本發(fā)明涉及一種喹啉類化合物的鹽，其晶型、制備方法、組合物與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：化合物3-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-[1,2,3]三唑并[4，5-b]吡嗪-1-基)甲基)喹啉，簡(jiǎn)稱sph1772(結(jié)構(gòu)如下式所示)，該化合物已經(jīng)公開于專利cn104109166a中。sph1772是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hgf)受體酪氨酸激酶c-met的高效選擇性的研究性口服不可逆抑制劑。sph1772正在被開發(fā)治療若干實(shí)體腫瘤，包括非小細(xì)胞肺癌(nsclc)、肝癌、腸癌和卵巢癌，和各種其他癌癥。多晶型現(xiàn)象(不同晶體形式的出現(xiàn))是某些分子和分子復(fù)合體的性質(zhì)。單分子可能導(dǎo)致具有不同晶體結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)的各種多晶型，所述物理性質(zhì)像熔點(diǎn)、熱行為(例如通過(guò)熱重分析-“tga”、或差示掃描量熱法(dsc)測(cè)定)、x射線粉末衍射(xrpd或粉末xrd)圖、紅外線吸收指紋以及固態(tài)核磁共振(nmr)光譜。這些技術(shù)中的一種或多種可以用于區(qū)別化合物的不同多晶型物。發(fā)現(xiàn)可以提供具有合意加工性質(zhì)的材料，所述的合意處理性質(zhì)如易于處理、易于加工、存儲(chǔ)穩(wěn)定性和易于提純或用作促進(jìn)轉(zhuǎn)化成其他多晶型物的合意的中間晶體形式?？伤幱没衔锘蚱潲}的多晶型物和溶劑化物也可提供改進(jìn)藥物的性能特征的機(jī)會(huì)。其擴(kuò)展了制劑研究員可用于例如通過(guò)向產(chǎn)品提供不同的性質(zhì)(例如，更佳加工或處理特征，改善的溶解特征，或改善的儲(chǔ)存期限)來(lái)制劑優(yōu)化的材料清單。至少出于這些原因，需要sph1772游離堿和其鹽的固態(tài)形式。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種喹啉類化合物的鹽，其晶型、制備方法、組合物與應(yīng)用。本發(fā)明的sph1772二酒石酸鹽或其晶型a可表出以下的優(yōu)異的性質(zhì)：穩(wěn)定性高，生物利用率好，藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)優(yōu)異，比sph1772游離堿優(yōu)異的體內(nèi)藥效。本發(fā)明提供了一種喹啉類化合物sph1772的二酒石酸鹽，所述的喹啉類化合物sph1772的二酒石酸鹽中的酒石酸優(yōu)選為l-酒石酸(即所述的喹啉類化合物sph1772的二酒石酸鹽的結(jié)構(gòu)為本發(fā)明提供了一種如上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a，其以衍射角為2θ表示的x-射線粉末衍射圖在7.5±0.2°、9.2±0.2o、14.5±0.2°、16.6±0.2°、20.3±0.2°和28.8±0.2°處有特征峰；所述的x-射線粉末衍射中使用的靶型為cu靶。優(yōu)選地，所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a以衍射角為2θ表示的x-射線粉末衍射圖在如表1左側(cè)欄所示的數(shù)值處有特征峰：表1：sph1772二酒石酸鹽的晶型a的xrpd峰列表作為優(yōu)選，所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a在以衍射角為2θ表示的x-射線粉末衍射圖的特征峰和相對(duì)強(qiáng)度值如表1所示。作為優(yōu)選，所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a在以衍射角為2θ表示的x-射線粉末衍射圖如圖1所示。作為優(yōu)選，所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a的熔點(diǎn)為202℃。作為優(yōu)選，所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a的dsc顯示199.4℃處有主要吸熱峰(dsc為差示掃描量熱法)。本發(fā)明中喹啉類化合物sph1772二酒石酸鹽的制備，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本申請(qǐng)實(shí)施例公開的內(nèi)容及及本領(lǐng)域常識(shí)進(jìn)行制備。本發(fā)明還提供了所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a的制備方法，包括以下步驟：有機(jī)溶劑中，將化合物sph1772與酒石酸進(jìn)行反應(yīng)，即可；其中，所述的有機(jī)溶劑為醇類溶劑、酯類溶劑、dcm:meoh＝6:1～9:1v/v、醚類溶劑或酮類溶劑。所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a的制備方法中，所述的醇類溶劑優(yōu)選甲醇；所述的酯類溶劑優(yōu)選乙酸乙酯；所述的醚類溶劑優(yōu)選四氫呋喃；所述的酮類溶劑優(yōu)選丙酮。所述的有機(jī)溶劑與所述的sph1772的體積質(zhì)量比優(yōu)選40ml/g～80ml/g，更優(yōu)選60～70ml/g；所述的sph1772與所述的酒石酸的摩爾比優(yōu)選1:2.0～1:2.2，更優(yōu)選1:2.1；所述的反應(yīng)的溫度優(yōu)選40～60℃，更優(yōu)選50℃；所述的反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選24h～72h，更優(yōu)選24h～48h。所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a的制備方法中，優(yōu)選包括以下步驟：將所述的酒石酸加入到“所述的化合物sph1772和所述的有機(jī)溶劑的混合物”中，反應(yīng)即可。所述的酒石酸的加入時(shí)間優(yōu)選1～5min，更優(yōu)選2min；所述的酒石酸還可以以“酒石酸的所述有機(jī)溶劑的溶液”形式參與反應(yīng)，所述“酒石酸的所述有機(jī)溶劑的溶液”中，所述的有機(jī)溶劑與所述的酒石酸的體積摩爾比優(yōu)選3.5:1～4.5:1ml/mmol，更優(yōu)選4:1ml/mmol。當(dāng)所述的酒石酸以“酒石酸的所述有機(jī)溶劑的溶液”形式參與反應(yīng)時(shí)，“酒石酸的所述有機(jī)溶劑的溶液”的加入速率優(yōu)選為1～5ml/min，更優(yōu)選為2.5ml/min。所述的化合物sph1772和所述的有機(jī)溶劑的混合方式優(yōu)選為將所述的化合物sph1772加入到所述的有機(jī)溶劑中，得到“所述的化合物sph1772和所述的有機(jī)溶劑的混合物”。所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a的制備方法中，所述的反應(yīng)結(jié)束之后還可包括后以下處理的步驟：將反應(yīng)液過(guò)濾，得到所述的sph1772二酒石酸的晶型a，即可。其中，所述的過(guò)濾之后還可進(jìn)一步包括用所述的有機(jī)溶劑洗滌濾餅的操作。所述的過(guò)濾之后還可進(jìn)一步包括干燥濾餅的操作；所述的干燥優(yōu)選真空干燥；所述的真空干燥的溫度優(yōu)選40～60℃，更優(yōu)選50℃。