專利名稱：一種利用稀土元素提高靈芝三萜產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用稀土元素提高靈芝三萜的液體發(fā)酵 方法。
背景技術(shù)：
靈芝(Ganoderma lucidum)為擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝菌屬真菌。在中國古代被 盛傳為仙草，古代醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn)靈芝通過扶正固本使人體處于平衡狀態(tài)。靈芝三萜是靈芝最 主要的生理活性物質(zhì)之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明靈芝具有抗腫瘤、抗衰老、防止動(dòng)脈硬化等 作用，以及護(hù)肝保肝、抗病毒、抗輻射等功能。在靈芝藥用價(jià)值被廣泛揭示的同時(shí)，靈芝三萜 的產(chǎn)量成為抑制其應(yīng)用的限制因素，因?yàn)樵谧匀唤缰幸吧`芝十分稀少，遠(yuǎn)不能滿足人們 的需要。采用靈芝液體發(fā)酵的方法生產(chǎn)靈芝三萜因?yàn)榫哂猩a(chǎn)周期短、勞動(dòng)力省以及受外 部環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是一種有效的方法。但靈芝三萜的發(fā)酵水平不高，產(chǎn)量偏低限制了其工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展。目前，國內(nèi)外 學(xué)者對(duì)靈芝三萜的發(fā)酵研究主要集中在培養(yǎng)基組成、溶氧、PH值及產(chǎn)物提取分離等工藝層 面上，對(duì)靈芝三萜發(fā)酵水平提高有限，還不能滿足現(xiàn)代工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的需要。CN101353689A(CN200810143120. 1)公開了 一種提高靈芝發(fā)酵液中靈芝三萜產(chǎn) 量的方法，使用靈芝屬Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr. )Karst.的菌種，菌株保藏號(hào)為 CCGMC5. 616，通過如下步驟進(jìn)行1、將靈芝菌種接種含有碳源、氮源、礦物元素成分的培養(yǎng) 基，在溫度為26-30°C、轉(zhuǎn)速為130-180r/min條件下回轉(zhuǎn)式深層發(fā)酵1 5天；2、補(bǔ)加棕 櫚酸1. 5-3. Og/L后，在溫度為25-30°C、轉(zhuǎn)速為100-180r/min條件下回轉(zhuǎn)式深層發(fā)酵3 6天結(jié)束；3、從發(fā)酵液中提取靈芝三萜，產(chǎn)量為396. 2mg/L。該發(fā)明僅提取了發(fā)酵液中三萜 (即胞外三萜)的產(chǎn)量，發(fā)酵菌絲體三萜(即胞內(nèi)三萜)沒有涉及，使產(chǎn)量部分損失。稀土 元素是化學(xué)元素周期表中鑭系元素及兩個(gè)相關(guān)元素鈧和釔的總稱，我國稀土資源豐富，占 世界貯量的80 %。目前，稀土元素的應(yīng)用越來越廣泛，不僅應(yīng)用于各工業(yè)部門，其在農(nóng)業(yè)、醫(yī) 藥、微生物等生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究也越來越活躍。近年來有關(guān)利用稀土元素提高微生物 發(fā)酵產(chǎn)物的研究也有報(bào)道，參見王怡平等.稀土元素對(duì)紅酵母的生長及類胡蘿卜素合成的 影響.微生物學(xué)通報(bào)，1999，26 (2) :117-119;以及李增利.稀土元素鐠、釹、鉺對(duì)紅菇多糖 深層發(fā)酵的影響.食品科學(xué)，2007，28 (12) :312-316。目前，稀土元素在靈芝液體發(fā)酵上的 應(yīng)用研究尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供稀土元素在靈芝三萜液體發(fā)酵中的應(yīng)用，同時(shí)提供稀土元素在靈 芝三萜發(fā)酵中的使用方法，從而提供一種工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、效果顯著，利用稀土元素提 高靈芝三萜產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，本方法可用于靈芝三萜的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明所述的靈芝三萜產(chǎn)量包括靈芝胞外三萜和胞內(nèi)三萜產(chǎn)量。