一種檢測單糖和二糖的方法及衍生試劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種檢測單糖和二糖的方法及衍生試劑的制備方法。檢測方法步驟包括：(1)將單糖或二糖用衍生試劑衍生；(2)用液相質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)分析衍生后的樣品；所述的衍生試劑包含D3PMP，D5PMP，D8PMP和PMP。本發(fā)明的三種氘代衍生試劑可以與普通PMP任意組合聯(lián)用，也可任意幾種聯(lián)用。將已知量的標準品和未知樣品用不同衍生試劑衍生，用LC-MS分析，可以對微量單糖和糖胺聚糖酶解二糖進行定性和定量。該方法可同時對4種樣品進行分析，可同時對3種未知量樣品進行定量，檢測樣品用量少，操作耗時短。
【專利說明】一種檢測單糖和二糖的方法及衍生試劑的制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種檢測單糖和二糖的方法及衍生試劑的制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(簡稱PMP)，又以腦保護劑“依達拉奉”聞名，在臨床上主要用于用于治療腦梗塞引起的神經(jīng)病變，在糖結(jié)構(gòu)研究中則做為一種衍生制劑，由Honda于1989年最先用于糖鏈的衍生，PMP作為衍生制劑的優(yōu)點是可以在溫和的條件下與還原糖鏈進行定量反應(yīng)，不損失唾液酸，產(chǎn)物沒有立體異構(gòu)體，紫外吸收強，糖鏈經(jīng)PMP衍生后，其疏水性提高的同時，衍生產(chǎn)物帶電荷，易于電離，可以用多種離子模式對其進行分析，用其作為衍生試劑，可以進行單糖的組成分析，檢測限可以達到pmol，同時也可以用于寡糖鏈的分離和純化，還可以提高糖鏈的基質(zhì)輔助激光解析飛行質(zhì)譜檢測的靈敏度。其和糖類反應(yīng)機理為，1,3位取代的吡唑啉酮試劑的4位碳存在α -氫，在堿性環(huán)境下離去成為烯醇式負離子，和糖類物質(zhì)的還原端進行醛酮縮合反應(yīng)，在加熱條件下失水，形成具有α，不飽和酮結(jié)構(gòu)的單分子衍生物，此單分子衍生物會繼續(xù)與另一分子吡唑啉酮試劑的烯醇式負離子進行Michaell，4加成反應(yīng)，最后定量生成具有強烈紫外吸收的雙PMP衍生產(chǎn)物。該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于具有還原端的糖類分析，如專利CN101118230公開了用
0.5mol / L PMP甲醇溶液檢測蟲草多糖的單糖組成。專利CN200810013642公開了用PMP衍生結(jié)合液相色譜分析樣品中喹諾糖的含量。專利CN200810016622公開了用PMP衍生結(jié)合高效液相色譜檢測海參制品中海參多糖的含量。
[0003]液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，將色譜對復(fù)雜樣品的 高分離能力，與質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。
[0004]同位素具有相同的化學(xué)性質(zhì)，離子化能力一致，在液相上的保留時間也是相同，用同位素試劑衍生未知含量和已知量的樣品，可以在同一個時間內(nèi)分析多個樣品，使用已知量樣品可以對未知樣品進行準確定量，從而使質(zhì)譜法成為一種可以對樣品進行精確定量的方法。
[0005]糖胺聚糖是一類由重復(fù)的二糖單元(氨基己糖和己糖糖醛酸)組成的線性高分子多糖，分為肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸角質(zhì)素等。線性高分子糖胺聚糖用酶降解便能得到糖胺聚糖酶解二糖，如將肝素用肝素酶1、肝素酶I1、肝素酶III等肝素酶降解，將硫酸軟骨素用硫酸軟骨素酶ABC降解得到相應(yīng)的糖醛酸脫水二糖。不同種類的糖胺聚糖所具有的二糖重復(fù)單元不同，如肝素和硫酸乙酰肝素的重復(fù)二糖單元是艾杜糖醛酸(IdoA)或葡萄糖醛酸(GlcA)和葡萄糖胺(GlcN);硫酸軟骨素的二糖重復(fù)單元是葡萄糖醛酸(GlcA)和半乳糖醛酸(GalA)。不同種類的糖胺聚糖硫酸化程度不同，硫酸化位置亦不同，如肝素比硫酸乙酰肝素在葡萄糖胺的N硫酸化(GlcNS)程度高，而乙?；?GlcNAc)程度低；硫酸軟骨素A在半乳糖胺的4位硫酸化(GalNAc4S)，而硫酸軟骨素C在半乳糖胺的6位硫酸化(GalNAc6S)。糖胺聚糖有多種生物活性，如肝素是臨床首選的抗凝藥物；硫酸乙酰肝素是細胞表面的信號傳導(dǎo)的重要分子；軟骨素類，透明質(zhì)酸類都有相關(guān)的藥物或保健品已上市。2008年，污染肝素事件造成了至少149人死亡，究其原因，是對糖胺聚糖這類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖研究技術(shù)和方法上存在缺陷，所以確定糖胺聚糖的單糖和二糖是非常必要的。
