本發(fā)明涉及由核苷酸活化的糖產(chǎn)生游離形式的目的單糖的微生物發(fā)酵方法。

碳水化合物通過(guò)在能量?jī)?chǔ)存、結(jié)構(gòu)功能、信號(hào)傳導(dǎo)、信息存儲(chǔ)等中發(fā)揮重要作用而在所有的生命形式中起作用。為了該任務(wù)，自然界合成若干種主要的單糖如葡萄糖、n-乙?；?葡糖胺、甘露糖、n-乙?；?甘露糖胺、果糖、巖藻糖、核糖、唾液酸、木糖等，以及用于更專門(mén)的應(yīng)用的若干次要單糖，例如d-阿洛糖。

l-巖藻糖(6-脫氧-l-半乳糖)和巖藻糖基化的寡糖和多糖對(duì)化學(xué)、化妝品和制藥工業(yè)來(lái)說(shuō)很有用，因?yàn)樗鼈兙哂懈叩臓I(yíng)養(yǎng)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的潛力(hauber,h.-p.,schuiz,m.,pforte,a.,mack,p.,zabel,p.&schumacher,u.(2008)inhalationwithfucoseandgalactosefortreatmentofpseudomonasaeroginosaincyctricfibrosispatients.int.j.med.sci.5,371-376.；isnard,n.,bourles-dagonetf.,robert,l.&renard,g.(2005)studiesoncornealwoundhealing:effectsiffucoseoniodinevapor-burntrabbitcorneas.ophthalmologics219,324-333；robert,l,fodil-bourahla,i.,bizbiz,l.&robert,a.m.(2004)effectofl-fucoseandfucose-richpolysaccharidesonelastinbiosynthesis,invivoandinvitro.biomed.pharmacother.58,123-128；wild,m.k.,lühn,k.,marquardt,t.&vestweber,d.(2002)leukocyteadhesiondeficiencyii:therapyandgeneticdefect.cellstissuesorgans172,161-173；adam,e.c.,mitchell,b.s.,schumacher,d.u.,grant,g.&schumacher,u.(1997)pseudomonasaeruginosaiilectinstopshumanciliarybeating:therapeuticimplicationsoffucose.am.j.respir.caremed.155,2102-2104)。已知它們具有抗炎性、抗病毒和抗腫瘤的性能并且還可用作益生元。由于抗衰老作用，l-巖藻糖對(duì)化妝品來(lái)說(shuō)也是有用的(isnard,n.,fodil-bourathla,i.,roberta.m.&robert,l.(2004)pharmacologyofskinaging.stimulationofglycosaminoglycanbiosynthesisbyl-fucoseandfucoserichpolysaccharides,effectofinvitroagingoffibroblasts.biomed.pharmacother.58,202-204.)。另外，巖藻糖基化衍生物以其抗過(guò)敏性和乳化性而聞名。

雖然一些單糖可大量地并以合理的成本從自然界中獲得(例如葡萄糖、n-乙酰葡萄糖胺和果糖)，但大多數(shù)單糖是相當(dāng)稀有的并且僅少量存在于自然界中，如l-巖藻糖(6-脫氧-l-半乳糖)。

對(duì)于單糖的商業(yè)化生產(chǎn)，幾乎僅有從自然界中獲得的寡糖被用作來(lái)源。這些寡糖為酸性水解的并且從釋放的單糖中純化各個(gè)糖。由于單糖的高度化學(xué)相似性(彼此之間的最大差異僅在于各個(gè)羥基的取向)，因此分離純凈形式的各個(gè)單糖相當(dāng)艱難和昂貴。

l-巖藻糖代表這樣的稀有糖，其目前通過(guò)水解來(lái)自藻類或細(xì)菌源的復(fù)雜寡糖來(lái)獲得。為了從復(fù)雜的水解產(chǎn)物中純化各個(gè)單糖，經(jīng)常必須使用有毒化學(xué)品，如乙酸鉛和過(guò)量的有機(jī)溶劑(schweiger,r.g.(1966)preparationofα-l-fucosidesandl-fucosefromfucoidan.uspatent3,240,775)。因此，從寡糖的復(fù)雜水解產(chǎn)物中分離各個(gè)單糖是具有挑戰(zhàn)性的(由于所釋放的各個(gè)單糖的高度化學(xué)相似性)并且是對(duì)環(huán)境有害的(由于過(guò)量使用有毒化學(xué)品，如碳酸鉛)。此外，某些糖類中富含的寡糖的可利用性在自然界中相當(dāng)受限制并且由于季節(jié)的變換，其也是高度變化的。l-巖藻糖代表這類傳統(tǒng)上通過(guò)含巖藻糖的多糖的酸性水解來(lái)獲得的稀有單糖。巖藻糖主要源自多糖巖藻多糖(fucoidan)，其為一種存在于所有常見(jiàn)的褐海藻(包括鹿角菜科(fucaceae)和海帶科(laminariaceae))中的巖藻聚糖單硫酸酯(black,w.a.p(1954):theseasonalvariationinthecombinedl-fucosecontentofthecommonbritishlaminariaceaeandfucaceae.j.sci.foodagric.5,445-448)?，F(xiàn)在，l-巖藻糖主要是通過(guò)采集屬于鹿角菜科的褐海藻來(lái)大量獲得，所述褐海藻可在全球范圍內(nèi)找到，但大量存在于大西洋的歐洲海岸。從海岸大規(guī)模收獲褐海藻引發(fā)環(huán)境關(guān)注并且受限于環(huán)境保護(hù)法律。

例如，jp2000351790公開(kāi)了用于提取巖藻多糖以及用于從提取的巖藻多糖中獲得和分離含巖藻糖的寡糖的方法。

除了來(lái)自褐海藻的巖藻多糖的水解外，最近，一篇專利出版物還證明，l-巖藻糖還可經(jīng)由水解天然存在的包含l-巖藻糖的細(xì)菌多糖來(lái)獲得：wo2012/034996a1公開(kāi)了屬于腸桿菌科(enterobacteriaceae)的菌株，該菌株能夠產(chǎn)生包含l-巖藻糖的胞外多糖。為了產(chǎn)生l-巖藻糖，回收該菌株產(chǎn)生的多糖并例如通過(guò)用硫酸或三氟乙酸處理進(jìn)行水解。

wo2014067696a1首次記載了通過(guò)使用具有糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的重組微生物產(chǎn)生l-巖藻糖的方法，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶可共同作用來(lái)合成游離形式的的l-巖藻糖。該方法需要兩種酶和一種受體分子。糖基轉(zhuǎn)移酶催化巖藻糖從gdp-l-巖藻糖轉(zhuǎn)移至受體如乳果糖，以便合成巖藻糖基乳果糖。然后將巖藻糖基化受體(例如巖藻糖基乳果糖)通過(guò)糖苷酶水解為受體分子和l-巖藻糖。然后，該受體可通過(guò)所使用的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶再次進(jìn)行巖藻糖基化。然后將l-巖藻糖通過(guò)輸出至培養(yǎng)基中而從細(xì)胞中釋放出來(lái)，其可從培養(yǎng)基的上清液中回收。通過(guò)這種方式，可容易地克服gdp-巖藻糖途徑的反饋抑制，并且可通過(guò)微生物發(fā)酵獲得大量(數(shù)g/l)的游離l-巖藻糖。