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種利用稀土元素提高靈芝三萜產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，包括以下步驟(1)將靈芝菌種接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速 100 180r/min，溫度25 30°C，時(shí)間5 8天，得到靈芝種子液。所述的靈芝菌種為泰山赤靈芝(Ganoderma lucidum)，菌種編號(hào)為CGMCC No. 5. 644 ；所述的PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為馬鈴薯200g、葡萄糖20g和蒸餾水IOOOmL ；(2)將步驟⑴制得的靈芝種子液按4-6%體積比接種量接入到含有濃度為 0. 001-0. 15mmol/L稀土元素的PD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 180r/min，溫度25 30°C，時(shí)間5 8天，得發(fā)酵液和靈芝菌絲體混合物，分離出發(fā)酵液及 靈芝菌絲體備用。所述的稀土元素為鐠Pr3+、釹Nd3+或鑭La3+ ；所述的PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為馬鈴薯200g、葡萄糖20g和蒸餾水1000mL。(3)從步驟(2)所得的發(fā)酵液中提取靈芝胞外三萜，從靈芝菌絲體提取靈芝胞內(nèi) 三萜，采用現(xiàn)有技術(shù)即可。靈芝胞外三萜和胞內(nèi)三萜產(chǎn)量分別可達(dá)到610. lmg/L和398. 5mg/L。添加鐠 Pr3+、釹Nd3+或鑭La3+相對(duì)應(yīng)地靈芝三萜總產(chǎn)量(胞外三萜和胞內(nèi)三萜合并計(jì)算)可達(dá)到 700mg/L、830mg/L或840mg/L。本發(fā)明所得靈芝三萜可用于抗腫瘤、保肝護(hù)肝、抗病毒等藥 物的制備。根據(jù)上述方法，本發(fā)明進(jìn)一步做以下優(yōu)選步驟⑵所述的稀土元素優(yōu)選為鑭La3+或釹Nd3+，最優(yōu)選的稀土元素為鑭La3+。步驟(2)所述的稀土元素在PD液體培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選為鑭 La3+O. 001-0. 01mmol/L、釹 Nd3+O. 001-0. 01mmol/L 或鐠 Pr3+O. 01-0. lmmol/L。步驟⑵所述的含有濃度為0.001-0. 15mmol/L稀土元素的PD液體培養(yǎng)基是按以 下方法制備的稱取純度為99%的硝酸鐠、硝酸釹或硝酸鑭，用蒸餾水配制成濃度lmol/L的溶 液；加入到所述PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，制得含有濃度為0. 001-0. 15mmol/L稀土元素的PD
液體培養(yǎng)基。步驟(2)所述的發(fā)酵液及靈芝菌絲體的分離是在15000r/min下離心分離。步驟(3)所述的靈芝三萜的提取，包括從發(fā)酵液中提取胞外三萜和從靈芝菌絲體 中提取胞內(nèi)三萜，步驟如下胞外三萜的提取取分離除去菌絲體的發(fā)酵液，加入4倍體積的95%乙醇，沉淀除 去多糖和其它大分子物質(zhì)，再將上清液濃縮蒸餾去除乙醇，然后用乙酸乙酯萃取，再濃縮 蒸餾去除乙酸乙酯。胞內(nèi)三萜的提取取干重為0. 5 1. Og的靈芝菌絲體研成粉末，加30 50mL甲 醇超聲提取2 5h，過濾，取上清，濃縮蒸餾去除甲醇。靈芝三萜含量的測(cè)定采用本領(lǐng)域常規(guī)的紫外比色法測(cè)定靈芝三萜(靈芝酸)含量，測(cè)定方法簡(jiǎn)述如 下a.將50 IOOmL從去除菌絲體的發(fā)酵液中提取出的胞外三萜，加1 2mL甲醇溶解，作為待測(cè)溶液。b.將從干重0.5 l.Og菌絲體中提取出的胞內(nèi)三萜，加甲醇定容至2 5mL，作 為待測(cè)溶液。加待測(cè)樣品溶液0. ImL于試管中，再加香草醛0. 2mL，高氯酸0. 5mL，混勻后于60°C 水浴中保溫20min，取出后置冷水中15min，再加入冰醋酸5mL，于550nm處測(cè)定吸光值，根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三萜類物質(zhì)含量。本發(fā)明同已有技術(shù)相比有如下積極效果1、本發(fā)明將稀土元素鐠Pr3+、釹Nd3+或鑭La3+用于靈芝三萜的液體發(fā)酵，靈芝胞外 三萜和胞內(nèi)三萜產(chǎn)量分別可達(dá)到610. lmg/L和398. 5mg/L，極大地提高了靈芝三萜的產(chǎn)量， 具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。