本發(fā)明提供了一種sph1772二酒石酸鹽的晶型b的制備方法，其由以下任一方法制備：方法一：將上述制備得到的sph1772二酒石酸鹽的晶型a進(jìn)行氣液滲透結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，即可；其中，良溶劑為thf:h2o＝19:1v/v；反溶劑為丁酮(mek)。方法二，將上述制備得到的sph1772二酒石酸鹽的晶型a的1,4-二氧六環(huán)溶液，進(jìn)行常溫?fù)]發(fā)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，即可。方法三，將上述制備得到的sph1772二酒石酸鹽的晶型a進(jìn)行高聚物誘導(dǎo)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，即可；其中，當(dāng)高聚物為聚乙烯吡咯烷酮(pvp)：聚乙烯醇(pva)：聚氯乙烯(pvc)：聚醋酸乙烯酯(pvac)：羥丙基甲基纖維素(hpmc)：甲基纖維素(mc)的質(zhì)量比為1:1:1:1:1:1時(shí)，溶劑為1,4-二氧六環(huán)；當(dāng)高聚物為聚己內(nèi)酯(pcl)：聚乙二醇(peg)：聚甲基丙基酸甲酯(pmma)：海藻酸鈉(sa)：羥乙基纖維素(hec)的質(zhì)量比為1:1:1:1:1時(shí)，溶劑為1,4-二氧六環(huán)，或四氫呋喃：水＝19:1v/v。本發(fā)明需要說(shuō)明，氣液滲透結(jié)晶實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域中常規(guī)的一種晶型的制備方法，具體操作為：將裝有“化合物的良溶劑的飽和溶液”的小器皿開口置于裝有反溶劑的大器皿中，將大器皿密封、靜置，當(dāng)有固體析出的時(shí)候，收集固體即可；其中，小器皿不可以沒(méi)入到大器皿中的反溶劑中。本發(fā)明所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型b的制備方法的方法一中，優(yōu)選與以下步驟：所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a的良溶劑的飽和溶液的制備方法可以為將sph1772二酒石酸鹽的晶型a與所述的良溶劑混合均勻，取上層清液即可；其中，所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a與所述的良溶劑的質(zhì)量體積比優(yōu)選4～6mg/ml。本發(fā)明需要說(shuō)明，常溫?fù)]發(fā)結(jié)晶試驗(yàn)是本領(lǐng)域中常規(guī)的一種晶型的制備方法，具體操作為：將裝有“化合物的溶劑的澄清溶液”的器皿用封口膜密封，置于室溫下，將封口膜上刺幾個(gè)(如2～4個(gè))小孔后放置自然揮發(fā)，揮干后得到固體，即可。本發(fā)明所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型b的制備方法的方法二中，所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a的1,4-二氧六環(huán)溶液的制備方法可以為：將所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a與1,4-二氧六環(huán)混合，取澄清液即可；所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a與1,4-二氧六環(huán)的質(zhì)量體積比優(yōu)選5～10mg/ml。本發(fā)明需要說(shuō)明，高聚物誘導(dǎo)結(jié)晶試驗(yàn)是本領(lǐng)域中常規(guī)的一種晶型的制備方法，具體操作為：將化合物的溶劑的飽和溶液與高聚物混合充分后(一般采用超聲使其混合充分)，用封口膜蓋住器皿并在上面扎孔，置于室溫條件下?lián)]發(fā)，收集固體，即可。本發(fā)明所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型b的制備方法的方法三中，所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a的飽和溶液與所述的高聚物的體積質(zhì)量比優(yōu)選0.75:1～1.5:1。本發(fā)明還提供了一種由上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型b的制備方法制得的sph1772二酒石酸鹽的晶型b。本發(fā)明提供了一種sph1772二酒石酸鹽的晶型c的制備方法：其包括以下步驟：將所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a進(jìn)行氣固滲透結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，即可；其中，溶劑為n,n-二甲基甲酰胺。本發(fā)明需要說(shuō)明，氣固滲透結(jié)晶實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域中常規(guī)的一種晶型的制備方法，具體操作為：將裝有化合物的小器皿開口置于裝有溶劑的大器皿中，將大器皿密封、靜置，當(dāng)有固體析出的時(shí)候，收集固體即可。本發(fā)明所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型c的制備方法中，所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a與所述的溶劑的質(zhì)量體積比優(yōu)選4～7mg/ml，更優(yōu)選5mg/ml。本發(fā)明還提供了一種由上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型c的制備方法制得的sph1772二酒石酸鹽的晶型c。本發(fā)明提供了一種sph1772二酒石酸鹽的晶型d的制備方法：其包括以下步驟：將上述制備得到的sph1772二酒石酸鹽的晶型a進(jìn)行氣固滲透結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，即可；其中，溶劑為dmso。本發(fā)明所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型d的制備方法中，所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a與所述的溶劑的質(zhì)量體積比優(yōu)選4～7mg/ml，更優(yōu)選5mg/ml。本發(fā)明還提供了一種由上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型d的制備方法制得的sph1772二酒石酸鹽的晶型d。本發(fā)明提供一種如上所述的sph1772的二酒石酸鹽制備酪氨酸激酶c-met抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種如上所述的sph1772的二酒石酸鹽在制備治療和/或預(yù)防與酪氨酸激酶c-met的過(guò)表達(dá)或活性相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種如上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a制備酪氨酸激酶c-met抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種如上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型a在制備治療和/或預(yù)防與酪氨酸激酶c-met的過(guò)表達(dá)或活性相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包括有效量的sph1772的二酒石酸鹽，以及藥學(xué)上可接受輔料。