本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及一種高胞內(nèi)靈芝三萜含量的靈芝菌絲體發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
：靈芝三萜是在靈芝中發(fā)現(xiàn)的一類三萜類化合物，也就是說(shuō)靈芝三萜是靈芝的主要化學(xué)和藥效成分。靈芝中所含靈芝三萜具有特別顯著的生理活性。在高度競(jìng)爭(zhēng)的社會(huì)中，過度緊張的工作，生活方式的改變或因環(huán)境污染，導(dǎo)致對(duì)人體健康的嚴(yán)重?fù)p害，靈芝三萜有巨大的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)靈芝生理生化過程的研究表明，三萜類化合物(靈芝酸)屬于靈芝的二級(jí)代謝物。在靈芝生理生態(tài)和生活史研究中發(fā)現(xiàn)，菌絲體由一次菌絲、二次菌絲到三次菌絲后，才能紐結(jié)產(chǎn)生子實(shí)體。菌絲體期間只能累積足夠的三萜類化合物(靈芝酸)的前結(jié)構(gòu)物質(zhì)，而后才能出菇(即由無(wú)性繁殖轉(zhuǎn)為有性繁殖)，而產(chǎn)生子實(shí)體。在子實(shí)體的成熟過程中，三萜類物質(zhì)才得以生物化合完善，成為具有生理活性的三萜類成分?？梢哉f(shuō)：靈芝三萜類是靈芝菌絲體一、二級(jí)代謝產(chǎn)物。所以，凡是靈芝菌絲體發(fā)酵制成的產(chǎn)品，由于沒有經(jīng)過子實(shí)體后期——成熟過程，三萜類化合物含量幾乎沒有或非常非常微小。然而子實(shí)體人工大量繁殖難度較大，因此工業(yè)上量產(chǎn)靈芝三萜的主要問題是如何提高靈芝菌絲體液體發(fā)酵的胞內(nèi)靈芝三萜含量。然而靈芝子實(shí)體培養(yǎng)難以大規(guī)模生產(chǎn)，因此開發(fā)經(jīng)濟(jì)、安全、容易提取、純化從而適應(yīng)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，其目的在于采用變溫控制和光照處理相結(jié)合的刺激，提高靈芝菌絲體胞內(nèi)靈芝三萜含量，由此解決現(xiàn)有的靈芝三萜生產(chǎn)工藝中靈芝菌絲體發(fā)酵胞內(nèi)靈芝三萜含量低、難以提取純化、不適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)問題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，其特征在于，包括以下步驟：靈芝菌絲體種子培養(yǎng)階段以及擴(kuò)大培養(yǎng)階段；所述擴(kuò)大培養(yǎng)階段持續(xù)5至7天；其中每天配合變溫環(huán)境對(duì)靈芝菌絲體進(jìn)行光照處理，具體如下：在光照條件下培養(yǎng)4小時(shí)至16小時(shí)，在變溫條件下培養(yǎng)1至3小時(shí)，所述變溫條件為避光且維持高溫或低溫。優(yōu)選地，所述靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，其所述高溫在32℃至36℃之間；所述低溫在6℃至10℃之間。優(yōu)選地，所述靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，其所述擴(kuò)大培養(yǎng)階段第三天至結(jié)束，采用添加有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，其所述誘導(dǎo)劑為木材降解物。優(yōu)選地，所述靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，其所述誘導(dǎo)劑為D-半乳糖。優(yōu)選地，所述靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，其所述擴(kuò)大培養(yǎng)階段采用CYM培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，其所述CYM培養(yǎng)基每升含有：葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氫鉀0.883克、七水合硫酸鎂0.5克、以及維生素B10.05克。優(yōu)選地，所述靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，其所述擴(kuò)大培養(yǎng)階段第三天至結(jié)束，采用的CYM培養(yǎng)基含有質(zhì)量份數(shù)0.25％至1％的D-半乳糖。優(yōu)選地，所述靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，其所述種子培養(yǎng)階段采用多級(jí)種子發(fā)酵培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，其所述多級(jí)種子發(fā)酵培養(yǎng)具體步驟如下：(1)采用PDA液體培養(yǎng)基活化靈芝菌絲體，28℃至30℃，搖床轉(zhuǎn)速120-150r/min培養(yǎng)5至7天，獲得一級(jí)種子液；(2)將步驟(1)中獲得的一級(jí)種子液按照接種量體積比1:5，接種于第一靈芝種子培養(yǎng)基中，28℃至30℃，搖床轉(zhuǎn)速120-150r/min培養(yǎng)5天，獲得二級(jí)種子液；(3)將步驟(2)中獲得的二級(jí)種子液按照接種量體積比1:10，接種于第二靈芝種子培養(yǎng)基中，28℃至30℃，搖床轉(zhuǎn)速120-150r/min培養(yǎng)2天，獲得三級(jí)種子液。