除了從多糖或寡糖水解產(chǎn)物中提取l-巖藻糖外，還已開(kāi)發(fā)了起始于其他單糖如l-阿拉伯糖、d-半乳糖、l-鼠李糖、d-甘露糖和d-葡萄糖的l-巖藻糖的若干合成途徑。由defrayeetal(1984)開(kāi)發(fā)的最有效的合成途徑起始于稀有單糖l-鼠李糖(defaye,j.,gadelle,a.&angyal,s.(1984)anefficientsynthesisofl-fucoseandl-(4-²h)fucose.carbohydr.res.126,165-169)。通常，這些化學(xué)合成的產(chǎn)率往往相當(dāng)?shù)筒⑶疑婕叭舾苫瘜W(xué)步驟。除涉及若干合成步驟之外，還不得不將大量的保護(hù)基團(tuán)化學(xué)用于l-巖藻糖的化學(xué)合成。通常，與從采集于自然界的多糖中提取l-巖藻糖相比，單糖的大規(guī)模化學(xué)合成還沒(méi)有被證明是經(jīng)濟(jì)可行的。

因此，目前，任何純凈形式的單糖的產(chǎn)生均需要在從目標(biāo)單糖凈化掉其他單糖方面付出相當(dāng)大的努力，往往涉及大量的有機(jī)溶劑和其他有毒化學(xué)品。因此，單獨(dú)的所需單糖如l-巖藻糖的專門(mén)(exclusive)累積將會(huì)是非常有幫助的。然而，大多數(shù)微生物受限于它們能夠利用的單糖的種類。另外，它們通常對(duì)某些單糖產(chǎn)生強(qiáng)的偏好，以避免數(shù)種單糖可同時(shí)用作碳源。

鑒于上述情況，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供產(chǎn)生游離形式的的單獨(dú)的所需單糖的新的方法，通過(guò)該方法，可快速和有效地回收該單糖，即大規(guī)模和成本有效地并且沒(méi)有負(fù)面的環(huán)境影響。

該目的和其他目的是通過(guò)使用微生物大規(guī)模產(chǎn)生游離形式的的目的單糖的方法實(shí)現(xiàn)，所述方法包括以下步驟：

a.)提供用于合成所述單糖的微生物，所述微生物包含能夠催化核苷酸活化的單糖的水解以從核苷酸活化的單糖釋放目的單糖的酶，以及

b.)在適于該微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，其中所述微生物不能顯著程度地代謝所述單糖，以便所述目的單糖在培養(yǎng)步驟期間以游離形式的產(chǎn)生并累積。

本發(fā)明的目的是以這種方式來(lái)完全實(shí)現(xiàn)。

申請(qǐng)人的上述方法先前從未有過(guò)記載，利用包含且表達(dá)水解核苷酸活化的單糖的酶的微生物并累積游離單糖。對(duì)核苷酸活化的糖類具有水解活性的酶可為例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選由大腸桿菌:o126的wbgl基因編碼的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(acc.no.adn43847)的變體或來(lái)自幽門(mén)螺旋桿菌(helicobacterpylori)的1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶futc(acc.no.aad29868)。盡管具有上述酶特征的未修飾的微生物可應(yīng)用于本發(fā)明，但是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，該微生物為重組微生物，其中該重組微生物已被轉(zhuǎn)化為包含且表達(dá)至少一個(gè)核酸序列，所述核酸序列并不是天然存在于該微生物中并且編碼能夠催化核苷酸活化的單糖的水解的酶。

與現(xiàn)有的方法不同，能催化核苷酸活化的糖(即單糖)水解的單獨(dú)的酶被用于釋放單糖，然而，本領(lǐng)域已知的在先方法則應(yīng)用至少一種將單糖從供體底物轉(zhuǎn)移至受體底物的酶，然后為利用糖苷酶從受體中釋放單糖的步驟。該步驟在本發(fā)明中并不是必要的，從而使產(chǎn)生目的單糖的方法變得容易(facilitate)。因此，在本發(fā)明的方法中，使用“在缺乏受體的情況下”能催化核苷酸活化的單糖的水解并釋放游離形式的的單糖的酶。另外，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的方法可在沒(méi)有定向使用能從受體-底物中釋放單糖的糖苷酶的情況下進(jìn)行。

使用新提供的方法和新提供的微生物(重組或未重組的)，可產(chǎn)生游離形式的大量的所需的單糖，而不需要化學(xué)品或繁復(fù)的方法步驟。本發(fā)明的方法代表微生物發(fā)酵方法，該方法適用于工業(yè)上大規(guī)模產(chǎn)生稀有或其他單糖，所述單糖可容易地從其中培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基中回收。

在本文中所用的和在本發(fā)明的領(lǐng)域內(nèi)通常理解的表述“單糖”表示碳水化合物的最基本的單位。單糖為最簡(jiǎn)單形式的糖，并且通常為無(wú)色、水溶性、結(jié)晶狀固體。單糖的實(shí)例包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、甘露糖、巖藻糖、鼠李糖和核糖。單糖是二糖(如蔗糖)以及多糖(如纖維素和淀粉)的結(jié)構(gòu)單元。如本文中所用的以及如在現(xiàn)有技術(shù)狀況中通常理解的術(shù)語(yǔ)“寡糖”表示包含兩個(gè)或更多個(gè)單糖的糖類聚合物。

術(shù)語(yǔ)“編碼…的核酸序列”通常表示任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可為未修飾的rna或dna或者修飾的rna或dna，并且通常表示編碼某些多肽或蛋白的基因。該術(shù)語(yǔ)包括但不限于單鏈和雙鏈dna，作為單鏈和雙鏈區(qū)或單鏈、雙鏈和三鏈區(qū)的混合物的dna；單鏈和雙鏈rna，以及作為單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的rna；包含dna和rna的雜合分子，所述dna和rna可為單鏈的，或更通常地為雙鏈、或三鏈區(qū)，或單鏈和雙鏈區(qū)的混合物。該術(shù)語(yǔ)還包括多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的單一連續(xù)區(qū)或非連續(xù)區(qū)(例如，由整合的噬菌體或插入序列或編輯(editing)所中斷)，以及其他還可包含編碼和/或非編碼序列的區(qū)。

