本發(fā)明屬于金針菇菌種保護(hù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型進(jìn)行金針菇菌種保護(hù)的方法。

背景技術(shù)：

金針菇(flammulinavelutipes)是我國廣泛栽培的食用菌之一，具有重要的食藥用的價值。金針菇的栽培和生產(chǎn)的發(fā)展在很大程度上必須依賴菌種。而菌種的選育只有依靠長期的積累才能有所收獲，其中投入了大量的人力物力和時間成本。但是由于金針菇可以進(jìn)行無性繁殖，其菌種生產(chǎn)工藝具有可復(fù)制性，使得容易被仿冒。

營養(yǎng)缺陷型菌株由于基因發(fā)生突變喪失了合成某種物質(zhì)的能力，在基本培養(yǎng)基中無法正常生長，必須補(bǔ)充某些物質(zhì)才可以正常生長。如果無法明確知道究竟是何種營養(yǎng)缺陷其生產(chǎn)會受到極大限制，可以使得育種者的知識產(chǎn)權(quán)得到充分的保護(hù)。

金針菇作為深受消費者喜愛的食用菌采用營養(yǎng)缺陷標(biāo)記具有更高的安全性。常見的營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選標(biāo)記有腺嘌呤、蛋氨酸、尿嘧啶、色氨酸、核菌素、精氨酸、亮氨酸、脯氨酸、肌醇等。在金針菇的遺傳研究中，尿嘧啶合成的兩種關(guān)鍵酶基因pyrf與pyrg已經(jīng)被成功克隆，這為金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型進(jìn)行金針菇菌種保護(hù)的方法，該方法簡單，成本低，使用常規(guī)的菌種分離方法得到的菌種無法正常的生長繁殖，可以有效對金針菇菌種進(jìn)行保護(hù)。

本發(fā)明的一種利用尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型進(jìn)行金針菇菌種保護(hù)的方法，包括：

將金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單核體ng1-92與金針菇單核體野生型菌株雜交，出菇后單孢分離獲得單核體菌株；將單核體菌株接種于5-氟乳清酸篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定，得到尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單核體菌株，然后通過單單雜交得到尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株。

所述金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單核體ng1-92的保藏編號為：cgmccno.12878。擴(kuò)增后的pyrg基因序列如seqidno.1所示。保藏日為2016年9月19日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，建議分類命名為：金針菇(flammulinavelutipes)。

所述出菇為在木屑培養(yǎng)基上出菇。

所述5-氟乳清酸篩選培養(yǎng)基的組成為：在基本培養(yǎng)基中添加0.05mmol/l的尿嘧啶及0.5g/l的5-氟乳清酸。

所述基本培養(yǎng)基的組成為：kh2po31.0g、(nh4)2hpo31.5g、mgso4·7h2o0.3g、thiaminehcl500μg、瓊脂粉15g，加水至1l，滅菌后倒平板備用。

所述尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株在不含尿嘧啶添加物的基本培養(yǎng)基中無法正常生長，在pda培養(yǎng)基上生長速度低于野生型菌株，在添加尿嘧啶的pdau培養(yǎng)基上生長速度提高。

有益效果

本發(fā)明方法簡單，成本低，得到的金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株在不含尿嘧啶添加物的基本培養(yǎng)基中無法正常生長，生長速度為零；金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株在馬鈴薯培養(yǎng)基上平均生長速度(0.2186cm/d)低于正常野生型菌株的生長速度(1.4089cm/d)，在添加尿嘧啶的馬鈴薯培養(yǎng)基上生長速度有很大程度的提高(421.91％)，平均生長速度為1.1409cm/d，使用常規(guī)的菌種分離方法得到的菌種無法正常的生長繁殖，可以有效對金針菇菌種進(jìn)行保護(hù)。

附圖說明

圖1為金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單孢2-6與dg1-1在不同培養(yǎng)基上的生長情況；

圖2為金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型純合體菌絲鏡檢圖片；

圖3為金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株vg1-2與g1在不同培養(yǎng)基上的生長情況；

圖4為金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株pyrg基因酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測：其中，m：dl2000marker；1：g1；2：dg1-1；3：ng1-92；4：vg1-2；5：g1酶切；6：dg1-1酶切；7：ng1-92酶切；8：vg1-2酶切。

圖5為金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株和正常菌株在pda培養(yǎng)基上的生長速度；

圖6為金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株和正常菌株在pda和pdau培養(yǎng)基上的生長速度。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

1.材料：試驗所使用的金針菇單核體菌株dg1-1、dg1-29、雙核體菌株g1均由中國農(nóng)業(yè)微生物保藏中心食用菌分中心保藏。

2.pcr引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

3.培養(yǎng)基：

木屑培養(yǎng)基：80％木屑與20％的麩皮混合，含水量為63％，裝袋滅菌后，供出菇使用。

馬鈴薯培養(yǎng)基(pda)：pda粉末39g，加水至1l，滅菌，倒平板，供菌絲活化與菌絲培養(yǎng)使用。

添加尿嘧啶馬鈴薯培養(yǎng)基(pdau)：在馬鈴薯培養(yǎng)基中添加0.05mmol/l的尿嘧啶。

基本培養(yǎng)基(mm)：kh2po31.0g、(nh4)2hpo31.5g、mgso4·7h2o0.3g、thiaminehcl500μg、瓊脂粉15g，加水至1l，滅菌后倒平板備用。