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包括有效量的sph1772二酒石酸鹽的晶型a，以及藥學(xué)上可接受輔料。本發(fā)明提供一種如上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型b、如上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型c和如上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型d中的一種或幾種，在制備酪氨酸激酶c-met抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種如上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型b、如上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型c和如上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型d中的一種或幾種，在制備治療和/或預(yù)防與酪氨酸激酶c-met的過(guò)表達(dá)或活性相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包括如上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型b、如上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型c和如上所述的sph1772二酒石酸鹽的晶型d中的一種或幾種，以及藥學(xué)上可接受輔料。本發(fā)明中，所述的藥學(xué)上可接受輔料為本領(lǐng)域中的常規(guī)藥用輔料，其選擇因施用途徑和作用特點(diǎn)而異，較佳的包括填充劑、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、乳化劑、助懸劑。本發(fā)明中，所述的藥物組合物可以口服、注射(靜脈、肌肉、皮下和冠狀動(dòng)脈內(nèi))、舌下、經(jīng)頰、經(jīng)直腸、經(jīng)尿道、經(jīng)陰道、經(jīng)鼻、吸入或局部途徑施用。優(yōu)選的途徑是口服。本發(fā)明中，所述的與酪氨酸激酶c-met的過(guò)表達(dá)或活性相關(guān)疾病為本領(lǐng)域中常規(guī)的由酪氨酸激酶c-met的變化所引起的疾病，較佳的包括癌癥、肌肉骨骼肉瘤、軟組織肉瘤、造血系統(tǒng)惡性腫瘤和其他腫瘤。所述的癌癥較佳的包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、肝癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和甲狀腺癌；所述的肌肉骨骼肉瘤較佳的包括：骨肉瘤、滑膜肉瘤和橫紋肌肉瘤；所述的軟組織肉瘤較佳的包括：惡性纖維組織細(xì)胞瘤/纖維肉瘤、平滑肌肉瘤和卡波濟(jì)氏肉瘤；所述的造血系統(tǒng)惡性腫瘤較佳的包括：多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、成人型t細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病和慢性粒細(xì)胞白血??；所述的其他腫瘤較佳的包括：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、黑色素瘤、間皮瘤和胚胎性癌肉瘤。本發(fā)明中的酒石酸如無(wú)特殊說(shuō)明，一般指l-酒石酸。例如，所述的sph1772的二酒石酸鹽以及其a～d晶型中的的酒石酸一般均為l-酒石酸鹽。l-酒石酸的結(jié)構(gòu)為本申請(qǐng)中喹啉類化合物sph1772鹽或其多晶型(sph1772的二酒石酸鹽或其晶型a)稱為大體上通過(guò)“如圖中所示”的圖形數(shù)據(jù)表征，這些數(shù)據(jù)包括(例如)粉末x射線衍射圖、ftir光譜和固態(tài)nmr光譜。技術(shù)人員將理解，由于技術(shù)人員熟知的諸如儀器響應(yīng)的變化和樣品濃度和純度變化之類因素，數(shù)據(jù)的這些圖示可能經(jīng)受諸如峰相對(duì)強(qiáng)度和峰位置之類的小變化。盡管如此，技術(shù)人員將容易能夠?qū)⒈疚膱D中的圖形數(shù)據(jù)與未知結(jié)晶形式產(chǎn)生的圖形數(shù)據(jù)比較并且確認(rèn)兩組圖形數(shù)據(jù)是表征相同的晶體形式或還是兩種不同的晶體形式。sph1772二酒石酸鹽或其晶型a在本文被稱為通過(guò)“如圖中所示”圖形數(shù)據(jù)表征，因此將被理解為可包括用具有與附圖相比的這些小變化(如技術(shù)人員熟知)的圖形數(shù)據(jù)表征的sph1772二酒石酸鹽或其晶型a的任何結(jié)晶形式。術(shù)語(yǔ)xrpd和pxrd在科學(xué)文獻(xiàn)中被粉末x射線衍射分析領(lǐng)域技術(shù)人員互換地使用，并且本申請(qǐng)?jiān)谶@兩種表述或其縮寫之間未做區(qū)別。如本文中所用，除非另外說(shuō)明，否則使用銅ka輻射波長(zhǎng)進(jìn)行xrpd測(cè)定。物品(例如反應(yīng)混合物)可能在本文中特征在于處于、或允許達(dá)到“室溫”，通?？s寫為“rt”。這意味著物品的溫度接近于空間的溫度，或與空間的溫度相同，該空間例如該物品所位于的房間或通風(fēng)櫥。典型地，室溫為約20℃至約30℃，或約22℃至約27℃，或約25℃。方法或步驟在本文可以被稱為“過(guò)夜”。這是指例如方法或步驟的時(shí)間間隔，其跨越方法或步驟可能未被積極地觀察時(shí)的夜晚時(shí)間。該時(shí)間間隔為約8至約20小時(shí)，或約10至18小時(shí)，典型地約16小時(shí)。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“減壓”是指約10mbar至約50mbar的壓力。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“分離”是關(guān)于以下任一種：本發(fā)明的sph1772鹽或其多晶型，并且對(duì)應(yīng)于從其形成的反應(yīng)混合物中物理分離的所述sph1772或sph1772鹽多晶型。本發(fā)明涉及活性藥用成分api(例如sph1772的二酒石酸鹽或其晶型a)含有sph1772的個(gè)別光學(xué)異構(gòu)體，個(gè)別對(duì)映體的混合物或外消旋體。本發(fā)明的sph1772的二酒石酸鹽或其晶型a通常呈現(xiàn)降低的吸濕性。因?yàn)檫@些鹽不像本領(lǐng)域中比較性鹽那樣強(qiáng)的吸水，所以他們?cè)谏w侖制劑中具有優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選地，本發(fā)明的sph1772的二酒石酸鹽的晶型a至少呈部分結(jié)晶形式，更高程度的結(jié)晶度導(dǎo)致sph1772更穩(wěn)定的鹽。優(yōu)選地，本發(fā)明的sph1772的二酒石酸鹽的水含量小于0.1至8重量％、更優(yōu)選地0.5至5重量％、還更優(yōu)選0.8至3.5重量％。