭(100μL)尖端比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜；用PBS清洗細(xì)胞3次，棄去劃下的細(xì)胞，分別加入20μmol/L姜黃素，20μmol/L映-三白草酮和2μmol/L化合物1受試藥品溶液，并設(shè)置不加藥物的對(duì)照孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，放在光學(xué)顯微鏡上于固定位置取樣，拍照，記錄劃痕兩端細(xì)胞間距的變化。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1和圖2表明，與20μmol/L姜黃素和20μmol/L映-三白草酮相比，2μmol/L化合物1在極低濃度下表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞遷移能力，且明顯強(qiáng)于姜黃素和映-三白草酮。

實(shí)施例4體外細(xì)胞水平檢測(cè)化合物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721侵襲能力的影響

1、實(shí)驗(yàn)方法

(1)準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)前將凍存在-20℃的BD Matrigel基質(zhì)膠置入4℃的冰箱內(nèi)過(guò)夜，讓其融化成液體狀態(tài)備實(shí)驗(yàn)用。

(2)包被基底膜：Transwell小室上室內(nèi)層的底部膜面用50mg/L Matrigel 1∶30稀釋液(用DMEM培養(yǎng)基稀釋，60μL)包被，常溫條件下晾干。

(3)水化基底膜：棄去培養(yǎng)板中的液體，給每孔中加入高糖DMEM培養(yǎng)液100μL，37℃恒溫孵箱中放置30min。

(4)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，用胰酶細(xì)胞消化液消化收集，放入4℃離心機(jī)以800rpm離心5min，然后加入高糖DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10⁵個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液。

(5)細(xì)胞計(jì)數(shù)：使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)：將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片用75％灑精消毒擦凈，待其干燥后將蓋玻片放在計(jì)數(shù)室上。用微量加樣器吸取細(xì)胞懸液后于計(jì)數(shù)板上蓋玻片一端將細(xì)胞懸液注入其下方的計(jì)數(shù)室內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡，在顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。將計(jì)數(shù)結(jié)果套入如下公式計(jì)算出細(xì)胞密度：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000×稀釋倍數(shù)

(6)在Transwell小室上室中接種細(xì)胞懸液100μL。分別給24孔板內(nèi)加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液或藥液600μL，將Transwell小室置于其中，放入37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。

(7)取出小室，吸出上室內(nèi)殘余的液體，用PBS淋洗，然后4％多聚甲醛固定30min，接著用4g/L的結(jié)晶紫溶液染色15min后再用PBS緩沖鹽溶液淋洗。最后用PBS緩沖鹽溶液浸濕的棉簽小心擦去小室內(nèi)部微孔膜上的細(xì)胞。

(8)在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(200×)進(jìn)行拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

(9)統(tǒng)計(jì)方法：計(jì)數(shù)時(shí)，每空選取5個(gè)視野分別計(jì)數(shù)，取平均值。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3表示抑制細(xì)胞侵襲活性隨著映-三白草酮和化合物1濃度的上升而呈現(xiàn)梯度增強(qiáng)，即化合物對(duì)細(xì)胞侵襲呈現(xiàn)出濃度依賴性的抑制活性。圖4表示映-三白草酮和化合物1抑制癌細(xì)胞侵襲能力測(cè)試結(jié)果量化分析?；衔?在極低濃度下表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞侵襲能力，且明顯強(qiáng)于映-三白草酮。