在本上下文中，術(shù)語(yǔ)“多肽”表示任何肽或蛋白，其包含通過(guò)肽鍵或修飾的肽鍵彼此連接的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸?！岸嚯摹北硎径替?通常稱為肽、寡肽和寡聚體)和長(zhǎng)鏈(通常稱為蛋白質(zhì))。多肽可包含不同于20種基因編碼的氨基酸的氨基酸?！岸嚯摹卑ㄍㄟ^(guò)天然方法(如加工和其他翻譯后修飾)或者通過(guò)化學(xué)修飾技術(shù)修飾的那些。應(yīng)當(dāng)理解，可以在給定多肽的若干位點(diǎn)處以相同或不同程度存在相同類型的修飾，而基本不改變所述多肽的活性。此外，給定多肽可包含許多類型的修飾。修飾可發(fā)生在多肽中的任何位置，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“核苷酸活化的單糖”與“能夠催化核苷酸活化的單糖水解的酶”或“能夠水解核苷酸活化單糖的酶”結(jié)合使用，所述酶描述對(duì)核苷酸活化單糖具有催化活性的酶；水解導(dǎo)致所需的單糖的釋放。在此方面，術(shù)語(yǔ)“糖基轉(zhuǎn)移酶”指明和包括催化單糖部分從活化的核苷酸單糖(“糖基供體”)轉(zhuǎn)移至糖基受體分子的酶。在本發(fā)明中，在本發(fā)明的方法和微生物中所用的糖基轉(zhuǎn)移酶確實(shí)在缺乏受體分子的情況下催化核苷酸活化的單糖的水解。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，特別優(yōu)選地，所述核苷酸活化的糖水解酶為細(xì)菌巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，并優(yōu)選由大腸桿菌:o126的wbgl基因編碼的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(acc.no.

adn43847)的變體或其他在缺乏受體分子的情況下催化gdp-l-巖藻糖水解的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。

因此，術(shù)語(yǔ)核苷酸活化的糖水解酶或編碼核苷酸活化的糖水解酶的核酸/多核苷酸表示催化核苷酸活化的糖(例如gdp-巖藻糖、udp-半乳糖、gdp-甘露糖、gdp-鼠李糖和其他天然存在的核苷酸糖)水解裂解的酶。優(yōu)選地，該核苷酸活化的糖水解酶為不將或主要不將單糖轉(zhuǎn)移至受體分子的糖基轉(zhuǎn)移酶。在gdp-l-巖藻糖的情況下，能水解核苷酸活化的單糖的酶為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，例如但不限于α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。

更具體而言，優(yōu)選地使用源自大腸桿菌:126的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶wbgl，其具有氨基酸殘基置換：天冬氨酸69置換為絲氨酸、組氨酸124置換為丙氨酸、谷氨酸215置換為甘氨酸，以及異亮氨酸268置換為脯氨酸；或者源自幽門(mén)螺旋桿菌的1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶futc或其他在缺乏受體分子的情況下對(duì)gdp-l-巖藻糖顯示出水解活性的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，那些術(shù)語(yǔ)還包括核酸/多核苷酸和多肽的多態(tài)性變體、等位基因、突變體以及種間同系物，其具有氨基酸序列，所述氨基酸序列相對(duì)于由大腸桿菌:o126的wbgl基因(acc.no.adn43847)或幽門(mén)螺旋桿菌的futc(acc.no.aad29868)編碼的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，優(yōu)選地在至少約25、50、100、200或300或更多個(gè)氨基酸的區(qū)域上，具有大于約60％的氨基酸序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％，優(yōu)選91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性。

另外，可通過(guò)肽序列的添加或缺失來(lái)改變水解酶的多肽以改變其活性。例如，多肽序列可與酶多肽融合以實(shí)現(xiàn)額外的酶活性。

另外，可改變編碼能水解核苷酸活化的單糖的酶的基因，使得基因產(chǎn)物包括代表功能上等效的基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)或多肽。這類等效的水解酶基因產(chǎn)物可包括由上述水解酶基因序列編碼的氨基酸序列中氨基酸殘基的缺失、添加或置換，但是這會(huì)導(dǎo)致沉默的變化，從而產(chǎn)生編碼能夠水解核苷酸活化的單糖的酶的功能上等效的基因產(chǎn)物。氨基酸置換可基于所涉及殘基的極性、帶電性、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性方面的相似性來(lái)進(jìn)行。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；平面中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；帶負(fù)電荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

在本發(fā)明的上下文中，本文中所用的“功能上等效”表示這樣的多肽，即其能夠顯示出與由上述水解酶基因序列編碼的內(nèi)源性水解酶基因產(chǎn)物基本上相似的對(duì)核苷酸活化的糖的體內(nèi)水解酶活性，如通過(guò)許多標(biāo)準(zhǔn)的任一種所判斷的，其包括但不限于抗原性(即結(jié)合至抗核苷酸活化的糖水解酶抗體的能力)、免疫原性(即產(chǎn)生能夠結(jié)合至核苷酸活化的單糖水解酶蛋白或多肽的抗體的能力)以及酶活性。因此，本發(fā)明還包括與具體公開(kāi)的酶在功能上等效的酶。

另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可從本發(fā)明容易地推導(dǎo)出，對(duì)所公開(kāi)的酶的任何修飾均可用在本發(fā)明的方法和微生物中，所述修飾導(dǎo)致本文中所述的酶的水解活性提高。因此，本發(fā)明還包括與未修飾的形式相比顯示出增加的水解活性的這類經(jīng)修飾的酶。

包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的為在翻譯期間或之后被差異化修飾的核苷酸活化的糖水解酶蛋白、多肽和衍生物(包括片段)。另外，可將非典型氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物作為置換或添加物引入到酶多肽序列中。

根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述酶為由wbgl基因編碼的2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的變體或由源自幽門(mén)螺旋桿菌的futc基因編碼的1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的變體；分別與由wbgl基因編碼的野生型2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶或由futc基因編碼的野生型1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶相比，所述變體攜帶至少一個(gè)、優(yōu)選至少兩個(gè)以及更優(yōu)選多于兩個(gè)修飾，該修飾使得該酶的水解活性提高。

可通過(guò)重組dna技術(shù)利用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生能夠水解核苷酸活化的糖的酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可用于構(gòu)建表達(dá)載體，其包含允許合成催化核苷酸活化的糖水解的酶的酶編碼序列和適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄翻譯控制信號(hào)。這些方法包括，例如，體外重組dna技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)基因重組。參見(jiàn)，例如，記載于sambrook,j.和russelld.w.(1989)molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.中的技術(shù)。

根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案，所述至少一個(gè)修飾為至少一個(gè)氨基酸置換。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，該修飾為或包含至少一個(gè)、兩個(gè)或大于兩個(gè)，特別是三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)或十個(gè)氨基酸置換，其中該修飾的能夠水解核苷酸活化的單糖的酶與未修飾的野生型酶相比，對(duì)核苷酸活化的單糖具有增加的水解活性。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，優(yōu)選地使用源自大腸桿菌:126的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶wbgl，其具有氨基酸殘基置換：天冬氨酸69置換為絲氨酸、組氨酸124置換為丙氨酸、谷氨酸215置換為甘氨酸以及異亮氨酸268置換為脯氨酸；或者源自幽門(mén)螺旋桿菌的1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶futc或其他在缺乏受體分子的情況下對(duì)gdp-l-巖藻糖顯示出水解活性的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。