根據(jù)本發(fā)明sph1772的二酒石酸鹽或其晶型a優(yōu)選以分離和基本上純的形式例如>95重量％、優(yōu)選>98重量％、更優(yōu)選>99重量％的純度存在。本發(fā)明的sph1772二酒石酸鹽或其晶型a優(yōu)選以微粒形式存在。在不違背本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明的sph1772二酒石酸鹽或其晶型a可表出以下的優(yōu)異的性質(zhì)：穩(wěn)定性高，生物利用率好，藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)好，比sph1772游離堿優(yōu)異的體內(nèi)藥效。附圖說(shuō)明圖1為sph1772二酒石酸鹽的晶型a的xrpd圖。圖2為sph1772的晶型a的xrpd圖。圖3為sph1772的晶型b的xrpd圖。圖4為sph1772一酒石酸鹽的晶型a的xrpd圖。圖5為效果實(shí)施例3中受試化合物在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)濃度曲線。圖6為效果實(shí)施例3中受試化合物在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)濃度分布柱狀圖。圖7為效果實(shí)施例3中受試化合物在大鼠體內(nèi)達(dá)峰濃度柱狀圖。圖8為mhcc97h人源肝癌模型中各治療組和對(duì)照組小鼠腫瘤體積的生長(zhǎng)變化曲線。圖9為lu2503人源肺腫瘤小鼠模型中各治療組和對(duì)照組的腫瘤體積變化曲線。具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。本申請(qǐng)效果實(shí)施例中，單位m的含義為mol/l，nm的含義為nmol/l，mm的含義為mmol/l。除了特別聲明，下述實(shí)施例中涉及的酒石酸為l-酒石酸。除了特別聲明，本發(fā)明的實(shí)施例涉及的設(shè)備及測(cè)試方法如下：xrpd圖：在panalytacalempyrean粉末x射線衍射儀上分析樣品；測(cè)定條件如下：殘余水分含量：根據(jù)如ph.eur.第6版，2008，章節(jié)2.5.12中所述karlfischer方法測(cè)定。使用mettlertoledodl31karlfischer滴定器進(jìn)行測(cè)定。通常，分析50mg至100mg鹽樣品。ir：漫反射模式的perkinelmer型dsc：taq200/2000差示掃描量熱儀；tga：taq500/5000熱重分析儀參數(shù)tgadsc方法線性升溫線性升溫樣品盤鉑金盤，敞開鋁盤，壓蓋溫度范圍室溫-設(shè)定溫度25℃–設(shè)定溫度掃描速率(℃/分鐘)1010保護(hù)氣體氮?dú)獾獨(dú)馊埸c(diǎn)：labindiavisual熔化范圍裝置；hplc：高效液相色譜高效液相色譜在agilent1100和1260hplc上采集。液態(tài)核磁(solutionnmr)：液態(tài)核磁譜圖在bruker400m核磁共振儀上采集，dmso-d6作為溶劑。實(shí)施例1：sph1772的晶型a向配備有磁針、溫度計(jì)和氮?dú)馇虻娜i圓底燒瓶裝填5.0g(11.8mmol)sph1772和100mldmf的混合物加熱至110℃，慢慢溶解至澄清溶液，在此溫度下繼續(xù)攪拌30分鐘，停止加熱并在室溫下靜置過(guò)夜。過(guò)濾，濾餅用20mldmf洗滌。將上述濾餅轉(zhuǎn)移至配備有磁針、溫度計(jì)和氮?dú)馇虻娜i圓底燒瓶，加入100ml無(wú)水乙醇?；旌衔锛訜嶂?0℃，并在此溫度下繼續(xù)攪拌2小時(shí)，停止加熱并在冷卻至室溫。過(guò)濾，濾餅用20ml無(wú)水乙醇洗滌。置于真空干燥箱內(nèi)50℃干燥2小時(shí)以提供4.0g(80％)白色產(chǎn)品。sph1772的晶型a的xrpd峰列表如下所示：xrpd圖如圖2所示。dsc顯示273.0℃處的主要吸熱峰。ir(cm-1)：3432.3，1618.2，1575.9，1541.7，1195.9，1126.6，1099.6，917.8，817.7和616.9。殘余溶劑-未檢測(cè)到。熔點(diǎn)＝270.5℃。1hnmr(δppm，dmso-d6，400mhz)9.22(s，1h)，9.17(d，j＝2.4hz，1h)，8.64(s，1h)，8.46(d，j＝1.6hz，1h)，8.37(s，1h)，8.31(s，1h)，8.07(s，1h)，7.99(d，j＝8.8hz，1h)，7.84(d，j＝1.2hz，1h)，7.76(dd，j1＝8.4hz，j2＝2.0hz，1h)，6.15(s，2h)，3.95(s，3h)，3.90(s，3h)。實(shí)施例2：sph1772二酒石酸鹽的晶型a的制備將乙酸乙酯(10ml)加入sph1772游離堿250.8mg(0.59mmol)并且該混合物在室溫下攪拌以獲得白色懸濁液，經(jīng)歷兩分鐘的過(guò)程添加187.5mg(1.25mmol)酒石酸在乙酸乙酯(5ml)中的溶液。該混合物在50℃下攪拌24小時(shí)。過(guò)濾，濾餅用meoh(5ml)漂洗，將固體樣品轉(zhuǎn)移至50℃真空烘箱干燥過(guò)夜，得370.5mg(86.3％收率)的白色固體。dsc顯示199.4℃下的主要吸熱峰。xrpd圖如圖1所示，具體xrpd峰列表如下：ir(cm-1)：3415.3，3225.4，3117.1，2356.6，1742.6，1714.0，1579.5，1541.8，1191.2，1135.7，1076.4，873.7和608.2。殘余溶劑-未檢測(cè)到。熔點(diǎn)＝202℃。1hnmr表明存在酒石酸鹽。1hnmr(δppm，dmso-d6，400mhz)9.22(s，1h)，9.18(d，j＝0.4hz，1h)，8.64(s，1h)，8.46(d，j＝0.4hz，1h)，8.37(s，1h)，8.31(s，1h)，8.07(s，1h)，7.99(d，j＝0.8hz，1h)，7.84(d，j＝1.2hz，1h)，7.76(dd，j1＝8.4hz，j2＝2.0hz，1h)，6.16(s，2h)，4.33(s，4h)，3.95(s，3h)，3.90(s，3h)。實(shí)施例3sph1772酒石酸鹽的多晶型研究本實(shí)施例中使用的sph1772二酒石酸鹽的晶型a均為實(shí)施例2制備得到。多晶型試驗(yàn)設(shè)置在96種條件下進(jìn)行，包括反溶劑添加、室溫?cái)嚢璺?、氣固滲透、氣液滲透、緩慢降溫、常溫?fù)]發(fā)和高聚物誘導(dǎo)等方法。試驗(yàn)中所得固體已全部分離表征。(1)反溶劑添加法：稱取15毫克sph1772二酒石酸鹽的晶型a于20毫升小瓶中，加入相應(yīng)良溶劑溶解固體后，邊攪拌邊逐滴添加反溶劑，有固體析出后離心分離固體。若加入15毫升反溶劑且攪拌過(guò)夜后仍無(wú)固體析出，則放置室溫?fù)]發(fā)分離出固體。具體反應(yīng)的結(jié)果見表2：表2反溶劑添加的溶劑及晶型種類注：表中acetone:h2o＝4:1,v/v；*表示固體由5℃攪拌過(guò)夜得到；**表示固體由室溫?fù)]發(fā)得到。反溶劑添加法在18種試驗(yàn)條件下進(jìn)行，獲得晶型包括sph1772一酒石酸鹽晶型a、sph1772的晶型a、sph1772的晶型b。(2)氣固滲透的方法：稱取10毫克sph1772二酒石酸鹽的晶型a于3毫升小瓶中，另在20毫升小瓶中加入2毫升溶劑，將3毫升小瓶敞口置于20毫升小瓶中后，將20毫升小瓶密封。室溫下靜置7天后收集固體。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見表3。