本發(fā)明涉及寄生蟲區(qū)分及檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測(cè)和區(qū)分多種以犬為終末宿主的常見大中型絳蟲的檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

寄生于畜禽的絳蟲種類多、數(shù)量大，隸屬于扁形動(dòng)物門(Platyhelminthes)絳蟲綱(Cestoidea)，其中只有圓葉目(Cyclophyllidea)和假葉目(Pseudophyllidea)絳蟲對(duì)畜禽和人具有感染性。絳蟲的分布極其廣泛，成蟲和中絳期(Metacestode)幼蟲 - 絳蟲蚴都能對(duì)人、畜造成嚴(yán)重的危害，引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。成蟲寄生于脊椎動(dòng)物，幼蟲主要寄生于脊椎動(dòng)物，也可寄生于無(wú)脊椎動(dòng)物，如圓葉目有多種絳蟲是以犬為終末宿主的。隸屬于圓葉目帶科的多頭帶絳蟲 (T. multiceps,Tm)、棘球絳蟲（Echinococcus）等是重要的人獸共患寄生蟲，可分別引起人類或家畜的腦包蟲病（cenuriasis）和肝肺包蟲?。╤ydatid disease），對(duì)人類健康造成巨大危害，并嚴(yán)重阻礙畜牧業(yè)的發(fā)展。

多頭帶絳蟲、泡狀帶絳蟲 (T. hydatigena, Th)、豆?fàn)顜Ы{蟲 (T. pisiformis, Tp)等絳蟲是常見的以犬科動(dòng)物為終末宿主的大型絳蟲。其中，多頭帶絳蟲和泡狀帶絳蟲的幼蟲，即腦多頭蚴和細(xì)頸囊尾蚴可寄生于人和牛、羊、豬等多種動(dòng)物，豆?fàn)顜Ы{蟲的幼蟲，即豆?fàn)钅椅豺手饕纳谕米拥膬?nèi)臟引起豆?fàn)钅椅豺什?，這三種絳蟲的成蟲均寄生在犬等犬科動(dòng)物的小腸內(nèi)，蟲卵隨糞便排出，污染食物、飲水和周圍環(huán)境，構(gòu)成主要傳染源。犬科動(dòng)物通過(guò)采食含蚴的動(dòng)物臟器而感染，人在誤食蟲卵后感染而發(fā)病。

犬復(fù)孔絳蟲 （Dipylidium caninum, Dc）是犬和貓的常見寄生蟲。偶可感染人體，引起復(fù)孔絳蟲病。 成蟲為中型絳蟲，長(zhǎng)10～15cm，寬0.3～0.4cm。成蟲寄生于犬、貓的小腸內(nèi)，其孕節(jié)單獨(dú)或數(shù)節(jié)相連地從鏈體脫落，隨糞便排出，并沿地面蠕動(dòng)。節(jié)片破裂后蟲卵散出，如被中間宿主蚤類的幼蟲食入，則在其腸內(nèi)孵出六鉤蚴，然后鉆過(guò)腸壁，進(jìn)入血腔內(nèi)發(fā)育。約在感染后30天，當(dāng)蚤幼蟲經(jīng)蛹羽化為成蟲時(shí)發(fā)育成似囊尾蚴。隨著成蚤到終末宿主犬、貓?bào)w表活動(dòng)似囊尾蚴進(jìn)一步成熟。一個(gè)蚤體內(nèi)的似囊尾蚴可多達(dá)56個(gè)，受染的蚤活動(dòng)遲緩，甚至很快死亡。當(dāng)終末宿主犬、貓?zhí)蛎珪r(shí)病蚤中的似囊尾蚴得以進(jìn)入，然后在其小腸內(nèi)釋出，經(jīng)2～3周，發(fā)育為成蟲。人體感染常因與貓、犬接觸時(shí)誤食病蚤引起。犬櫛首蚤、貓櫛首蚤和致癢蚤是重要的中間宿主。

多種絳蟲在同一地區(qū)混合分布或流行，有時(shí)也存在混合感染的情況。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)流行區(qū)終末宿主這幾種絳蟲的感染情況和對(duì)感染動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)制驅(qū)蟲，對(duì)控制絳蟲病的流行、綜合防控措施實(shí)施和防治效果的評(píng)價(jià)等都具有十分重要的意義。

目前，已建有對(duì)絳蟲感染犬進(jìn)行單一檢測(cè)的方法，包括常規(guī)檢測(cè)法（檳榔堿導(dǎo)瀉法和剖檢法)、DNA-PCR檢測(cè)法和ELISA檢測(cè)方法。Al-Sabi, M. N., Kapel, C. M. Multiplex PCR identification of Taenia spp. in rodents. Parasitol Res, 2011, 109(5):1293-1298. 安曉雪，等. 多頭帶絳蟲Tm7基因的表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的建立. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011, 42(9):1302-1308。