從本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，不僅如上所述的具體取代，而且這些具體描述的酶的其他修飾，特別是其他置換，均包括在本發(fā)明中，只要因此修飾的酶與未經(jīng)修飾的野生型酶相比對(duì)核苷酸活化的單糖具有增加的水解活性。上文中還更廣泛地討論了合適的替代的置換，但是其也應(yīng)當(dāng)適用于此處。

在本文中，以及在整個(gè)本發(fā)明中，“重組體”表示通過(guò)將來(lái)自一個(gè)種的基因移植或剪接至不同種的宿主微生物的細(xì)胞中制備的遺傳改造的dna。這類dna變成宿主的基因組成(makeup)的一部分并且被復(fù)制。

“微生物”在本文中指明并包括適合用于本發(fā)明的方法中的任何微觀的生物體，其包括單細(xì)胞、細(xì)胞群集(cellcluster)、或多細(xì)胞的相對(duì)復(fù)雜的生物體，并特別包括細(xì)菌和酵母。根據(jù)本發(fā)明使用的微生物可在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且在該培養(yǎng)基中通常需要碳源以生長(zhǎng)和復(fù)制。

因此，指定“重組宿主微生物”意指包含編碼糖基轉(zhuǎn)移酶或核苷酸活化的糖水解酶或者編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶或gdp-l-巖藻糖水解酶的核酸序列的任何微生物，其中編碼這些酶的核酸序列為在重組(宿主)細(xì)胞中為外來(lái)的/非天然存在的核酸序列，并且其中在所述微生物中為外來(lái)的/非天然存在的序列被整合在宿主微生物細(xì)胞的基因組中。因此，“非天然存在的”意指所述核酸序列對(duì)所述宿主微生物細(xì)胞而言為外來(lái)的，即該核酸序列相對(duì)于微生物宿主細(xì)胞而言為異源的?？蓪愒葱蛄欣缤ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)穩(wěn)定引入宿主微生物細(xì)胞的基因組中，其中可應(yīng)用的技術(shù)取決于待引入所述序列的宿主細(xì)胞。各種技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且，例如公開(kāi)于sambrooketal.,1989(見(jiàn)上文)中。因此，已引入異源序列的宿主細(xì)胞將產(chǎn)生本發(fā)明的核酸序列編碼的異源蛋白。

為了進(jìn)行重組生產(chǎn)，可對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造以整合表達(dá)系統(tǒng)或其部分與本發(fā)明的核酸序列。核酸序列向宿主微生物細(xì)胞中的引入可通過(guò)許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中記載的方法進(jìn)行，如davisetal.,basicmethodsinmolecularbiology,(1986)和sambrooketal.,1989(見(jiàn)上文)。

因此，本發(fā)明的核酸序列可例如包含在待穩(wěn)定轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染至宿主微生物細(xì)胞中的載體中。

各種各樣的表達(dá)系統(tǒng)可用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。這類載體尤其包括染色體載體、附加型載體和病毒衍生載體，例如，源自細(xì)菌質(zhì)粒、源自噬菌體、源自轉(zhuǎn)座子、源自酵母附加體、源自插入元件、源自酵母染色體元件、源自病毒的載體，以及源自它們的組合的載體，如源自質(zhì)粒和噬菌體基因元件(如粘粒和噬菌粒)的那些。表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建體可以包含調(diào)節(jié)以及引起表達(dá)的調(diào)控區(qū)。通常，在這方面，適于在宿主中維持、增殖或表達(dá)多核苷酸以及適于合成多肽的任何系統(tǒng)或載體均可用于表達(dá)。可將適當(dāng)?shù)膁na序列通過(guò)多種公知和常規(guī)的技術(shù)中的任一種(例如在sambrooketal.(見(jiàn)上文)中闡述的那些)插入表達(dá)系統(tǒng)中。

如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“回收”意指從微生物培養(yǎng)物中分離(isolate)、收獲、收集或分開(kāi)(separate)通過(guò)本發(fā)明的微生物產(chǎn)生的單糖。

根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述微生物還被進(jìn)一步修飾以具有失活的或嚴(yán)重減少的或者缺乏導(dǎo)致所產(chǎn)生的單糖降解的分解代謝途徑。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述微生物還被進(jìn)一步修飾為具有失活的或嚴(yán)重減少的或者缺乏涉及l(fā)-巖藻糖分解代謝的基因。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述微生物還被進(jìn)一步修飾以過(guò)表達(dá)至少一個(gè)涉及核苷酸活化的單糖的生物合成的基因以提高該核苷酸活化的單糖的供應(yīng)。在這點(diǎn)上，優(yōu)選地，至少一個(gè)基因?yàn)楫愒吹幕蛲吹摹?/p>

根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案，至少一個(gè)涉及gdp-巖藻糖、gdp-甘露糖或gdp-鼠李糖的生物合成的基因過(guò)表達(dá)以分別提高gdp-巖藻糖、gdp-甘露糖或gdp-鼠李糖的供應(yīng)。在這點(diǎn)上，優(yōu)選地，至少一個(gè)基因?yàn)楫愒吹幕蛲吹摹?/p>

根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案，所述微生物還被進(jìn)一步修飾以具有失活的或減少的針對(duì)核苷酸活化的單糖的競(jìng)爭(zhēng)途徑。

根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方案，所述微生物還被進(jìn)一步修飾以表達(dá)磷酸酶，以免所述單糖以磷酸化形式被酶釋放。

在整個(gè)本發(fā)明中，特別優(yōu)選地，待產(chǎn)生的游離單糖選自l-巖藻糖、l-鼠李糖或l-甘露糖。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物在包含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述碳源選自甘油、蔗糖、乙酸酯(acetate)、葡萄糖、果糖、糖蜜(molasses)、乳糖、木糖、纖維素、合成氣、二氧化碳或一氧化碳。在本文中，應(yīng)當(dāng)理解，任何其他(優(yōu)選低成本的)發(fā)酵底物均可用作碳源，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地利用適于本發(fā)明的碳源，來(lái)使微生物生長(zhǎng)以大規(guī)模產(chǎn)生所需的單糖。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，在微生物如重組微生物的培養(yǎng)步驟期間將碳源不斷地加入培養(yǎng)基中。

通過(guò)在培養(yǎng)步驟期間不斷地添加碳源，實(shí)現(xiàn)單糖的恒定和有效的生產(chǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，將單糖從所培養(yǎng)的重組宿主微生物的上清液中回收，所述上清液是通過(guò)離心所培養(yǎng)的宿主微生物以獲得上清液和宿主微生物沉淀(pellet)來(lái)獲得。

利用新提供的方法，可從其中培養(yǎng)宿主微生物的培養(yǎng)基中回收所產(chǎn)生的單糖，因?yàn)樵谖⑸锛?xì)胞中產(chǎn)生的單糖被轉(zhuǎn)運(yùn)至培養(yǎng)基中，因此，一旦已將微生物的細(xì)胞從培養(yǎng)基中分離出來(lái)，可毫不費(fèi)力地從上清液中回收單糖。