表3、氣固滲透試驗(yàn)的溶劑及獲得晶型試驗(yàn)編號(hào)溶劑晶型sph-b-a1h2osph1772二酒石酸鹽晶型asph-b-a2dcmsph1772二酒石酸鹽晶型asph-b-a3etohsph1772二酒石酸鹽晶型asph-b-a4meohsph1772二酒石酸鹽晶型asph-b-a5acnsph1772二酒石酸鹽晶型asph-b-a6thfsph1772二酒石酸鹽晶型asph-b-a7chcl3sph1772二酒石酸鹽晶型asph-b-a8meksph1772二酒石酸鹽晶型asph-b-a9acetonesph1772二酒石酸鹽晶型asph-b-a10dmfsph1772二酒石酸鹽晶型csph-b-a11etoacsph1772二酒石酸鹽晶型asph-b-a121,4-dioxanesph1772二酒石酸鹽晶型asph-b-a13ipasph1772二酒石酸鹽晶型asph-b-a14dmsosph1772二酒石酸鹽晶型d氣固滲透在14種試驗(yàn)條件下進(jìn)行，獲得晶型包括sph1772二酒石酸鹽的晶型a、sph1772二酒石酸鹽的晶型c、sph1772二酒石酸鹽的晶型d。(3)室溫?cái)嚢璺ǎ悍Q取15毫克sph1772二酒石酸鹽的晶型a于1.5毫升小瓶中，加入1.0毫升不同溶劑或混合溶劑配成渾濁液，置于設(shè)定溫度為25℃的磁力攪拌(轉(zhuǎn)速為800rpm)，約3.5天后離心分離固體，攪拌后變?yōu)槌吻宓臉悠穭t放置室溫下?lián)]發(fā)分離出固體。具體結(jié)果見表4：表4室溫?cái)嚢柙囼?yàn)的溶劑及獲得晶型其中，aw表示水活度室溫?cái)嚢柙?9種條件下進(jìn)行，獲得晶型為sph1772二酒石酸鹽的晶型a。(4)50℃攪拌試驗(yàn)：稱量15毫克每份的sph1772二酒石酸鹽的晶型a至1.5毫升玻璃小瓶中，分別加入0.5毫升表5中所列的溶劑，得到懸浮液在50℃下攪拌3.5天后，離心收集固體并進(jìn)行xrpd測(cè)試。試驗(yàn)結(jié)果見表5。表550℃攪拌試驗(yàn)的溶劑及獲得晶型如下表：50℃攪拌在14種條件下進(jìn)行，獲得晶型為sph1772二酒石酸鹽的晶型a。(5)緩慢降溫試驗(yàn)：稱取30毫克sph1772二酒石酸鹽的晶型a于3毫升小瓶中，加入1.0毫升不同的溶劑，在50℃攪拌約2小時(shí)并過(guò)濾后得其飽和溶液，將該溶液以0.1℃/分鐘降溫至5℃后析出固體。未析出固體的樣品至室溫下進(jìn)行揮發(fā)分離出固體。具體結(jié)果見表6。表6緩慢降溫試驗(yàn)的溶劑及獲得晶型試驗(yàn)編號(hào)溶劑(v:v)晶型sph-e-a1*1,4-dioxane無(wú)定形sph-e-a22-methf無(wú)定形sph-e-a3*acetone無(wú)定形sph-e-a4*etoac無(wú)定形sph-e-a5*acn無(wú)定形sph-e-a6thf/h2o(19:1)無(wú)定形注：*表示固體通過(guò)室溫敞口揮發(fā)得到。緩慢降溫在6種條件下進(jìn)行，獲得晶型為sph1772酒石酸鹽無(wú)定型。(6)氣液滲透試驗(yàn)：稱取15毫克sph1772二酒石酸鹽的晶型a于3毫升小瓶中，分別加入2.5毫升表7中的溶劑，過(guò)濾取上清液于3毫升小瓶中，另取20毫升的小瓶并向其中加入約3毫升的反溶劑，將3毫升小瓶敞口置于20毫升小瓶中，密封并于室溫下靜置。當(dāng)觀察到有固體析出時(shí)則取出固體測(cè)xrpd。具體結(jié)果見表7。表7氣液滲透試驗(yàn)的溶劑及獲得晶型注：thf:h2o＝19:1,v/v。氣液擴(kuò)散在13種條件下進(jìn)行，獲得晶型包括sph1772二酒石酸鹽晶型b、sph1772游離堿晶型a。(7)常溫?fù)]發(fā)結(jié)晶試驗(yàn)：稱取15毫克化合物sph1772二酒石酸鹽的晶型a于3毫升小瓶中，加入1.5毫升-3.0毫升相應(yīng)溶劑或混合溶劑配制成澄清溶液，或過(guò)濾后得到澄清液，置于在室溫下用封口膜密封，刺2～4個(gè)小孔后放置自然揮發(fā)，揮干后得到固體。表8常溫?fù)]發(fā)結(jié)晶試驗(yàn)的溶劑及獲得晶型注：n/a表示固體量少。常溫?fù)]發(fā)在5種條件下進(jìn)行，獲得晶型為sph1772酒石酸鹽晶型b。(8)高聚物誘導(dǎo)結(jié)晶試驗(yàn)：稱取15毫克化合物，分別配制成表9中所列溶于相應(yīng)的良溶劑的飽和溶液，分裝1.5-3.0毫升每份的飽和溶液至裝有2毫克相應(yīng)混合聚合物的3毫升小瓶中。超聲使其混合充分后，用封口膜蓋住小瓶并在上面扎孔，置于室溫條件下?lián)]發(fā)，收集所得固體進(jìn)行xrpd測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)具體結(jié)果見表9。表9高聚物誘導(dǎo)結(jié)晶試驗(yàn)的溶劑及獲得晶型注：高聚物a：聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，聚乙烯醇(pva)，聚氯乙烯(pvc)，聚醋酸乙烯酯(pvac)，羥丙基甲基纖維素(hpmc)，甲基纖維素(mc)，質(zhì)量比1:1:1:1:1:1。高聚物b：聚己內(nèi)酯(pcl)，聚乙二醇(peg)，聚甲基丙基酸甲酯(pmma)，海藻酸鈉(sa)，羥乙基纖維素(hec)，質(zhì)量比1:1:1:1:1。高聚物誘導(dǎo)在8種條件下進(jìn)行，獲得晶型為sph1772二酒石酸鹽晶型b。本實(shí)施例中，根據(jù)xrpd結(jié)果：試驗(yàn)中共得到四種二酒石酸鹽晶型(a～d)，鑒定結(jié)果表明sph1772二酒石酸鹽的晶型a為無(wú)水晶型，sph1772二酒石酸鹽的晶型b和晶型c為sph1772二酒石酸鹽的歧化晶型，sph1772二酒石酸鹽的晶型d為dmso溶劑合物。由于sph1772二酒石酸鹽的晶型b、晶型c和晶型d可能的弱穩(wěn)定性，sph1772二酒石酸鹽的晶型a為優(yōu)選晶型。同時(shí)還得到sph1772一酒石酸鹽的晶型a和sph1772的晶型b，sph1772一酒石酸鹽的晶型a為無(wú)水晶型，sph1772的晶型b為dmac溶劑合物。具體表征數(shù)據(jù)如下：(1)sph1772一酒石酸鹽的晶型adsc顯示209.2℃處的主要吸熱峰。殘余溶劑：丙酮、乙酸乙酯-未檢測(cè)到。熔點(diǎn)＝202.1℃。1hnmr確認(rèn)sph1772一酒石酸鹽的晶型a。1hnmr(δppm，dmso-d6，400mhz)9.22(s，1h)，9.18(d，j＝0.4hz，1h)，8.64(s，1h)，8.46(d，j＝0.4hz，1h)，8.37(s，1h)，8.31(s，1h)，8.07(s，1h)，7.99(d，j＝0.8hz，1h)，7.84(d，j＝1.2hz，1h)，7.76(dd，j1＝8.4hz，j2＝2.0hz，1h)，6.15(s，2h)，4.28(s，2h)，3.93(s，3h)，3.90(s，3h)。xrpd圖如圖4所示，具體xrpd峰列表如下：2θ°[±0.2°]相對(duì)強(qiáng)度％6.89219.812.92420.213.52521.314.512100.015.63937.316.99014.417.91214.919.09811.021.02418.9(2)sph1772的晶型b熔點(diǎn)為263.2℃。dsc顯示113.9℃、171.7℃和268.8℃處有主要吸熱峰。殘余溶劑：dmac＝51.5％。1hnmr確認(rèn)sph1772的晶型b1hnmr(δppm，dmso-d6，400mhz)9.22(s，1h)，9.17(d，j＝2.4hz，1h)，8.64(s，1h)，8.46(d，j＝1.6hz，1h)，8.37(s，1h)，8.31(s，1h)，8.07(s，1h)，7.99(d，j＝8.8hz，1h)，7.84(d，j＝1.2hz，1h)，7.76(dd，j1＝8.4hz，j2＝2.0hz，1h)，6.15(s，2h)，3.95(s，3h)，3.90(s，3h)，2.94(s，15h)，2.79(s，15h)，1.96(s，15h)。