本發(fā)明涉及一種活性肽，特別涉及一種利用金槍魚下腳料制備的具有肝損傷修復(fù)作用的活性肽。

背景技術(shù)：

海洋面積約占地球表面的71％，生活在海洋中的生物高達(dá)20萬種，海洋生物獨特的生活環(huán)境和生存方式注定了海洋產(chǎn)物所具備的復(fù)雜性、多樣性和特殊性，所以從海洋生物中提取和分離有效的生物活性物質(zhì)具有重要的意義，從海洋植物、海洋動物和海洋微生物中提取有效的活性物質(zhì)越來越受到專家和學(xué)者們的關(guān)注。目前，人們研究最多的有海洋生物毒素、抗腫瘤因子、抗氧化因子、心血管活性肽等。人類的生活深受海洋毒素的影響，其中有毒的生物至今仍威脅著人們海上生活和生產(chǎn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的海洋生物毒素有河豚毒素、刺尾魚毒素、海蜇毒素、石房蛤毒素等。海洋生物毒素可直接開發(fā)為天然藥物或者進(jìn)一步作為先導(dǎo)化合物用于創(chuàng)新藥物的設(shè)計。隨著我國金槍魚漁業(yè)的迅速發(fā)展，金槍魚加工已成為遠(yuǎn)洋漁業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重中之重。金槍魚產(chǎn)品主要為罐頭加工，所產(chǎn)生下腳料占總重量50％-70％。主要以內(nèi)臟、碎肉、魚頭為主，下腳料中不僅含有優(yōu)質(zhì)蛋白，而且富含大量的生物活性物質(zhì)。但是現(xiàn)有金槍魚下腳料只是簡單利用，較浪費。

非酒精性脂肪肝病是一種與酒精無關(guān)的病理綜合征，主要特征是肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積和脂肪變性，NAFLD可發(fā)展到非酒精性脂肪性肝炎，最終有可能惡化為肝硬化甚至肝癌。NAFLD在發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高，發(fā)病率高達(dá)20％-30％，中國發(fā)達(dá)地區(qū)成人的NAFLD患病率在15％左右，嚴(yán)重威脅了人們的生活，但在我國的落后地區(qū)發(fā)病率較低。近年來隨著國人生活水平的提高、人口老齡化和肥胖癥的流行、人們攝入的脂肪和油脂逐漸增多，NAFLD患者近幾年在我國出現(xiàn)逐步增多的趨勢，成為影響人們身體健康最常見的肝臟疾病。

關(guān)于NAFLD的發(fā)病機(jī)制，最為人們接受的是由Day提出的“二次打擊”學(xué)說，脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)的聚集構(gòu)成了第一次打擊，第二次打擊是指在此基礎(chǔ)上發(fā)生的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。NAFLD的發(fā)生過程包括胰島素和瘦素抵抗、肝臟內(nèi)脂肪的過度堆積、肝臟組織和細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)等。胰島素的主要功能是通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的濃度來促進(jìn)葡萄糖的吸收，以此降低血糖的濃度。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行新陳代謝時，機(jī)體攝入的葡萄糖會轉(zhuǎn)化為肝糖原儲存在肝臟內(nèi)，胰島素的另一個作用可以儲存脂類并抑制脂質(zhì)分解，細(xì)胞內(nèi)胰島素抵抗會使儲存的甘油三酸脂水解使血漿內(nèi)自由脂肪酸的含量上升，從而導(dǎo)致了肝臟細(xì)胞中脂肪的蓄積。