在所需的單糖的合成期間在微生物中產(chǎn)生的并且損害/干擾所需單糖的回收/純化步驟的其他單糖或寡糖可被微生物代謝，使得所需單糖的回收步驟得到進(jìn)一步改進(jìn)和促進(jìn)(facilitate)。因此，可在本發(fā)明的方法結(jié)束時(shí)將糖代謝酶從外部添加/供應(yīng)至培養(yǎng)基中。通過(guò)這樣做，不需要的糖就不能累積并且不會(huì)干擾所需單糖的回收。編碼代謝途徑或酶的基因可在微生物中表達(dá)，以便代謝另外的干擾的不需要的單糖，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將在閱讀本發(fā)明時(shí)會(huì)容易地認(rèn)識(shí)到其他合適的途徑或酶來(lái)下調(diào)/激活或供應(yīng)，這將取決于待產(chǎn)生的單糖。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的方法包括以下步驟：

a)在適于微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，提供重組宿主微生物，其已被轉(zhuǎn)化以包含非天然存在于所述微生物中的編碼催化核苷酸活化的單糖的水解的酶的核酸序列，其中所述微生物不能代謝所述將大量產(chǎn)生的單糖，

b)在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組宿主微生物，由此產(chǎn)生游離形式的單糖，

c)從培養(yǎng)基中回收游離單糖。

因此，上述段落中所述的方法包括從培養(yǎng)基中回收游離單糖的額外的步驟。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，公開(kāi)并要求保護(hù)一種微生物。

與所述方法有關(guān)的具體術(shù)語(yǔ)所使用的且在上文中所闡述的定義確實(shí)也適用于其中記載的重組微生物。

根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的方法中使用的以及其中要求保護(hù)的微生物選自能合成核苷酸活化的糖的細(xì)菌或酵母菌株，通過(guò)水解裂解核苷酸活化的單糖可從所述核苷酸活化的糖中獲得所需的單糖。細(xì)菌大腸桿菌(escherichiacoli)、谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)和酵母酵母屬種(saccharomycessp.)具有以下優(yōu)勢(shì)：這些微生物可在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中容易且廉價(jià)地生長(zhǎng)，并且所述細(xì)菌和酵母已被深入研究多年。

因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中所用的以及其中另外要求保護(hù)的宿主微生物選自細(xì)菌和酵母，并且優(yōu)選地為大腸桿菌菌株。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)一步優(yōu)選地，重組宿主微生物被進(jìn)一步修飾以缺乏編碼參與所需單糖的代謝的酶的基因，在l-巖藻糖為所需單糖的情況下，缺乏編碼l-巖藻糖激酶(l-fuculososekinase)、l-巖藻糖異構(gòu)酶、巖藻糖(fuculose)-1-磷酸醛縮酶和udp-葡萄糖:十一異戊二烯磷酸葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶(udp-glucose:undecaprenylphosphateglucosephosphotransferase)的基因。另外，并根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，缺失使用核苷酸活化的單糖作為合成多糖的底物的糖基轉(zhuǎn)移酶基因(例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶或參與巖藻糖化寡糖如結(jié)腸酸(colonicacid)的合成的酶)。

另外，提高核苷酸活化的糖的合成的基因的過(guò)表達(dá)是優(yōu)選的。在gdp-l-巖藻糖的情況下，來(lái)自大腸桿菌的編碼磷酸甘露糖變位酶(manb)、甘露糖-1-磷酸鳥(niǎo)苷酰基轉(zhuǎn)移酶(mannose-1-phosphateguanosyltransferase,manc)、gdp-甘露糖-4,6-脫水酶(gmd)和gdp-l-巖藻糖合酶(wcag)的基因或來(lái)自其他生物體的適當(dāng)?shù)幕蛟诟髯缘奈⑸镏羞^(guò)表達(dá)。

該實(shí)施方案具有以下優(yōu)勢(shì)，所產(chǎn)生的單糖l-巖藻糖的細(xì)胞內(nèi)降解和結(jié)腸酸的產(chǎn)生被阻止，并且gdp-l-巖藻糖的合成得到改進(jìn)。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組宿主微生物被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化以包含使重組宿主微生物能夠以蔗糖或甘油作為唯一碳源來(lái)生長(zhǎng)的基因，并且特別優(yōu)選地，大腸桿菌w的csc-基因簇(acc.no.cp0021851)被整合至宿主微生物的基因組中，所述基因簇包含蔗糖通透酶(permase)、果糖激酶、蔗糖水解酶和轉(zhuǎn)錄抑制因子的基因(分別為基因cscb、csck、csca和cscr)，其使得轉(zhuǎn)化的微生物能夠以蔗糖作為唯一碳源來(lái)生長(zhǎng)。

在這方面，應(yīng)當(dāng)注意，所列出的本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案均確實(shí)適用于要求保護(hù)的微生物(在適用情況下)。

因此，本發(fā)明還涉及具有催化核苷酸活化的單糖的水解的酶的微生物的用途，其中所述微生物不能代謝所述單糖；并且本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的重組微生物用于產(chǎn)生單糖(特別是l-巖藻糖)的用途。

應(yīng)當(dāng)注意的是，上述用于描述本發(fā)明的方法的某些術(shù)語(yǔ)的定義應(yīng)適用于如本文中所要求保護(hù)的和記載的微生物(重組的或未修飾的)。

或者，用于產(chǎn)生單糖的方法可適用于無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，由此將本發(fā)明的酶和合適的底物在水性反應(yīng)介質(zhì)中混合。所述酶可以在溶液中游離的形式使用，或可結(jié)合或固定于載體如聚合物上，并且可將底物加入載體中。所述載體可例如被填充在柱中。

特別地，本發(fā)明涉及這樣的方法，即其中重組大腸桿菌菌株被用作重組宿主微生物，其中在重組大腸桿菌菌株中已經(jīng)缺失l-巖藻糖異構(gòu)酶基因、l-巖藻糖(fuculose)激酶基因和udp-葡萄糖:十一異戊二烯磷酸葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，并且其中重組大腸桿菌菌株已被轉(zhuǎn)化以包含a)使得大腸桿菌菌株能夠以蔗糖或甘油作為唯一碳源來(lái)生長(zhǎng)的基因，該基因分別編碼蔗糖通透酶、果糖激酶、蔗糖水解酶和轉(zhuǎn)錄抑制因子，b)來(lái)自大腸桿菌或其他生物體的編碼磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥(niǎo)苷酰基轉(zhuǎn)移酶、gdp-甘露糖-4,6-脫水酶和gdp-l-巖藻糖合酶的基因，c)編碼催化核苷酸活化的單糖的水解的酶的基因，例如在缺乏受體分子的情況下水解gdp-l-巖藻糖的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。從實(shí)施方案和附圖的說(shuō)明中還可知道其他優(yōu)點(diǎn)。