xrpd圖如圖3所示，xrpd峰列表如下：2-θ°[±0.2°]相對(duì)強(qiáng)度％10.51124.313.15619.617.057100.018.63127.028.7813.1效果實(shí)施例1：c-met酪氨酸激酶活性的抑制活性材料與試劑：c-met激酶，購(gòu)自carnabiosciences,inc.貨號(hào)：08-151；二甲基亞砜，購(gòu)自sigma-aldrich，貨號(hào)：d8418；atp，購(gòu)自sigma-aldrich，貨號(hào)：a7699；dtt溶液，購(gòu)自sigma-aldrich，貨號(hào)：43816；edta溶液，購(gòu)自gibco，貨號(hào)：15575；檢測(cè)試劑盒htrfkinease-tkkit及相關(guān)組分，購(gòu)自cisbiobioassays，其中htrfkinease-tkkit貨號(hào)為：62tk0pec；96孔化合物板，購(gòu)自thermoscientific，貨號(hào)：267245；384孔檢測(cè)板，購(gòu)自greinerbio-one，貨號(hào)：784075；其他常規(guī)化學(xué)藥品購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。體外激酶分析采用均相時(shí)間分辨熒光htrf(homogeneoustime-resolvedfluorescence)技術(shù)，在atp濃度為km情況下，分別在c-met激酶上對(duì)受試化合物進(jìn)行篩選。(其中，km代表米氏常數(shù)，單位是mol/l，酶促反應(yīng)速度是最大反應(yīng)速度一半時(shí)atp的濃度。)檢測(cè)過(guò)程中，受試化合物初始濃度均選擇為111.11nm，各化合物均選擇10個(gè)梯度稀釋濃度，梯度稀釋倍數(shù)為3倍，每濃度2個(gè)復(fù)孔進(jìn)行檢測(cè)，采用incb28060(capmatinib)作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。所有樣品采用dmso配制成10-2m的貯備液，小量分裝后保存于-80℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)方法：1、配制1×反應(yīng)緩沖液(購(gòu)買的反應(yīng)緩沖液為高濃度的，使用時(shí)需要稀釋，稀釋成最終實(shí)驗(yàn)時(shí)所需濃度稱為1x反應(yīng)緩沖液。)采用htrfkinease-tkkit中的5×enzymaticbuffer，配制適合每種激酶所需要的1×反應(yīng)緩沖液。2、5×化合物的配制與轉(zhuǎn)移(例如：最終實(shí)驗(yàn)所需化合物濃度為1um，先配制成5um濃度的樣品，稱為5×化合物。)1)化合物稀釋：取10mm的受試化合物儲(chǔ)存液，在96孔化合物板中，用dmso將化合物分多步稀釋，獲得為初始濃度100×的化合物，之后再以此濃度化合物為第一個(gè)濃度，采用dmso進(jìn)行3倍梯度稀釋，共稀釋10個(gè)濃度；之后分別取1ul的梯度稀釋液加入19ul的1×反應(yīng)緩沖液中，配制成5×化合物備用；2)5×化合物的轉(zhuǎn)移：從96孔板中轉(zhuǎn)移2ul的5×化合物進(jìn)入384孔板中；無(wú)化合物對(duì)照孔中加入2ul的如下液體：1ul的dmso加入19ul的1×反應(yīng)緩沖液；min對(duì)照孔中加入2ul的250mm的edta。本效果實(shí)施例中，受試化合物的c-met酪氨酸激酶活性的抑制活性數(shù)據(jù)如表10所示：表10受試化合物對(duì)c-met酪氨酸激酶活性的抑制活性數(shù)據(jù)sph1772的晶型a和sph1772二酒石酸鹽的晶型a的c-met酪氨酸激酶抑制ic50比陽(yáng)性參照化合物incb28060更低，表明體外抑制活性高于incb28060。效果實(shí)施例2人肺癌h1993細(xì)胞的增殖抑制活性材料與試劑：cellcountingkit-8試劑盒，購(gòu)自dojindo，貨號(hào)：ck04；h1993人肺癌細(xì)胞，購(gòu)自atcc，貨號(hào)：crl-5909；rpmi1640，購(gòu)自gibco，貨號(hào)：11875-093；strep/pen，購(gòu)自gibco，貨號(hào)：15240-062；胎牛血清fbs，購(gòu)自gibco，貨號(hào)：10099-141；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，購(gòu)自corning，貨號(hào)：3599；96孔化合物板，購(gòu)自thermoscientific，貨號(hào)：267245；其他常規(guī)化學(xué)藥品購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。本效果實(shí)施例中，我們采用cellcountingkit-8(cck-8)試劑，在人肺癌h1993細(xì)胞株上進(jìn)行了化合物sph1772及其不同鹽型對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制篩選，以評(píng)價(jià)受試化合物對(duì)該細(xì)胞株體外增殖的抑制活性。cck-8是檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和細(xì)胞毒性的試劑盒，為mtt法的替代方法。檢測(cè)過(guò)程中，受試化合物的初始濃度選擇為111.11nm，選擇9個(gè)梯度稀釋濃度，梯度稀釋倍數(shù)為3倍，每濃度2個(gè)復(fù)孔進(jìn)行檢測(cè)，采用incb28060(capmatinib)作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。所有樣品采用dmso配制成10-2m的貯備液，小量分裝后保存于-80℃?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)方法：1、細(xì)胞培養(yǎng)與接種：實(shí)驗(yàn)第一天，取正常培養(yǎng)的細(xì)胞，在其指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)下，消化分散后按照5.5×104cells/ml(表示55000個(gè)細(xì)胞每毫升)的密度，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種90μl；接種完成后將微孔板放置于37攝氏度，5％的co2的條件下培養(yǎng)過(guò)夜；2、加藥處理細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)的第二天，從培養(yǎng)箱中取出微孔板，向微孔板中的每個(gè)孔中各加入10×化合物，每孔加入10μl，其中每個(gè)給藥濃度2個(gè)復(fù)孔，每個(gè)化合物共9個(gè)給藥濃度。根據(jù)不同的細(xì)胞株，各化合物的起始濃度有所不同。3、數(shù)據(jù)的采集：化合物與細(xì)胞共同孵育72小時(shí)后，將含有細(xì)胞的微孔板從培養(yǎng)箱中取出，向每孔中加入10μlcellcountingkit-8反應(yīng)液，將微孔板放入培養(yǎng)箱孵育2-3個(gè)小時(shí)。于flexstation3上測(cè)定在450nm處的吸光度值，設(shè)定650nm為參比波長(zhǎng)。