上述方法中，常規(guī)檢測(cè)法具有感染人和污染周圍環(huán)境的危險(xiǎn)，其它幾種方法均無(wú)法在一個(gè)反應(yīng)內(nèi)對(duì)多種絳蟲（多頭帶絳蟲、泡狀帶絳蟲、豆?fàn)顜Ы{蟲、犬復(fù)孔絳蟲）進(jìn)行蟲種檢測(cè)，存在檢測(cè)過(guò)程繁瑣和浪費(fèi)材料的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了用于檢測(cè)和區(qū)分多種以犬為終末宿主的常見大中型絳蟲的檢測(cè)試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：用于檢測(cè)和區(qū)分多種以犬為終末宿主的常見大中型絳蟲的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒內(nèi)包括有四對(duì)特異引物，分別為泡狀帶絳蟲特異性上、下游引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，多頭帶絳蟲特異性上、下游引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，豆?fàn)顜Ы{蟲特異性上、下游引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，犬復(fù)孔絳蟲特異性上、下游引物SEQ ID No.7和SEQ ID No.8。

具體為：

SEQ ID No.1：5'- AGT TCC ATA TTA TTT ACA GTT TTG TTA TTA C -3'；

SEQ ID No.2：5'- TAA CAT AAT ACT TGA AGA CAC CCC CA -3'；

SEQ ID No.3：5'- GTT GTT GAT GTG GCT TAA GTT TTT GTG T -3'；

SEQ ID No.4：5'- TCT ATA AAA TAA ACA CAT ACA CAA CAA TCC T -3'；

SEQ ID No.5：5'- TGT GGG AAG GTT TAG GTG AAT CAT -3'；

SEQ ID No.6：5'- GTT AAC ATC AAT ATC TTC TAG CTC TGA CAC T -3'；

SEQ ID No.7：5'- CTA TTG ATT GCG TTT ATT GTT TTG TGT -3'；

SEQ ID No.8：5'- GAA AAG AAA TCA AAT ACA GTT AAA CGG T-3'。

進(jìn)一步的，上述的用于檢測(cè)和區(qū)分多種以犬為終末宿主的常見大中型絳蟲的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還有：Taq DNA聚合酶，10×PCR Buffer，2.5 mmol/μL的dNTP ，25 mmol/μL的MgCl₂，無(wú)菌雙蒸水。

本發(fā)明是建立在病原分子生物學(xué)基礎(chǔ)上，基于多頭帶絳蟲、泡狀帶絳蟲、豆?fàn)顜Ы{蟲、犬復(fù)孔絳蟲的線粒體基因，分別對(duì)四種病原設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，并建立復(fù)合PCR方法用于定種檢測(cè)四種病原的單獨(dú)或混合感染。本發(fā)明中建立的復(fù)合PCR技術(shù)，系統(tǒng)設(shè)計(jì)了針對(duì)中國(guó)存在的四種以犬為終末宿主的大中型絳蟲的四對(duì)特異性檢測(cè)引物用于其感染的單獨(dú)和復(fù)合檢測(cè)，為此四種病原定種檢測(cè)的首創(chuàng)。本復(fù)合PCR技術(shù)包含普通PCR技術(shù)的所有優(yōu)點(diǎn)，包括檢測(cè)結(jié)果特異性高，檢測(cè)反應(yīng)敏感，檢測(cè)快速和高通量檢測(cè)等，也具有復(fù)合PCR的高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性等優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速準(zhǔn)確的病原學(xué)鑒定。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明是一種應(yīng)用復(fù)合PCR方法對(duì)四種以犬為終末宿主的大中型絳蟲的檢測(cè)試劑盒，應(yīng)用本發(fā)明試劑盒中的四對(duì)特異引物對(duì)被檢樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳圖中是否出現(xiàn)特異性條帶確定出被檢樣品是否被感染，以及確定感染了多頭帶絳蟲、泡狀帶絳蟲、豆?fàn)顜Ы{蟲和犬復(fù)孔絳蟲這四種寄生蟲中的具體種類。采用這種試劑盒既可以用于中間宿主的感染檢測(cè)，也可以用于終末宿主的感染檢測(cè)，而且能對(duì)終末宿主可能的多重感染進(jìn)行檢測(cè)。