(4)將步驟(3)中獲得的三級(jí)種子液按照接種量體積比1:10，接種于CYM培養(yǎng)基中，28℃至30℃，搖床轉(zhuǎn)速120-150r/min培養(yǎng)1天，獲得靈芝菌絲體液體發(fā)酵體系?？傮w而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，實(shí)現(xiàn)了靈芝胞內(nèi)三萜含量的高水平積累，能夠在無(wú)需添加任何有害外源物質(zhì)的前提下，廉價(jià)、安全、易操作，可顯著提高胞內(nèi)靈芝三萜含量，適用于工業(yè)化生產(chǎn)靈芝三萜。同時(shí)本方法為菌絲體培養(yǎng)，相對(duì)于其他靈芝三萜生產(chǎn)方法，本工藝適合大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)提純方便，適合工業(yè)化生產(chǎn)。優(yōu)選方案，結(jié)合誘導(dǎo)劑，進(jìn)一步提高了靈芝菌絲體胞內(nèi)靈芝三萜的含量。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明提供的實(shí)施例1效果圖；圖2是本發(fā)明提供的實(shí)施例2效果圖。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。本發(fā)明提供的靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，包括：靈芝菌絲體種子培養(yǎng)階段以及擴(kuò)大培養(yǎng)階段：種子培養(yǎng)階段，優(yōu)選采用多級(jí)種子發(fā)酵培養(yǎng)，使得靈芝菌絲體能充分生長(zhǎng)形成長(zhǎng)勢(shì)良好適應(yīng)能力強(qiáng)的靈芝菌絲體液體發(fā)酵體系，適應(yīng)擴(kuò)大培養(yǎng)階段的變溫處理及光照處理，具體步驟如下：(1)采用PDA液體培養(yǎng)基活化靈芝菌絲體，28℃至30℃，搖床轉(zhuǎn)速120-150r/min培養(yǎng)5至7天，獲得一級(jí)種子液；其中，每升所述PDA液體培養(yǎng)基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，115℃滅菌25至40分鐘。(2)將步驟(1)中獲得的一級(jí)種子液按照接種量體積比1:5，接種于第一靈芝種子培養(yǎng)基中，28℃至30℃，搖床轉(zhuǎn)速120-150r/min培養(yǎng)5天，獲得二級(jí)種子液；每升所述第一靈芝種子培養(yǎng)基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氫鉀0.883g、七水硫酸鎂0.5g、以及維生素B10.05ml，115℃滅菌25至40分鐘。(3)將步驟(2)中獲得的二級(jí)種子液按照接種量體積比1:10，接種于第二靈芝種子培養(yǎng)基中，28℃至30℃，搖床轉(zhuǎn)速120-150r/min培養(yǎng)2天，獲得三級(jí)種子液；每升所述第二靈芝種子培養(yǎng)基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氫鉀1.0g、七水合磷酸二氫鉀0.5g、以及維生素B10.05ml，115℃滅菌25至40分鐘。(4)將步驟(3)中獲得的三級(jí)種子液按照接種量體積比1:10，接種于CYM培養(yǎng)基中，28℃至30℃，搖床轉(zhuǎn)速120-150r/min培養(yǎng)1天，獲得靈芝菌絲體液體發(fā)酵體系。每升所述CYM培養(yǎng)基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氫鉀0.883克、七水合硫酸鎂0.5克、以及維生素B10.05克，上述成分蒸餾水定容到1L，115℃滅菌25至40分鐘。擴(kuò)大培養(yǎng)階段：采用光照和變溫刺激靈芝菌絲體，培養(yǎng)所述靈芝菌絲體液體發(fā)酵體系，持續(xù)5至7天；其中每天配合變溫環(huán)境對(duì)靈芝菌絲體進(jìn)行光照處理，具體如下：在光照條件下培養(yǎng)4小時(shí)至16小時(shí)，在變溫條件下培養(yǎng)1至3小時(shí)，其他時(shí)間進(jìn)行25℃至28℃避光條件下培養(yǎng)。所述變溫條件為避光維持高溫或低溫；所述高溫在32℃至36℃之間，所述低溫在6℃至10℃之間，優(yōu)選8℃。擴(kuò)大培養(yǎng)階段，采用CYM培養(yǎng)基，每升所述CYM培養(yǎng)基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氫鉀0.883克、七水合硫酸鎂0.5克、以及維生素B10.05克，上述成分蒸餾水定容到1L，115℃滅菌25至40分鐘。優(yōu)選方案，在擴(kuò)大培養(yǎng)第三天起至發(fā)酵結(jié)束，采用添加有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所述誘導(dǎo)劑優(yōu)選為木材降解物，例如微晶纖維素、D-半乳糖、D-鼠李糖；優(yōu)選D-半乳糖，能溶于水，便于靈芝菌絲體的分離以及靈芝三萜的提取和純化。