NAFLD的危害主要包括以下幾個方面：可促進(jìn)動脈粥樣硬化，所以患者常伴有高血脂癥，其血液粘稠度會有所上升，低密度脂蛋白由于分子量小，所以容易造成血管壁沉積的動脈，導(dǎo)致動脈彈性降低，降低其靈活性，并最終導(dǎo)致血液循環(huán)障礙，危及生命；NAFLD還會誘發(fā)高血壓和冠心病，極易導(dǎo)致心肌梗塞而導(dǎo)致死亡；NAFLD還會損傷機(jī)體消化，人體所攝入的蛋白質(zhì)、糖類和脂質(zhì)都必須經(jīng)過肝臟的代謝，但NAFLD患者肝臟受損，勢必會累及消化系統(tǒng)。NAFLD可以加重肝臟損害。肝臟中脂肪的堆積。使得肝細(xì)胞腫大、變性，將細(xì)胞核擠壓致一側(cè)，還能進(jìn)一步加重線粒體的負(fù)擔(dān)，從而影響其他營養(yǎng)素、維生素、激素的代謝。長期的肝細(xì)胞變性會加速肝細(xì)胞的損害，使其進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化甚至肝癌，且NAFLD可誘發(fā)或加重糖尿病。

目前對于NAFLD無有效的治療方法，多采用藥物治療和手術(shù)治療等非基礎(chǔ)治療方法，非基礎(chǔ)治療主要包括改善胰島素抵抗的治療、NAFLD相關(guān)基礎(chǔ)疾病和代謝癥候群的治療、抗氧化及抗炎和護(hù)肝治療、減肥手術(shù)治療等。研究證明，雙胍類和噻唑烷類藥物能夠顯著改善集體的胰島素抵抗作用，但其中存在的副作用也不容小覷。NAFLD相關(guān)的基礎(chǔ)疾病和代謝癥候的治療主要包括減肥治療、降脂治療和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑治療。包括節(jié)食和有氧運動在內(nèi)的減肥運動可以在一定程度上減少身體內(nèi)的脂肪含量，從而緩解身體壓力，達(dá)到緩解的效果。降脂治療與減肥治療原理相同，但是降脂藥物的效果和安全性也有待研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用金槍魚下腳料制備的具有肝損傷修復(fù)作用的活性肽，以水產(chǎn)加工副產(chǎn)物金槍魚下腳料為原料，從中提取具有肝細(xì)胞修復(fù)作用的膠原蛋白肽，簡單易行，生產(chǎn)成本低，可以顯著提高水產(chǎn)加工副產(chǎn)品的價值，避免浪費的同時還保護(hù)了環(huán)境，還能為開發(fā)相關(guān)功能性食品提供前期基礎(chǔ)。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種利用金槍魚下腳料制備的具有肝損傷修復(fù)作用的活性肽，其氨基酸序列為：Met-Thr-His-Asp-Asp-Val-Asp-Glu(SEQ ID No.1)。

作為優(yōu)選，通過以下步驟制備而得：

(1)金槍魚下腳料預(yù)處理：將新鮮金槍魚下腳料的魚肉部分清洗干凈，然后勻漿得肉漿；

(2)酶解反應(yīng)：將步驟(1)的肉漿與水按照1g:3mL的料液比混合，然后加入堿性蛋白酶酶解反應(yīng)；

(3)超濾：步驟(2)酶解反應(yīng)結(jié)束后，滅酶，離心，收集上清液，上清液用超濾膜超濾，分別截取三種分子量的分子段產(chǎn)物，并進(jìn)行冷凍干燥，將三種分子量的分子段產(chǎn)物分別以10mg/mL的藥物濃度作用于模型組細(xì)胞，篩選出能夠使細(xì)胞內(nèi)TG含量降低最多的組分；

(4)Sephadex G-25層析分離：取步驟(3)中得到的能夠使細(xì)胞內(nèi)TG含量降低最多的組分100mg加蒸餾水配制成2mL溶液，離心取上清后過0.22μm濾膜，將濾液過Sephadex G-25柱進(jìn)行層析分離，以蒸餾水作為洗脫液，將凝膠柱進(jìn)行平衡洗脫；調(diào)節(jié)恒流泵流速為1.1mL/min，每管收集3.5min，在280nm下檢測其吸光度，收集各峰的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥；各峰產(chǎn)物分別配制成10mg/mL的藥物濃度作用于模型組細(xì)胞，篩選出使細(xì)胞內(nèi)TG含量降低率最多的峰產(chǎn)物即為目標(biāo)肽。