不言而喻的是，上述特征以及仍將在下文中解釋的特征不僅可用于分別具體說(shuō)明的組合中，而且可用于其他組合或其本身中，而不偏離本發(fā)明的范圍。另外，應(yīng)當(dāng)注意，在從屬權(quán)利要求中存在的特定特征可在本發(fā)明的范圍內(nèi)以其他方式彼此組合，使得本發(fā)明應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為還具體涉及具有從屬權(quán)利要求的特征的任何其他可能組合的其他實(shí)施方案。

在附圖中舉例說(shuō)明并在以下描述中更詳細(xì)地解釋本發(fā)明的若干實(shí)施方案。在下圖中：

圖1通過(guò)易錯(cuò)pcr進(jìn)行wbgl的隨機(jī)誘變后，在含有pdest:wbgl文庫(kù)的大腸桿菌bl21(de3)生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)上清液中檢測(cè)游離l-巖藻糖。將來(lái)自包含pdest:wbgl(易錯(cuò))克隆的大腸桿菌bl21(de3)生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)物上清液用于比色l-巖藻糖脫氫酶測(cè)定(對(duì)于測(cè)定的描述，參見(jiàn)下文的段落[0089])。描述為“wt”的孔包含表達(dá)未修飾的wbgl基因的大腸桿菌bl21(de3)生產(chǎn)菌株pdest：wbgl培養(yǎng)物的上清液。標(biāo)記為“d1”和“h2”的孔包含來(lái)自合成wbgl變體(h124ae215g)(克隆d1)和wbgl(n69si268p)(克隆h2)的克隆的培養(yǎng)上清液；

圖2包含pdest:wbgl(h124ae215g)(克隆d1)和pdest:wbgl(n69si268p)(克隆h2)的大腸桿菌bl21(de3)生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)物上清液的lc-ms/ms分析?？寺1和克隆h2分別產(chǎn)生4.3g/l和2.5g/ll-巖藻糖；

圖3通過(guò)gdp-l-巖藻糖水解酶活性檢測(cè)由gdp-l-巖藻糖釋放的l-巖藻糖。大腸桿菌bl21(de3)pdest:futc和大腸桿菌bl21(de3)pdest:wbgl(h124ae215g)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物用于含有5mmgdp-l-巖藻糖的體外gdp-l-巖藻糖水解酶測(cè)定。游離l-巖藻糖是在比色l-巖藻糖脫氫酶測(cè)定中檢測(cè)(對(duì)于該測(cè)定的描述，參見(jiàn)下文的段落[0089])?？?中的測(cè)定包含0.27單位futc，在孔2中施用0.32單位wbgl(h124ae215g)。為了確認(rèn)gdp-l-巖藻糖的穩(wěn)定性，用牛血清白蛋白(孔3)進(jìn)行測(cè)定；以及

圖4<ptet-mancb-pt5-gmd>(seqidno.1)、wcag-dhfr(a)、<cscb-csck-csca-cscr>(seqidno.2)(b)、<wbgl>(seqidno.3)(c)和<futc>(seqidno.4)的序列。

實(shí)施例

構(gòu)建產(chǎn)生巖藻糖的大腸桿菌菌株

將大腸桿菌bl21(de3)(novagen,darmstadt,germany)用于基因操作以構(gòu)建巖藻糖生產(chǎn)菌株。由于通過(guò)gdp-l-巖藻糖的水解來(lái)產(chǎn)生巖藻糖，則通過(guò)來(lái)自大腸桿菌k12dh5α的編碼磷酸甘露糖變位酶(manb)、甘露糖-1-磷酸鳥(niǎo)苷?；D(zhuǎn)移酶(manc)、gdp-甘露糖-4,6-脫水酶(gmd)和gdp-l-巖藻糖合酶(wcag)的基因的基因組整合和過(guò)表達(dá)來(lái)提高gdp-l-巖藻糖的合成。操縱子manc-manb是在ptet啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下并且操縱子gmd-wcag是由pt5啟動(dòng)子表達(dá)?；虼?lt;ptet-mancb-pt5-gmd,wcag-dhfr>(seqidno.1；圖4a)還包含dhfr基因，該基因編碼賦予所述整合體三甲氧芐二氨嘧啶抗性的二氫葉酸還原酶。為了通過(guò)轉(zhuǎn)座將該簇整合到大腸桿菌bl21(de3)基因組中，使該簇側(cè)接反向末端重復(fù)，其被mariner家族轉(zhuǎn)座元件himar1特異性識(shí)別。此外，大腸桿菌w的csc基因簇被引入至宿主生物體的基因組中。所述基因簇包括蔗糖通透酶(cscb)、果糖激酶(csck)、蔗糖水解酶(csca)和轉(zhuǎn)錄抑制因子(cscr)的基因。側(cè)翼為himar1特異性反向末端重復(fù)的簇<cscb-csck-csca-cscr>(seqidno.2；圖4b)的整合是通過(guò)himar1轉(zhuǎn)座進(jìn)行并使宿主生物體能夠以蔗糖作為唯一碳源來(lái)生長(zhǎng)(choi,k.-h.andkim,k.-j.(2009)applicationsoftransposon-basedgenedeliverysysteminbacteria.j.microbiol.biotechnol.19,217-228)。

為了防止結(jié)腸酸的形成導(dǎo)致的gdp-l-巖藻糖消耗，根據(jù)datsenko和warner的方法(datsenko,k.a.和warnerb.l.(2000)one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.proc.natl.acad.sci.usa97,6640-6645)，從大腸桿菌bl21(de3)基因組中缺失預(yù)期編碼udp-葡萄糖:十一異戊二烯磷酸葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因wcaj。udp-葡萄糖:十一異戊二烯磷酸葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶催化劑結(jié)腸酸合成中的第一步(stevenson,g.,andrianopoulos,k.,hobbs,m.和reeves,p.r.(1996)organizationoftheescherichiacolik-12geneclusterresponsibleforproductionoftheextracellularpolysaccharidecolonicacid.j.bacteriol.178,4885-4893)。此外，分別編碼巖藻糖異構(gòu)酶和巖藻糖(fuculose)激酶的巖藻糖代謝途徑的基因fucl和fuck被通過(guò)基因組敲除失活以便抑制l-巖藻糖的降解。

2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因wbgl和futc的克隆以及wbgl的誘變

對(duì)來(lái)自大腸桿菌:o126的2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因wbgl(acc.no.and43847)(seqidno.3；圖4c)進(jìn)行密碼子優(yōu)化并由genscriptcooperation(piscataway,usa)來(lái)以合成方法制備。還將來(lái)自幽門(mén)螺旋桿菌的編碼1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的futc基因(acc.no.aad29868)(seqidno.4，圖4d)以合成方法合成和進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用于在大腸桿菌中表達(dá)。為了克隆至載體pdest14中，分別使用引物6128(seqidno.5)和6129(seqidno.6)(用于wbgl)以及引物6195(seqidno.7)和6196(seqidno.8)(用于futc)來(lái)擴(kuò)增所述基因；引物序列參見(jiàn)下表1：