[0006]目前常用的檢測方法在各種各樣的缺點，如用質(zhì)譜法分析樣品必須先進行質(zhì)子化，而這一過程受外界環(huán)境，樣品中鹽濃度，儀器狀態(tài)諸多因素影響，無法用于定量分析。PMP衍生結(jié)合高效液相色譜法雖然可以對樣品進行定量分析，但需要首先繪制各單糖的標準曲線，然后再計算出待測樣品的濃度，檢測限高，樣品消耗量大，一次只能檢測一個樣品，耗時長。用普通PMP衍生試劑獲得的分離糖PMP衍生物受紫外檢測器靈敏度和單糖本身差異較小的限制，需要標準品和較多的糖樣品才能準確分析，不僅步驟繁瑣，而且對于珍貴的生物樣品來說也是一種浪費。普通衍生方法及試劑(如苯胺和氘代苯胺)最多能同時進行2種樣品的分析，最多能對I種未知樣品定量。當樣品種類較多時，用傳統(tǒng)的方法檢測步驟繁瑣，樣品消耗量大，檢測時間長，傳統(tǒng)的方法已經(jīng)不能夠滿足需要，因此亟需找到一種操作步驟簡單，省時，樣品消耗量小，靈敏度高的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測單糖和二糖的方法，該方法可對單糖和糖胺聚糖酶解二糖進行定性和定量分析。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供三種衍生試劑1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)的制備方法。
[0009]實現(xiàn)上述發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0010]1.一種檢測單糖和二糖的方法，包括如下步驟:
[0011](I)將單糖或二糖用衍生試劑衍生；
[0012](2)用LC-MS分析衍生后的樣品；
[0013]所述的衍生試劑包含1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1_氘代苯基-3-甲基-5-卩比唑啉酮(D5PMP)，1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-卩比唑啉酮(D8PMP)和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)；
[0014]所述的衍生試劑PMP與D3PMP、D8PMP中任意一種聯(lián)用；
[0015]所述的衍生試劑PMP與D3PMP、D5PMP、DSPMP任意兩種或三種聯(lián)用；
[0016]所述的衍生試劑D3PMP、D5PMP、D8PMP任意幾種聯(lián)用。
[0017]2.一種檢測單糖和二糖的方法，所述的單糖為動物、植物和微生物來源的多糖及寡糖的基本組成單元，所述的二糖為酶解糖胺聚糖所得的二糖。
[0018]3.制備衍生試劑D3PMP的方法，包括如下步驟:
[0019](I)取氘代乙酸，加入乙醇，氯化亞錫搖勻后，70-90°C加熱回流l_5h，蒸餾出液體，生成氘代乙酸乙酯，將氘代乙酸乙酯用飽和CaCl2及硫酸鎂干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯；
[0020](2)向干燥后的氘代乙酸乙酯中加入金屬鈉，冷凝回流，再加入50%的醋酸，調(diào)節(jié)PH至6-7，用飽和氯化鈉靜置分層，轉(zhuǎn)移上層液體，用無水硫酸鈉進行干燥，得氘代乙酰乙酸乙酯；
[0021](3)取苯肼加入乙醇中，再加入步驟(2)所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于70_85°C條件下反應(yīng)10h，冷卻過濾得D3PMP ；
[0022]所述的氘代乙酸和乙醇體積比為1:2_5 ；
[0023]所述的苯肼和氘代乙酰乙酸乙酯物質(zhì)的量比為1:0.2-0.8。
[0024]化學(xué)反應(yīng)方程式如下:
[0025]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測單糖和二糖的方法，包括如下步驟: (1)將單糖或二糖用衍生試劑衍生； (2)用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)分析衍生后的樣品； 其特征在于，所述的衍生試劑包含1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(D5PMP)，1-氘代苯基-3-氘代甲基_5_吡唑啉酮(D8PMP)和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)； 所述的衍生試劑PMP與D3PMP、D8PMP中任意一種聯(lián)用； 所述的衍生試劑PMP與D3PMP、D5PMP、D8PMP任意兩種或三種聯(lián)用； 所述的衍生試劑D3PMP、D5PMP、D8PMP任意幾種聯(lián)用。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測單糖和二糖的方法，其特征在于，所述的單糖為動物、植物和微生物來源的多糖及寡糖的基本組成單元，所述的二糖為酶解糖胺聚糖所得的二糖。
3.制備如權(quán)利要求1或2任意一項所述的衍生試劑D3PMP的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)取氘代乙酸，加入乙醇，氯化亞錫搖勻后，70-90°C加熱回流l_5h，蒸餾出液體，生成氘代乙酸乙酯，將氘代乙酸乙酯用飽和CaCl2及硫酸鎂干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯； (2)向干燥后的氘代乙酸乙酯中加入金屬鈉，冷凝回流，再加入50%的醋酸，調(diào)節(jié)pH至6-7，用飽和氯化鈉靜置分層·，轉(zhuǎn)移上層液體，用無水硫酸鈉進行干燥，得氘代乙酰乙酸乙酷； (3)取苯肼加入乙醇中，再加入步驟(2)所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于70-85°C條件下反應(yīng)10h，冷卻過濾得D3PMP ； 所述的氘代乙酸和乙醇的體積比為1:2_5 ； 所述的苯肼和氘代乙酰乙酸乙酯的物質(zhì)的量之比為1:0.2-0.8。
4.制備如權(quán)利要求1或2任意一項所述的衍生試劑D3PMP的方法，其特征在于，所述的氘代乙酸和乙醇的體積比為1:2，苯肼和氘代乙酰乙酸乙酯的物質(zhì)的量之比為1:0.8。
5.制備如權(quán)利要求1或2任意一項所述的衍生試劑D8PMP的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)取氘代乙酸，加入乙醇，氯化亞錫搖勻后，70-90°C加熱回流l_5h，蒸餾出液體，生成氘代乙酸乙酯，將氘代乙酸乙酯用飽和CaCl2及硫酸鎂干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯； (2)向干燥后的氘代乙酸乙酯中加入金屬鈉，冷凝回流，再加入50%的醋酸，調(diào)節(jié)pH至6-7，用飽和氯化鈉靜置分層，轉(zhuǎn)移上層液體，用無水硫酸鈉進行干燥，得氘代乙酰乙酸乙酷； (3)取30%鹽酸與水，滴加氘代苯胺，在0-5°C條件下滴加71.8%亞硝酸鈉溶液，攪拌并保持0-5°C反應(yīng)3-5h，得重氮化氘代苯。向重氮化氘代苯中加入亞硫酸氫鈉，25%氨水和水，升溫至70~85°C，回流反應(yīng)4h，放入4°C冰箱降溫，過濾得氘代苯肼鹽酸鹽。向氘代苯肼鹽酸鹽中加入水,加熱到50°C，滴加IOM的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10-11，攪拌30min，加入乙酸乙酯萃取3次，減壓蒸餾得到氘代苯肼；(4)將步驟(3)所得的氘代苯肼溶于乙醇中，加入步驟(2)所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于70-85°C條件下反應(yīng)10h，冷卻過濾，得D8PMP ； 所述的氘代乙酸和乙醇的體積比為1:2 ； 所述的氘代苯胺與亞硝酸鈉的物質(zhì)的量之比為1:1 ; 所述的氘代苯肼與氘代乙酰乙酸乙酯的物質(zhì)的量之比為1:0.7。
【文檔編號】G01N30/02GK103592386SQ201310561747
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月9日
【發(fā)明者】張麗娟, 韓章潤, 曾洋洋, 蘭瑩, 邱培菊 申請人:中國海洋大學(xué)