該階段，優(yōu)選采用的CYM培養(yǎng)基含有質(zhì)量份數(shù)0.25％至1％的D-半乳糖。目前一般認(rèn)為靈芝菌絲體擴(kuò)大培養(yǎng)階段不需要光照，光照可能影響目前普遍認(rèn)為食藥用真菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段不需要光誘導(dǎo)，一般在黑暗中進(jìn)行，如上海交通大學(xué)鐘建江教授在《SignificanceoffungalelicitorsontheproductionofganodericacidandGanodermapolysaccharidesbythesubmergedcultureofmedicinalmushroomGanodermalucidum》中采用暗培養(yǎng)，另外也在田雪梅等人的文獻(xiàn)中涉及到光質(zhì)對(duì)靈芝生長(zhǎng)的影響，指出不論何種光質(zhì)光量,都對(duì)靈芝MP-01菌株菌絲生長(zhǎng)有一定的負(fù)面作用。僅采用光照處理對(duì)靈芝菌絲體體內(nèi)靈芝三萜含量影響不明顯，同時(shí)抑制菌絲體生長(zhǎng)，因此總靈芝三萜產(chǎn)量增長(zhǎng)不多，甚至不增長(zhǎng)或者負(fù)增長(zhǎng)。本發(fā)明結(jié)合光照和變溫處理，刺激靈芝菌絲體大量積累靈芝三萜，產(chǎn)量增長(zhǎng)在50％以上。優(yōu)選方案，添加誘導(dǎo)劑的情況下，產(chǎn)量增長(zhǎng)達(dá)到90％。同時(shí)該工藝靈芝菌絲體分離容易，靈芝三萜提取純化工藝簡(jiǎn)單，肥腸適合大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。以下為實(shí)施例：實(shí)施例1靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，包括：靈芝菌絲體種子培養(yǎng)階段以及擴(kuò)大培養(yǎng)階段：種子培養(yǎng)階段，采用多級(jí)種子發(fā)酵培養(yǎng)，具體步驟如下：(1)采用PDA液體培養(yǎng)基活化靈芝菌絲體，28℃至30℃，搖床轉(zhuǎn)速120-150r/min培養(yǎng)7天，獲得一級(jí)種子液；其中，每升所述PDA液體培養(yǎng)基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，115℃滅菌40分鐘。(2)將步驟(1)中獲得的一級(jí)種子液按照接種量體積比1:5，接種于第一靈芝種子培養(yǎng)基中，28℃至30℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min培養(yǎng)5天，獲得二級(jí)種子液；每升所述第一靈芝種子培養(yǎng)基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氫鉀0.883g、七水硫酸鎂0.5g、以及維生素B10.05ml，115℃滅菌40分鐘。(3)將步驟(2)中獲得的二級(jí)種子液按照接種量體積比1:10，接種于第二靈芝種子培養(yǎng)基中，28℃至30℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min培養(yǎng)2天，獲得三級(jí)種子液；每升所述第二靈芝種子培養(yǎng)基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氫鉀1.0g、七水合磷酸二氫鉀0.5g、以及維生素B10.05ml，115℃滅菌25至40分鐘。(4)將步驟(3)中獲得的三級(jí)種子液按照接種量體積比1:10，接種于CYM培養(yǎng)基中，28℃至30℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min培養(yǎng)1天，獲得所述靈芝菌絲體液體發(fā)酵體系。每升所述CYM培養(yǎng)基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氫鉀0.883克、七水合硫酸鎂0.5克、以及維生素B10.05克，上述成分蒸餾水定容到1L，115℃滅菌40分鐘。擴(kuò)大培養(yǎng)階段：采用光照和變溫刺激靈芝菌絲體，培養(yǎng)所述靈芝菌絲體液體發(fā)酵體系，持續(xù)6天；其中每天配合變溫環(huán)境對(duì)靈芝菌絲體進(jìn)行光照處理，具體如下：在光照條件下培養(yǎng)4小時(shí)至16小時(shí)，在變溫條件下培養(yǎng)1至3小時(shí)，其他時(shí)間進(jìn)行25℃至28℃避光條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如表1所示，擴(kuò)大培養(yǎng)階段，采用CYM培養(yǎng)基，每升所述CYM培養(yǎng)基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氫鉀0.883克、七水合硫酸鎂0.5克、以及維生素B10.05克，上述成分蒸餾水定容到1L，115℃滅菌25至40分鐘。表1例如實(shí)驗(yàn)1的具體操作步驟為：每天3小時(shí)在8℃避光條件下發(fā)酵，8小時(shí)在光照條件、常溫度即28℃至30℃條件下發(fā)酵，剩余13小時(shí)在避光、常溫度即28℃至30℃條件下發(fā)酵；如此循環(huán)培養(yǎng)共計(jì)144小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，用布氏漏斗收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5-6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法測(cè)定靈芝三萜含量。