作為優(yōu)選，步驟(2)中的酶解條件為：堿性蛋白酶用量為每g肉漿加入1000U，酶解溫度50℃，pH 10，時間6h。

作為優(yōu)選，步驟(3)中三種分子量具體如下：分子量＜5kDa，分子量5kDa-8kDa，分子量＞8kDa。

本發(fā)明的有益效果是：以水產(chǎn)加工副產(chǎn)物金槍魚下腳料為原料，從中提取具有肝細(xì)胞修復(fù)作用的膠原蛋白肽，簡單易行，生產(chǎn)成本低，可以顯著提高水產(chǎn)加工副產(chǎn)品的價值，避免浪費的同時還保護(hù)了環(huán)境，還能為開發(fā)相關(guān)功能性食品提供前期基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明＜5kDa酶解液進(jìn)行G-25葡聚糖凝膠層析結(jié)果圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

金槍魚下腳料購自浙江舟山佳和加食品加工有限公司；正常人肝細(xì)胞：張氏肝細(xì)胞(Chang Liver細(xì)胞)購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，本實驗室傳代培養(yǎng)。

模型組細(xì)胞：選擇生長狀態(tài)良好的Chang Liver細(xì)胞，用15μg/mL的軟脂酸對Chang liver細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，分別在誘導(dǎo)12h、24h、48h、72h后收集細(xì)胞并測定TG含量，TG檢測方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。選擇使Chang liver細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增加且細(xì)胞生長良好的誘導(dǎo)時間，建立體外NAFLD細(xì)胞模型。

實施例：

1、方法

1.1、金槍魚下腳料預(yù)處理

取新鮮的金槍魚下腳料魚肉部分放入蒸餾水中輕輕攪拌，洗去雜質(zhì)后勻漿，存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2、金槍魚下腳料酶解最佳酶種的篩選

采用堿性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，分別取其最適溫度和最適pH，酶解時間為6h，加酶量均為1000U/g，對金槍魚下腳料勻漿液進(jìn)行酶解，酶解條件如表1所示。酶解結(jié)束后100℃滅酶活性10min，冷凍干燥備用，將干燥后的產(chǎn)物以10mg/mL的濃度作用于模型組細(xì)胞，作用時間為24h，篩選出使模型組細(xì)胞TG含量降低率最多的蛋白酶。TG含量降低率的計算方法是：TG含量降低率(％)＝(模型組TG含量-藥物組TG含量)/模型組TG含量×100％。

表1 不同蛋白酶的酶解條件

1.3、金槍魚下腳料酶解寡肽的分離純化

對最佳酶解條件下所得到的酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾，分別截?。?kDa、5kDa-8kDa、＞8kDa的分子段產(chǎn)物，并進(jìn)行冷凍干燥，放置于-20℃?zhèn)溆谩⒁陨辖M分產(chǎn)物以10mg/mL的藥物濃度作用于模型組細(xì)胞，篩選出能夠使細(xì)胞內(nèi)TG含量降低最多的組分。

1.4、Sephadex G-25層析分離

取1.3中得到的篩選出能夠使細(xì)胞內(nèi)TG含量降低最多的組分(冷凍干燥產(chǎn)物)100mg配制成2mL溶液，離心取上清后過0.22μm濾膜，將濾液過Sephadex G-25柱進(jìn)行層析分離，以蒸餾水作為洗脫液，將凝膠柱進(jìn)行平衡洗脫；調(diào)節(jié)恒流泵流速為1.1mL/min，每管收集3.5min，在280nm下檢測其吸光度，收集各峰的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥。配制成10mg/mL的藥物濃度作用于模型組細(xì)胞，篩選出使細(xì)胞內(nèi)TG含量降低率最多的峰組分。