與本發(fā)明相關(guān)的操作過(guò)程包括從終末宿主糞便中提取全基因組DNA，或從四種絳蟲感染的中間宿主病灶組織（包囊及其內(nèi)容物）中提取全基因組DNA，配制含四對(duì)引物和全基因組模板的復(fù)合PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，并根據(jù)目的條帶的大小判定所感染絳蟲的種類。用本發(fā)明的四對(duì)特異性PCR檢測(cè)引物，用以犬為終末宿主的其他常見五種絳蟲，即泡尾帶絳蟲（T. taeniaeformis, Tae），細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球絳蟲(E. mutilocularis, Em)和石渠棘球絳蟲(E. shaquacus, Es)基因組DNA為模板進(jìn)行特異性驗(yàn)證擴(kuò)增，均未見有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，表明這四對(duì)檢測(cè)引物特異性高。本發(fā)明的四對(duì)引物同時(shí)在一個(gè)PCR反應(yīng)體系內(nèi)使用而互不干擾，表明其具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性等優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速準(zhǔn)確的病原學(xué)鑒定。

附圖說(shuō)明

圖1顯示為本發(fā)明的四種絳蟲特異性檢測(cè)引物混合后分別對(duì)以犬為終末宿主的常見單一寄生蟲病原DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)的PCR結(jié)果。

其中：1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8依次為四對(duì)引物擴(kuò)增Th, Tm, Tp, Dc, Tae, Eg, Em, Es基因組DNA模板時(shí)的PCR結(jié)果；9為未加任何物種基因組DNA模板時(shí)的PCR結(jié)果；M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。

圖2顯示為本發(fā)明的四種絳蟲的混合檢測(cè)引物以一種、兩種、三種及四種絳蟲DNA混合模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)的復(fù)合PCR結(jié)果。

其中：1-4依次為四對(duì)引物擴(kuò)增Th, Tm, Tp, Dc基因組模板時(shí)的PCR結(jié)果；5-10分別為四種混合檢測(cè)引物擴(kuò)增以下兩種絳蟲基因組模板時(shí)的PCR結(jié)果： Th+Tm，Th+Tp，Th+Dc Tm+Tp，Tm+Dc，Tp+Dc；11-14分別為四種混合檢測(cè)引物擴(kuò)增同時(shí)檢測(cè)以下三種絳蟲基因組模板時(shí)的PCR結(jié)果：Th+Tm+Tp，Th+Tm+Dc，Th +Tp+Dc，Tm+Tp+Dc；15為四種混合檢測(cè)引物擴(kuò)增四種絳蟲基因組模板時(shí)的PCR結(jié)果，即Th+Tm+Tp+Dc；16為未加任何物種基因組DNA模板時(shí)的PCR結(jié)果；M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

在本實(shí)施例中，選取犬糞便進(jìn)行泡狀帶絳蟲等四種絳蟲感染檢測(cè)。取適量犬糞（2-5g），用飽和鹽水漂浮法漂浮犬糞中蟲卵和蟲體殘片，離心收集后采用糞DNA提取試劑盒提取全基因組DNA，測(cè)定提取DNA濃度后備用。在PCR反應(yīng)管內(nèi)配制復(fù)合PCR反應(yīng)液，采用50 μL反應(yīng)體系，包含10×PCR Buffer 5 μL，MgCl₂(25 mmol/μL) 5 μL，用于泡狀帶絳蟲特異性檢測(cè)的上游引物F1：5'- AGT TCC ATA TTA TTT ACA GTT TTG TTA TTA C -3' （Th NO.1）1 μL（50 μmol/mL）和下游引物R1：5'- TAA CAT AAT ACT TGA AGA CAC CCC CA -3'（ThNO.2）1 μL（50 μmol/mL），用于多頭帶絳蟲特異性檢測(cè)的上游引物F2：5'- GTT GTT GAT GTG GCT TAA GTT TTT GTG T -3'（Tm NO.1）1 μL（50 μmol/mL）和下游引物R2：5'- TCT ATA AAA TAA ACA CAT ACA CAA CAA TCC T -3'（Tm NO.2）1 μL（50 μmol/mL），用于豆?fàn)顜Ы{蟲特異性檢測(cè)的上游引物F3：5'- TGT GGG AAG GTT TAG GTG AAT CAT -3'（Tp NO.1）1 μL（50 μmol/mL）和下游引物R3：5'- GTT AAC ATC AAT ATC TTC TAG CTC TGA CAC T -3'（Tp NO.2）1 μL（50 μmol/mL），用于犬復(fù)孔絳蟲特異性檢測(cè)的上游引物F4：5'- CTA TTG ATT GCG TTT ATT GTT TTG TGT -3'（Dc NO.1）1 μL（50 μmol/mL）和下游引物R4：5'- GAA AAG AAA TCA AAT ACA GTT AAA CGG T-3'（Dc NO.2）1 μL（50 μmol/mL），dNTP (2.5 mmol/μL) 1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，犬糞全基因組DNA模板量為100 ng，用水補(bǔ)足50 μL。在熱循環(huán)儀內(nèi)完成PCR反應(yīng)過(guò)程，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4 min，94℃變性50 S，55℃退火30S，72℃延伸40 S，35個(gè)循環(huán)，72℃加長(zhǎng)延伸10 min，反應(yīng)完成后4℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定和分析，泡狀帶絳蟲、多頭帶絳蟲、豆?fàn)顜Ы{蟲和犬復(fù)孔絳蟲的特異性擴(kuò)增條帶大小分別為592bp、385bp、283bp和190bp。