取烘干的菌絲粉0.1g，置于試管中加入95％乙醇5ml，在超聲破碎儀中超聲破碎40min(重復(fù)3次)，合并上清，60℃旋蒸，3ml蒸餾水懸浮后用5ml氯仿萃取三次，合并上清，45℃旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞試管中，70℃蒸干后依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml，混勻，70℃水浴25min，取出冰上冷卻5min，加入5ml冰醋酸，混合后于550nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定靈芝三萜含量。檢測(cè)結(jié)果見表2、圖1。與比較例相比含量增加明顯，靈芝三萜含量增加百分比見表2。表2實(shí)驗(yàn)編號(hào)胞內(nèi)靈芝三萜含量mg/0.1DW含量提高百分比％12.55606527.068422.373338.794932.41006312.4681542.66498837.9606552.4494616.407962.82257853.7196572.77854549.316482.74957646.4195392.79013350.47515對(duì)比例2.2853810實(shí)施例2靈芝菌絲體發(fā)酵工藝，包括：靈芝菌絲體種子培養(yǎng)階段以及擴(kuò)大培養(yǎng)階段：種子培養(yǎng)階段：步驟具體同實(shí)施例1。擴(kuò)大培養(yǎng)階段：采用光照和變溫刺激靈芝菌絲體，培養(yǎng)所述靈芝菌絲體液體發(fā)酵體系，持續(xù)6天；其中每天配合變溫環(huán)境對(duì)靈芝菌絲體進(jìn)行光照處理，具體如下：在光照條件下培養(yǎng)4小時(shí)至16小時(shí)，在變溫條件下培養(yǎng)2小時(shí)，其他時(shí)間進(jìn)行25℃至28℃避光條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如表3所示，擴(kuò)大培養(yǎng)階段，采用CYM培養(yǎng)基，每升所述CYM培養(yǎng)基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氫鉀0.883克、七水合硫酸鎂0.5克、以及維生素B10.05克，上述成分蒸餾水定容到1L，115℃滅菌25至40分鐘。第三天至結(jié)束，在所述CYM培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑D-半乳糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表3所示，結(jié)果如圖1所示。表3例如實(shí)驗(yàn)1的具體操作步驟為：每天2小時(shí)在8℃避光條件下發(fā)酵，8小時(shí)在光照條件、常溫度即28℃至30℃條件下發(fā)酵，剩余14小時(shí)在避光、常溫度即28℃至30℃條件下發(fā)酵；在培養(yǎng)的第三天加入0.5％的D-半乳糖進(jìn)行發(fā)酵，如此循環(huán)培養(yǎng)共計(jì)144小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，用布氏漏斗收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5-6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法測(cè)定靈芝三萜含量。取烘干的菌絲粉0.1g，置于試管中加入95％乙醇5ml，在超聲破碎儀中超聲破碎40min(重復(fù)3次)，合并上清，60℃旋蒸，3ml蒸餾水懸浮后用5ml氯仿萃取三次，合并上清，45℃旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞試管中，70℃蒸干后依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml，混勻，70℃水浴25min，取出冰上冷卻5min，加入5ml冰醋酸，混合后于550nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定靈芝三萜含量。檢測(cè)結(jié)果見表4、圖2所示。與比較例相比含量增加明顯，靈芝三萜含量增加百分比見表4。表4實(shí)驗(yàn)編號(hào)胞內(nèi)靈芝三萜含量mg/0.1DW含量提高百分比％12.98410852.0882122.7963942.5209932.72338938.800443.71759689.4712453.00496553.1512363.50554578.6638272.73034139.1547483.36649571.5769993.57159482.03007對(duì)比例1.962090其中對(duì)比例種子培養(yǎng)階段與本例方法相同，擴(kuò)大培養(yǎng)階段條件為：避光條件下常溫即28℃至30℃培養(yǎng)144小時(shí)，采用CYM培養(yǎng)基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3