添加尿嘧啶基本培養(yǎng)基(mmu)：在基本培養(yǎng)基中添加0.05mmol/l的尿嘧啶。

篩選培養(yǎng)基(mmuf)：在基本培養(yǎng)基中添加0.05mmol/l的尿嘧啶及0.5g/l的5-氟乳清酸。

說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

實施例1

金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單孢子的獲得

將金針菇營養(yǎng)缺陷型菌株ng1-92與金針菇單核體菌株dg1-29進(jìn)行雜交后得到雙核體菌株sgn2進(jìn)行出菇。出菇后選擇菇形完整、個大、肉厚、無病蟲害的子實體單株兩株，在超凈臺中無菌平板內(nèi)收集自然彈射的孢子。將收集到的孢子放入裝有無菌水的ep管中浸泡，再用無菌水分梯度稀釋，直到鏡檢時每個視野內(nèi)有2-3個單孢子。將孢子液涂布到pda培養(yǎng)基上，置于25℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。一般1周內(nèi)可見到萌發(fā)的孢子。將萌發(fā)的孢子轉(zhuǎn)接到pda培養(yǎng)基上，經(jīng)過10天的培養(yǎng)，放在顯微鏡上檢查，無鎖狀聯(lián)合的菌絲為單孢子萌發(fā)的菌絲，挑出備用，淘汰有鎖狀聯(lián)合的菌絲。將無鎖狀聯(lián)合的單孢子接種于不同培養(yǎng)基mm、mmu、mmuf。挑選出能在mmu和mmuf上生長但在mm上不生長的單孢子，即為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單孢子。如圖1所示，單孢子2-6在mmu和mmuf上生長但在mm上不生長為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單孢子。

實施例2

金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株的制備

將尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單孢菌株萌發(fā)得到的單核菌絲在mmu培養(yǎng)基上進(jìn)行雜交。培養(yǎng)兩周左右，見雙親菌絲已經(jīng)融合，挑出融合處菌絲進(jìn)行鏡檢，有鎖狀聯(lián)合的為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核菌絲(vg1-2(cgmccno.12877，保藏日為2016年9月19日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，建議分類命名為：金針菇(flammulinavelutipes))為2-6與2-33雜交得到，2-6、2-33為dg1-29與ng1-92雜交得到的子實體收集單孢得到)。

實施例3

尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株5’-氟乳清酸驗證

將得到的金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株接種于不同培養(yǎng)基mm、mmu、mmuf，這些純合體可以在mmu培養(yǎng)基和mmuf培養(yǎng)基上生長而不可以在mm培養(yǎng)基上生長。如圖3所示，尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株vg1-2可以在mmu和mmuf上生長但在mm上不生長。

實施例4

尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株基因組dna的提取與pcr克隆相關(guān)基因

提取尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型純合體菌株基因組dna(ctab法)。設(shè)計pyrg基因的引物。

pcr擴(kuò)增體系為50μl，包含：takaraextaq(5u/μl)0.5μl，10×extaqbuffer(mg²⁺plus)5μl，dntpmixture(2.5mmol/l)4μl，模板dna(100ng/μl)1μl，引物各1μl，雙蒸水(ddh2o)37.5μl。pcr反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃75s；30～35個循環(huán)；72℃10min；4℃保藏。

表1擴(kuò)增pyrg基因的pcr引物

出發(fā)菌株金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷單核體ng1-92的pyrg基因在236位有堿基替換t→c，突變相應(yīng)引起xhoι酶切位點(c/tcgag)的缺失，提取尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型純合體菌株基因組dna后對pyrg基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳并割膠回收，對回收產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型純合體菌株的條帶與出發(fā)菌株一致，與其它菌株不同，如圖4所示。

實施例5

金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株的生長速度測定

將金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株1株和野生型1株接種于pda培養(yǎng)基和pdau培養(yǎng)基，3天后測量生長情況。

結(jié)果如圖5所示，金針菇尿嘧啶缺陷型在pda培養(yǎng)基上的生長速度(0.2186cm/d)普遍低于野生型的生長速度(1.4089cm/d)。

金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株在添加了尿嘧啶的pdau培養(yǎng)基上生長速度(1.1409cm/d)與在pda培養(yǎng)基上的生長速度(0.2186cm/d)相比都有很大的提高。而野生型在添加了尿嘧啶pda的培養(yǎng)基上生長速度沒有太大變化，甚至還有所降低(見圖6)。

sequencelisting

<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>一種利用尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型進(jìn)行金針菇菌種保護(hù)的方法

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1828

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<211>21

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<213>人工序列

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