表1：用于聚合酶鏈反應(yīng)的寡核苷酸列表

根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用pcr隨機(jī)誘變?cè)噭┖?clonetech,mountainview,usa)以及引物6128和6219通過(guò)幾輪易錯(cuò)pcr引入wbgl基因中的突變。將純化的易錯(cuò)pcr產(chǎn)物克隆至載體pdest14中，獲得pdest:wbgl(易錯(cuò))。克隆至載體pdest14中通常是使用gateway技術(shù)(technologymanual(lifetechnologies,carlsbad,usa))進(jìn)行。質(zhì)粒的測(cè)序是通過(guò)lgcgenomics(berlin,germany)進(jìn)行。重組質(zhì)粒是通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)化到合適的大腸桿菌宿主中。

生長(zhǎng)培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)

含有pdest:wbgl(易錯(cuò))質(zhì)粒文庫(kù)的大腸桿菌bl21(de3)是在用1％(v/v)甘油和1％(v/v)蔗糖作為碳源的礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。該培養(yǎng)基由2g/lnh4h2po4、7g/lk2hpo4、2g/lkoh、0.3g/l檸檬酸、0.98g/lmgso4×7h2o和0.02g/lcacl2×6h2o組成。其補(bǔ)充1毫升/升的痕量元素溶液(54.4g/l檸檬酸鐵銨、9.8g/lmncl2×4h2o、1.6g/lcocl2×6h2o、1g/lcucl2×2h2o、1.9g/lh3bo3、9g/lznso4×7h2o、1.1g/lna2moo4×2h2o、1.5g/lna2seo3、1.5g/lniso4×6h2o)。為了進(jìn)行選擇，添加10μg/ml三甲氧芐二氨嘧啶和100μg/ml氨芐青霉素。細(xì)胞在30℃下在96孔微量滴定板上振蕩生長(zhǎng)24小時(shí)。將50μl預(yù)制培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至具有包含0.3mmiptg的400μl新鮮hepes(100mm)緩沖培養(yǎng)基的96孔板中以誘導(dǎo)pdest中的wbgl基因的表達(dá)。誘導(dǎo)的培養(yǎng)物在30℃下振蕩培養(yǎng)2天。通過(guò)離心沉淀細(xì)胞，并將上清液用于檢測(cè)游離l-巖藻糖。

將分別包含pdest:wbgl(h124ae215g)和pdest:futc的大腸桿菌bl21(de3)在2yt肉湯(sambrook,j.andrusselld.w.(1989)molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.)中，在30℃下和存在100μg/ml氨芐青霉素的情況下生長(zhǎng)至od600nm為0.3。通過(guò)添加0.3mmiptg誘導(dǎo)wbgl(h124ae215g)和futc的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)后20h通過(guò)離心收獲細(xì)胞。將細(xì)胞用于體外gdp-l-巖藻糖水解酶活性的分析。

酶測(cè)定以檢測(cè)游離l-巖藻糖和體外gdp-l-巖藻糖水解酶活性

使用催化l-巖藻糖向l-巖藻糖基-1,5-內(nèi)酯的nadp依賴性轉(zhuǎn)化的來(lái)自假單胞菌屬種(pseudomonassp.)1143號(hào)的l-巖藻糖脫氫酶(fudh)(acc.no.d32042)，在比色測(cè)定中測(cè)量游離l-巖藻糖。在該比色測(cè)定中，在存在吩嗪硫酸甲酯的情況下，氮藍(lán)四唑(nitrobluetetrazolium)被nadph還原為藍(lán)紫色甲臜(formazan)。甲臜的形成是在571nm下監(jiān)測(cè)(mayer,k.m.andarnold,f.h.(2002)acolorimetricassaytoquantifydehydrogenaseactivityincrudecelllysates.j.biomol.screen.7,135-140)。

來(lái)自假單胞菌屬種1143號(hào)的fudh基因在大腸桿菌bl21(de3)中過(guò)表達(dá)。通過(guò)使用nisepharose^tm6fastflow柱(gehealthcare,pollardswood,uk)的固定化金屬親和層析從粗提取物中富集包含n末端his6-標(biāo)簽的重組fudh蛋白。

為了在含有pdest:wbgl(易錯(cuò))的巖藻糖大腸桿菌bl21(de3)生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)物中檢測(cè)游離l-巖藻糖，每200μll-巖藻糖脫氫酶測(cè)定反應(yīng)包含50μl細(xì)胞培養(yǎng)物上清液和150μl試劑溶液，所述試劑溶液由0.8mmnadph、0.3mm氮藍(lán)四唑、0.03mm吩嗪硫酸甲酯和具有0.13％(w/v)明膠的50mmtris(ph8.0)中的4.7單位his6-fudh組成(所有化學(xué)品均購(gòu)自sigmaaldrich,st.louis,usa)。孵育10min后，在室溫下于571nm處測(cè)量藍(lán)紫色甲臜的形成。

為了檢測(cè)在大腸桿菌bl21(de3)pdest:wbgl(h124ae215g)和大腸桿菌bl21(de3)pdest:futc的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的gdp-l-巖藻糖水解酶活性，將細(xì)胞重新懸浮于具有5mmmncl2的50mmhepes緩沖液(ph7.5)中，并使用玻璃小珠(glasbeats)和mini-beatbeater(biospecproducs,bartlesville,usa)破碎。在gdp-l-巖藻糖水解酶測(cè)定中，將l-巖藻糖從gdp-l-巖藻糖中裂解下來(lái)。200μl的水解酶測(cè)定包含12.5μl100mmgdp-l-巖藻糖(sigmaaldrich,st.louis,usa)(在50mmhepes緩沖液(ph7.5)中)、5mmmncl2和50μl無(wú)細(xì)胞提取物。

為了驗(yàn)證gdp-l-巖藻糖的穩(wěn)定性，水解酶測(cè)定還可用50μl牛血清白蛋白(30mg/ml)代替粗提取物進(jìn)行。根據(jù)bradford使用市售的染料溶液(carlroth,karlsruhe,germany)估算蛋白濃度。在30℃下孵育一小時(shí)后，通過(guò)加熱至95℃、持續(xù)10min使gdp-l-巖藻糖測(cè)定中的酶失活。使用l-巖藻糖脫氫酶測(cè)定，將50μlgdp-l-巖藻糖水解酶測(cè)定反應(yīng)混合物用于檢測(cè)游離l-巖藻糖。該測(cè)定如上所述進(jìn)行并在室溫下孵育24h。

lc-ms/ms分析

質(zhì)譜分析是使用lc三重四極桿ms檢測(cè)系統(tǒng)(shimadzulc-ms8050)(shimadzucorporation,kyoto,japan)通過(guò)mrm(多反應(yīng)監(jiān)測(cè))進(jìn)行。在1號(hào)四極桿中篩選并分析前體離子(precursorion)，碎裂發(fā)生在使用氬氣作為cid氣體的碰撞室中，碎片離子的篩選是在3號(hào)四極桿中進(jìn)行。