4、按下列公式對(duì)化合物的體外抑制活性進(jìn)行計(jì)算：細(xì)胞增殖抑制率：抑制率(％)＝(信號(hào)值對(duì)照－信號(hào)值給藥)/信號(hào)值對(duì)照×100％。并根據(jù)各濃度的抑制率，采用logit法計(jì)算50％抑制濃度(50％inhibitoryconcentration，ic50)。表11：受試化合物對(duì)h1993細(xì)胞株的體外增殖抑制作用化合物ic50(nm)incb280602.1sph1772二酒石酸鹽的晶型a0.7sph1772的晶型a0.5sph1772的晶型a和sph1772二酒石酸鹽的晶型a對(duì)h1993細(xì)胞的增殖抑制活性優(yōu)于陽(yáng)性參照化合物incb28060，在nm水平以下就對(duì)h1993細(xì)胞株的體外增殖有較強(qiáng)的抑制作用。效果實(shí)施例3大鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)分析藥物、動(dòng)物及試劑：分析用和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用化合物由中央研究院藥化室提供。乙腈為hplc純?cè)噭?merck)，甲酸(hcooh)為cnw公司生產(chǎn)的hplc純?cè)噭?。其它分析純有機(jī)試劑均由中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司提供。分析用純水由去離子水經(jīng)milliq純水儀制備而成。sd大鼠，雄性，180～200g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)儀器：液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)(lc/ms/ms)由watersacquityuplc串聯(lián)api4000q-trap質(zhì)譜檢測(cè)器組成。實(shí)驗(yàn)方法：所有樣品均使用dmso超聲加熱至澄清，并配制成25nm溶液。所有樣品均按照20μmol/kg的劑量給藥。sd大鼠分為3組，每組3只，分別灌胃給予20μmol/kgsph1772二酒石酸鹽的晶型a、sph1772的晶型a和incb28060鹽酸鹽(8ml/kg，2.5mm)，分別于給藥前和給藥后5、15、30、60、90、120、240、360、480、720、1440min于大鼠眼底靜脈叢取血0.4ml。血樣于8000rpm離心5min，取血漿于離心管中-20℃保存?zhèn)溆?。血漿樣品處理：血漿樣品50μl，加入200μl含內(nèi)標(biāo)的乙腈(普萘洛爾(pro)，2.5ng/ml)沉淀蛋白。渦旋10min，6000g離心10min，取上清用流動(dòng)相5倍稀釋后，于96孔板中進(jìn)樣。樣品測(cè)定方法：1、儀器液相色譜系統(tǒng)：acquityuplc液相色譜系統(tǒng)(包括二元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、脫氣機(jī))，美國(guó)waters公司。ms/ms系統(tǒng)：api4000q-trap型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源(esi)，美國(guó)appliedbiosystems公司數(shù)據(jù)采集：analyst1.5.1軟件，美國(guó)appliedbiosystems公司2、lc條件分析柱：behc18column，1.7μm粒徑，50x2.1mmi.d.，美國(guó)waters公司流速：0.3ml/min；進(jìn)樣量：2μl；柱溫45℃。采用的梯度洗脫程序?yàn)椋?、ms條件離子源為電噴霧電離源(turboionspray，esi)；源噴射電壓為5500v；溫度為500℃；離子源氣體1(n2)壓力為50psi；離子源氣體2(n2)壓力為50psi；氣簾氣體(n2)壓力為20psi；碰撞氣壓力(cad)為medium；掃描時(shí)間為100ms；正離子方式檢測(cè)；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(mrm)，用于定量分析的離子反應(yīng)及碰撞能量(ce)、去簇電壓(dp)如下表所示：sph1772在大鼠血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.01～22.5μm，定量下限0.01μm。incb28060鹽酸鹽在大鼠血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.002～5μm，定量下限0.002μm。sph1772二酒石酸鹽的晶型a、sph1772的晶型a和incb28060鹽酸鹽的體藥代參數(shù)參見表12～表14。受試化合物的藥-時(shí)濃度曲線如圖5所示，受試化合物在大鼠體內(nèi)藥-時(shí)濃度(auc(0-t))分布柱狀圖如圖6所示；受試化合物在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰濃度(cmax)的分布柱狀圖7所示。表12sph1772二酒石酸鹽的晶型a在大鼠體內(nèi)血漿藥物濃度表13sph1772的晶型a在大鼠體內(nèi)血漿藥物濃度表14incb28060鹽酸鹽的晶型a在大鼠體內(nèi)血漿藥物濃度表15受試化合物在大鼠體內(nèi)主要pk數(shù)據(jù)：如表所示，劑量為20μmol/kg時(shí)，sph1772的晶型a的auc(0-24h)為4057.55μm*min，sph1772二酒石酸鹽的晶型a的auc(0-24h)為8802.13μm*min。與sph1772的晶型a相比，sph1772二酒石酸鹽的晶型a相應(yīng)的auc值增加了2.17倍，達(dá)峰濃度增加了1.80倍。相同摩爾劑量下，sph1772二酒石酸鹽晶型a表現(xiàn)出了比sph1772的晶型a更加優(yōu)異的藥動(dòng)性質(zhì)，總體來(lái)說(shuō)incb28060鹽酸鹽在大鼠體內(nèi)的暴露量不如sph1772的晶型a及sph1772二酒石酸鹽的晶型a。效果實(shí)施例4sph1772二酒石酸鹽的晶型a在人源肝癌mhcc97h細(xì)胞株異種移植balb/c裸小鼠動(dòng)物模型中的抗腫瘤作用評(píng)價(jià)4.1實(shí)驗(yàn)方法balb/c裸小鼠皮下接種mhcc97h細(xì)胞，建立人肝癌皮下移植腫瘤模型。試驗(yàn)分為sph1772二酒石酸鹽的晶型a(0.05mg/kg、0.5mg/kg和5mg/kg)、陽(yáng)性對(duì)照inc280鹽酸鹽(5mg/kg)及vehicle組(溶媒對(duì)照組)，每組10只，灌胃給藥，每天給藥一次，共給藥21天。根據(jù)相對(duì)腫瘤抑制率(tgi)及腫瘤延遲時(shí)間進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，根據(jù)動(dòng)物體重變化和死亡情況進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物balb/cnude小鼠，雌性，7-9周(腫瘤細(xì)胞接種時(shí)的小鼠周齡)，體重19.5-23.9g，75只。購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào)：2013001816956。飼養(yǎng)環(huán)境：spf級(jí)。4.3細(xì)胞和相關(guān)試劑mhcc97h(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院)細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液中。