本發(fā)明的具體檢測(cè)過(guò)程如下：

1、 犬糞的的采集獲取

在流浪犬、家養(yǎng)犬、牧羊犬活動(dòng)區(qū)域收集新鮮犬糞，或給犬投喂含氫溴酸檳榔堿的食物導(dǎo)瀉后收集犬糞。

2、犬糞全基因組DNA的提取

1）將獲取的犬糞便的于-70^°C凍存1周。

2）糞DNA的制備：根據(jù)糞DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取糞DNA。

3、PCR擴(kuò)增體系的建立

在PCR反應(yīng)管內(nèi)配制復(fù)合PCR反應(yīng)液，采用50 μL反應(yīng)體系，加入10×PCR Buffer 5 μL，MgCl₂(25 mmol/μL) 5 μL，引物Th NO.1、Th NO.2、Tm NO.1、Tm NO.2、Tp NO.1、Tp NO.2、Dc NO.1、DC NO.2各1 μL（50 μmol/mL），dNTP (2.5 mmol/μL) 1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，犬糞全基因組DNA模板量為100 ng，用水補(bǔ)足50 μL。

4、PCR擴(kuò)增條件

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性50 S，52℃退火30 S，72℃延伸40 S，35個(gè)循環(huán)，72℃加長(zhǎng)延伸10 min，反應(yīng)完成后4℃保存。

5、PCR擴(kuò)增結(jié)果觀察

PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1.5% (w/v)瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL溴化乙錠）中進(jìn)行電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定和分析。結(jié)果如圖1和圖2。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

<120> 用于檢測(cè)和區(qū)分多種以犬為終末宿主的大中型絳蟲的檢測(cè)試劑盒

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 泡狀帶絳蟲特異性上游引物

<400> 1

agttccatat tatttacagt tttgttatta c 31

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 泡狀帶絳蟲特異性下游引物

<400> 2

taacataata cttgaagaca ccccca 26

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 多頭帶絳蟲特異性上游引物

<400> 3

gttgttgatg tggcttaagt ttttgtgt 28

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 多頭帶絳蟲特異性下游引物

<400> 4

tctataaaat aaacacatac acaacaatcc t 31

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 豆?fàn)顜Ы{蟲特異性上游引物

<400> 5

tgtgggaagg tttaggtgaa tcat 24

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 豆?fàn)顜Ы{蟲特異性下游引物

<400> 6

gttaacatca atatcttcta gctctgacac t 31

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 犬復(fù)孔絳蟲特異性上游引物

<400> 7

ctattgattg cgtttattgt tttgtgt 27

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 犬復(fù)孔絳蟲特異性下游引物

<400> 8

gaaaagaaat caaatacagt taaacggt 28

序 列 表

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

<120> 用于檢測(cè)和區(qū)分多種以犬為終末宿主的大中型絳蟲的檢測(cè)試劑盒

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 泡狀帶絳蟲特異性上游引物

<400> 1

agttccatat tatttacagt tttgttatta c 31

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 泡狀帶絳蟲特異性下游引物

<400> 2

taacataata cttgaagaca ccccca 26

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 多頭帶絳蟲特異性上游引物

<400> 3

gttgttgatg tggcttaagt ttttgtgt 28

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 多頭帶絳蟲特異性下游引物

<400> 4

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<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 豆?fàn)顜Ы{蟲特異性上游引物

<400> 5

tgtgggaagg tttaggtgaa tcat 24

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 豆?fàn)顜Ы{蟲特異性下游引物

<400> 6

gttaacatca atatcttcta gctctgacac t 31

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 犬復(fù)孔絳蟲特異性上游引物

<400> 7

ctattgattg cgtttattgt tttgtgt 27

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 犬復(fù)孔絳蟲特異性下游引物

<400> 8

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