1.5、肝細(xì)胞功能指標(biāo)的測定

分別測定正常組、模型組和10mg/mL、20mg/mL藥物組Chang liver細(xì)胞內(nèi)ALT、AST、MDA、GSH-ST、γ-GT、SOD等指標(biāo)的含量，檢測方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2結(jié)果分析

2.1金槍魚下腳料最佳酶解條件的篩選結(jié)果

應(yīng)用5種蛋白酶對金槍魚下腳料勻漿液進(jìn)行酶解收集產(chǎn)物，通過處理模型組細(xì)胞，24h后測細(xì)胞內(nèi)的TG含量，結(jié)果如表2所示。從表2中可以得出堿性蛋白酶酶解物使細(xì)胞內(nèi)的TG含量降低率最大(P＜0.05)，因此選擇堿性蛋白酶為最佳酶種。

表2 不同蛋白酶酶解產(chǎn)物對NAFLD細(xì)胞模型內(nèi)TG含量變化(n＝6)

注：^#與模型組相比，P＜0.05。

2.2金槍魚下腳料寡肽初步分離結(jié)果

將堿性蛋白酶在最佳酶解條件下得到的金槍魚下腳料酶解液進(jìn)行超濾后得到＜5kDa、5kDa-8kDa、＞8kDa的3個不同分子段產(chǎn)物，作用于模型組細(xì)胞24h，TG含量檢測結(jié)果如表3所示。從表3中可看出，＜5kDa分子段使模型組細(xì)胞TG含量降低率最大，從模型組的36.12μmol/g減少到14.29μmol/g(P＜0.05)，因此選擇＜5kDa分子段的酶解液進(jìn)行G-25葡聚糖凝膠層析分析。

表3 不同分子段蛋白酶酶解產(chǎn)物對NAFLD模型細(xì)胞內(nèi)TG含量變化(n＝6)

注：*與模型組相比，P＜0.05。

2.3、Sephadex G-25層析分離結(jié)果

＜5kDa酶解液進(jìn)行G-25葡聚糖凝膠層析，收集各管的洗脫液于280nm波長下測定其吸光度，結(jié)果如圖1所示得到4個峰，即峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ和峰Ⅳ。分別將四個峰的產(chǎn)物冷凍干燥，干燥后的產(chǎn)物以10mg/mL的濃度作用于模型組細(xì)胞，結(jié)果如表4所示，峰Ⅰ產(chǎn)物使得模型組TG含量下降最多，降低率高達(dá)64.89％。

表4 不同峰產(chǎn)物對NAFLD模型細(xì)胞內(nèi)TG含量變化(n＝6)

注：*與模型組相比，P＜0.05。

2.4、金槍魚下腳料寡肽序列的測定結(jié)果

峰Ⅰ產(chǎn)物經(jīng)檢測該目標(biāo)肽的氨基酸序列為：Met-Thr-His-Asp-Asp-Val-Asp-Glu，ESI/MS檢測分子量960.10Da。

2.5肝細(xì)胞功能指標(biāo)測定結(jié)果

肝細(xì)胞功能指標(biāo)檢測結(jié)果見表5，可以看出MDA、GSH-ST、ALT、AST、γ-GT的含量模型組明顯高于正常組，經(jīng)本發(fā)明的活性肽作用后的藥物組水平明顯下降(P<0.05)。SOD的含量在正常組細(xì)胞中含量較高，在模型組降低，藥物組水平有所上升(P<0.05)。

表5 肝細(xì)胞功能指標(biāo)測定結(jié)果(n＝6)

注：*與正常組比較，P<0.05；^#與模型組比較，P<0.05。

以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋大學(xué)

<120> 利用金槍魚下腳料制備的具有肝損傷修復(fù)作用的活性肽

<130> 2016.12

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 金槍魚

<400> 1

Met Thr His Asp Asp Val Asp Glu

1 5