收集指數(shù)生長(zhǎng)期的mhcc97h細(xì)胞，pbs重懸至適合濃度用于小鼠皮下腫瘤接種。4.4動(dòng)物造模和分組75只雌性小鼠右側(cè)皮下接種0.2毫升重懸于pbs和基質(zhì)膠(1:1)中的1×107mhcc97h細(xì)胞。待腫瘤平均體積157mm3時(shí)，根據(jù)腫瘤大小隨機(jī)分組。腫瘤體積計(jì)算公式為：長(zhǎng)徑×短徑2/2。4.5結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)腫瘤抑制率tgi(％)：tgi＝1-t/c(％)。t/c％為相對(duì)腫瘤增值率，即在某一時(shí)間點(diǎn)，治療組和對(duì)照組相對(duì)腫瘤體積或瘤重的百分比值。t和c分別為治療組和對(duì)照組在某一特定時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)腫瘤體積(rtv)或瘤重(tw)。計(jì)算公式如下：t/c％＝trtv/crtv*100％(trtv：治療組平均rtv；crtv：溶媒對(duì)照組平均rtv；rtv＝vt/v0，v0為分組時(shí)該動(dòng)物的瘤體積，vt為治療后該動(dòng)物的瘤體積)?；騮/c％＝ttw/ctw×100％(ttw：治療組實(shí)驗(yàn)終結(jié)時(shí)平均瘤重；ctw：溶媒對(duì)照組實(shí)驗(yàn)終結(jié)時(shí)平均瘤重)。4.6實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)末次給藥后1.5h和24h，取血取瘤，稱瘤重，拍照。4.7統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均瘤體積±sem(平均標(biāo)準(zhǔn)誤差)表示。不同組間的統(tǒng)計(jì)分析選擇最佳藥物治療點(diǎn)(通常是在最后一次給藥后)。用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法比較治療組相對(duì)腫瘤體積和瘤重與對(duì)照組相比有無(wú)顯著性差異。所有的數(shù)據(jù)均用spss18.0進(jìn)行分析。p<0.05為具有顯著性差異。4.8實(shí)驗(yàn)結(jié)果溶媒對(duì)照組小鼠在給藥后第25天平均腫瘤體積為1815mm3。sph1772二酒石酸鹽的晶型a(0.05mg/kg)治療組在給藥后第25天平均腫瘤體積為469mm3，相對(duì)腫瘤抑制率tgi(％)為74％。sph1772二酒石酸鹽的晶型a(0.5mg/kg)治療組在給藥后第25天平均腫瘤體積為60mm3，相對(duì)腫瘤抑制率tgi(％)為97％。sph1772二酒石酸鹽的晶型a(5mg/kg)治療組在給藥后第25天平均腫瘤體積為22mm3，相對(duì)腫瘤抑制率tgi(％)為99％。inc280(5mg/kg)治療組在給藥后第25天平均腫瘤體積為166mm3，相對(duì)腫瘤抑制率tgi(％)為91％。瘤重分析結(jié)果與相對(duì)瘤體積分析結(jié)果基本吻合。各治療組和對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)情況見表16、表17和圖8。表17各組瘤重表sph1772二酒石酸鹽的晶型a在上述mhcc97h人源肝癌模型研究中，各治療組均無(wú)動(dòng)物死亡，沒(méi)有表現(xiàn)明顯的藥物毒性，治療期間耐受良好。效果實(shí)施例5：sph1772二酒石酸鹽的晶型a在人源肺腫瘤小鼠模型lu2503中的抗腫瘤作用評(píng)價(jià)5.1模型信息來(lái)源于女性患者的肺腫瘤異種移植模型lu2503被用于該藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。該模型的met基因14號(hào)外顯子存在基因缺失。同時(shí)，該模型具有輕微惡病質(zhì)，且具有腫瘤破潰傾向。5.2實(shí)驗(yàn)方法從肺腫瘤異種移植模型lu2503(r11p6)荷瘤小鼠收取腫瘤組織，切成直徑為2-3mm的瘤塊接種于balb/c裸鼠右前肩胛處皮下。當(dāng)平均腫瘤體積達(dá)到約139mm3時(shí)，根據(jù)腫瘤體積將小鼠隨機(jī)分入6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組8只，每籠4只。分組當(dāng)天定義為第0天。給藥開始于第0天，結(jié)束于第20天。該實(shí)驗(yàn)于第21日結(jié)束。試驗(yàn)分為sph1772二酒石酸鹽的晶型a(0.3mg/kg、3mg/kg和30mg/kg)、陽(yáng)性對(duì)照inc280(30mg/kg)、陽(yáng)性對(duì)照crizotinib(30mg/kg)及溶劑組，每組8只，灌胃給藥，每天給藥一次，共給藥21天。5.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物balb/c小鼠，雌性，8-9周(腫瘤細(xì)胞接種時(shí)的小鼠周齡)，52只。購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院，許可證號(hào)：scxk(蘇)2015-0001；質(zhì)量合格證號(hào)：201602064。飼養(yǎng)環(huán)境：spf級(jí)。5.4動(dòng)物分組待腫瘤平均體積139mm3時(shí)，根據(jù)腫瘤大小隨機(jī)分組。腫瘤體積計(jì)算公式為：長(zhǎng)徑×短徑2/2。5.5結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)同4.5。5.6實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)同4.6。5.7統(tǒng)計(jì)分析同4.7。5.8實(shí)驗(yàn)結(jié)果在分組治療后第21天，第1組(inc280,30mg/kg,qd*21)、第2組(溶劑,qd*21)、第3組(sph1772二酒石酸鹽的晶型a,0.3mg/kg,qd*21)、第4組(sph1772二酒石酸鹽的晶型a,3mg/kg,qd*21)、第5組(sph1772二酒石酸鹽的晶型a,30mg/kg,qd*21)和第6組(crizotinib,30mg/kg,qd*21)荷瘤鼠體重改變百分比分別為-5.00％、-9.86％、-1.61％、-1.88％、-2.01％和3.26％。在分組治療后第21天，溶劑組的平均腫瘤體積達(dá)到1886.32mm3。其他組的腫瘤完全消退，相對(duì)腫瘤增值率(t/c％)均為0.00％，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的抗lu2503腫瘤生長(zhǎng)的作用(p<0.05)。各治療組和溶劑處理組荷瘤鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積見表18、表19和圖9。表18各治療組和溶劑處理組荷瘤鼠的腫瘤體積注釋：數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示表19在肺腫瘤異種移植模型lu2503中的抑瘤效果本研究中，sph1772二酒石酸鹽的晶型a作為單藥治療，在0.3mg/kg、3mg/kg和30mg/kg劑量時(shí)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的抗肺腫瘤異種移植模型lu2503生長(zhǎng)的作用，且相同給藥劑量下，sph1772二酒石酸鹽的晶型a抗肺腫瘤異種移植模型lu2503生長(zhǎng)的作用，要優(yōu)于inc280和crizotinib。當(dāng)前第1頁(yè)12