分別用10μgml麥芽三糖的水溶液(lc/msgrade)按1:100稀釋來(lái)自體外測(cè)定的培養(yǎng)物上清液和反應(yīng)混合物后，在具有xbridgeamide保護(hù)柱(3.5μm,2.1×10mm)(waters,usa)的xbridgeamidehplc柱(3.5μm,2.1×50mm)(waters,usa)中進(jìn)行巖藻糖和麥芽三糖的色譜分離。hplc系統(tǒng)由在8℃下運(yùn)行的shimadzunexerax2sil-30acmp自動(dòng)采樣器、shimadzulc-20ad泵和在30℃下運(yùn)行的shimadzucto-20ac柱溫箱組成(shimadzucorporation,kyoto,japan)。流動(dòng)相由含有10mm乙酸銨的乙腈:水(62:38％(v/v))組成。將1μl樣品注射至該儀器中；在300μl/min的流速下運(yùn)行3min。通過(guò)mrm在esi負(fù)電離模式下分析l-巖藻糖和麥芽三糖(作為歸一化的內(nèi)標(biāo)物添加)。質(zhì)譜儀以單位分辨率(unitresolution)運(yùn)行。巖藻糖形成m/z163.2[m-h]的離子和麥芽三糖離子形成m/z503.2[m-h]的離子。l-巖藻糖的前體離子在碰撞室中被進(jìn)一步碎裂成碎片離子m/z88.9、m/z70.8和m/z58.9。麥芽三糖的分子離子(m/z503.2)被碎裂成m/z341.1、m/z161.05和m/z100.9。針對(duì)每個(gè)分析物單獨(dú)優(yōu)化碰撞能量、q1和q3預(yù)偏置(prebias)。

結(jié)果

通過(guò)表達(dá)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌bl21(de3)生產(chǎn)菌株合成游離l-巖藻糖

為了在大腸桿菌bl21(de3)中增強(qiáng)gdp-l-巖藻糖的合成，將編碼磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥(niǎo)苷?；D(zhuǎn)移酶、gdp-甘露糖-4,6-脫水酶和gdp-l-巖藻糖合酶的異源基因整合到基因組中并過(guò)表達(dá)。另外，為了賦予bl21(de3)菌株以蔗糖來(lái)生長(zhǎng)的能力，將來(lái)自大腸桿菌w的編碼蔗糖通透酶、果糖激酶、蔗糖水解酶和轉(zhuǎn)錄抑制因子的csc-基因簇整合至該基因組中。

2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶wbgl催化l-巖藻糖從供體分子gdp-l-巖藻糖轉(zhuǎn)移至受體寡糖上。然而，當(dāng)將包含pdest:wbgl的大腸桿菌bl21(de3)生產(chǎn)菌株在合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，在缺乏受體分子的情況下，可在細(xì)菌培養(yǎng)物上清液中檢測(cè)到游離l-巖藻糖。通過(guò)wbgl的gdp-l-巖藻糖水解酶活性從gdp-巖藻糖中釋放游離l-巖藻糖。

為了進(jìn)一步提高wbgl的gdp-l-巖藻糖水解酶活性，使用易錯(cuò)pcr對(duì)wbgl基因進(jìn)行隨機(jī)誘變。測(cè)試約5000個(gè)含有pdest:wbgl(易錯(cuò))克隆的大腸桿菌bl21(de3)生產(chǎn)菌株的文庫(kù)中的提高的gdp-l-巖藻糖水解酶活性。兩個(gè)克隆(命名為克隆d1和h2)示出增加的游離l-巖藻糖產(chǎn)生，如通過(guò)使用l-巖藻糖脫氫酶測(cè)定進(jìn)行的培養(yǎng)物上清液的分析來(lái)確定(圖1)。在這兩個(gè)克隆中的每一個(gè)的wbgl序列中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)氨基酸置換?？寺1的wbgl變體包含以下氨基酸置換：組氨酸124置換為丙氨酸，谷氨酸215置換為甘氨酸；在克隆h2的wbgl變體中，殘基天冬酰胺69被置換為絲氨酸并且異亮氨酸268被置換為脯氨酸。

還對(duì)包含質(zhì)粒pdest:wbgl、pdest:wbgl(h124ae215g)d1和pdest:wbgl(n69si268p)h2的大腸桿菌bl21(de3)生產(chǎn)菌株的上清液進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析。在每個(gè)樣品中通過(guò)mrm分析鑒定l-巖藻糖。使用麥芽三糖作為歸一化的內(nèi)標(biāo)物，測(cè)定游離l-巖藻糖的量。對(duì)于表達(dá)wbgl野生型基因的菌株，在培養(yǎng)物上清液中測(cè)定0.12g/ll-巖藻糖。wbgl變體(h124a,e215g)和(n69s,i268p)的水解活性明顯升高?？寺1和h2分別產(chǎn)生0.43g/l和0.25g/ll-巖藻糖(圖2)。

在表達(dá)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的微生物的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中檢測(cè)gdp-l-巖藻糖水解酶活性

在存在轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物iptg的情況下生長(zhǎng)的大腸桿菌bl21(de3)pdest:wbgl(h124ae215g)和大腸桿菌bl21(de3)pdest:futc的無(wú)細(xì)胞提取物中分析gdp-l-巖藻糖水解酶活性。2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶futc被描述為在缺乏寡糖底物的情況下水解gdp-l-巖藻糖(stein,d.b.,liny.-n.,lin,c.-h.(2008)characterizationofhelicobacterpyloriα1,2-fucosyltransferaseforenzymaticsynthesisoftumor-associatedantigens.adv.synth.catal.350,2313-2321)。在含有5mmgdp-l-巖藻糖和各個(gè)菌株的細(xì)胞溶解產(chǎn)物的水解酶測(cè)定中，裂解gdp-l-巖藻糖。使用l-巖藻糖脫氫酶測(cè)定法檢測(cè)出游離l-巖藻糖。在含有牛血清白蛋白而不是粗提取物的測(cè)定中沒(méi)有檢測(cè)到游離l-巖藻糖，這證明了gdp-l-巖藻糖的穩(wěn)定性(圖3)。

為了定量由gdp-l-巖藻糖的體外水解釋放的l-巖藻糖，使用離子交換柱(strataabw,phenomenex,aschaffenburg,germany)通過(guò)固相提取來(lái)清除(clear)水解酶測(cè)定并通過(guò)lc-ms/ms來(lái)分析。在包含表達(dá)futc和wbgl(h124ae215g)的菌株的細(xì)胞溶解產(chǎn)物的測(cè)定中，一小時(shí)孵育后分別測(cè)量出0.38g/l和0.32g/l的l-巖藻糖，對(duì)應(yīng)于0.18u/mg的gdp-l-巖藻糖水解酶活性(對(duì)于futc)以及0.21u/mg的gdp-l-巖藻糖水解酶活性(對(duì)于wbgl(h124ae215g))。

序列表

<110>jenneweinbiotechnologiesgmbh

<120>由核苷酸活化的糖產(chǎn)生游離形式的單糖的發(fā)酵方法

<130>2827p110ep

<140>ep15153383.3

<141>2015-01-30

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>6741

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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