2、本發(fā)明所述稀土元素Pr3+、釹Nd3+或鑭La3+來源廣泛，均具有很好的促進(jìn)效果， 實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好。3、本發(fā)明所采用的靈芝液體發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，環(huán)保無毒，原材料成本低廉，更為重要 的是整個(gè)發(fā)酵過程可控，不受外部環(huán)境條件限制，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1稀土元素對(duì)靈芝胞外三萜產(chǎn)量的影響曲線，根據(jù)實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-2。圖2稀土元素對(duì)靈芝胞內(nèi)三萜產(chǎn)量的影響曲線，根據(jù)實(shí)施例4-6及對(duì)比例3-4。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，所用原料及培養(yǎng)基如下實(shí)施例中所述的發(fā)酵用靈芝菌種為泰山赤靈芝(Ganoderma lucidum)，菌種編號(hào) 為CGMCC No. 5. 644，購自中國普通微生物菌種保藏中心。純度為99%的硝酸鐠、硝酸釹和 硝酸鑭，購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。實(shí)施例中所用的含有稀土元素的PD液體培養(yǎng)基的配制稱取純度為99%的硝酸鐠、硝酸釹或硝酸鑭，用蒸餾水配制成濃度lmol/L的溶 液；加入到所述PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別制得i含有濃度為0. 001mmol/L、0. Olmmol/L、 0. lmmol/L稀土元素鐠Pr3+的PD液體培養(yǎng)基， 含有濃度為0. 001mmol/L、0. 01mmol/L、 0. 1 mmol/L稀土元素釹NcT的PD液體培養(yǎng)基，iii含有濃度為0. 001mmol/L、0. 01mmol/L、 0. lmmol/L稀土元素La3+的PD液體培養(yǎng)基，備用。實(shí)施例1-6中所用的PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾 7jc 1 OOOmL。實(shí)施例1 一種利用稀土元素提高靈芝三萜產(chǎn)量液體發(fā)酵方法，步驟為1.將靈芝菌種CGMCC No. 5. 644接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng) 條件為搖床轉(zhuǎn)速160r/min，溫度25 30°C，時(shí)間6天，得到靈芝種子液。2.將上述獲得的靈芝種子液按5% (V/V)的接種量分別接入到含有濃度為 0. 001mmol/L、0. 01mmol/L、0. lmmol/L稀土元素鐠Pr3+的PD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速160r/min，溫度25 30°C，時(shí)間6天，得發(fā)酵液和靈芝菌絲體混合物， 15000r/min離心分離，得發(fā)酵液和靈芝菌絲體。分別提取靈芝胞外三萜和胞內(nèi)三萜。
胞外三萜的提取取50mL除去菌體的發(fā)酵液，加入用4倍體積的95%乙醇，沉淀 除去多糖和其它大分子物質(zhì)后，上清液濃縮去除乙醇，然后用乙酸乙酯萃取，濃縮去除乙酸 乙酯。得胞外三萜。加ImL甲醇溶解即為待測(cè)溶液。胞內(nèi)三萜的提取取干重為1. Og的靈芝菌絲體研成粉末，加50mL甲醇超聲提取 5h，過濾，取上清，濃縮蒸餾去除甲醇。得胞內(nèi)三萜。三萜的測(cè)定加待測(cè)樣品溶液0. ImL于試管中，再加香草醛0. 2mL,高氯酸0. 5mL, 混勻后于60°C水浴中保溫20min，取出后置冷水中15min，再加入冰醋酸5mL，于550nm處測(cè) 定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三萜類物質(zhì)含量。結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例2 如實(shí)施例1所述，所不同的是步驟2中稀土元素鐠Pr3+替代為釹Nd3+。 結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例3 如實(shí)施例1所述，所不同的是步驟2中稀土元素鐠Pr3+替代為鑭La3+。 結(jié)果如圖1所示。對(duì)比例1 如實(shí)施例1所述，所不同的是步驟2中稀土元素鐠Pr3+替代為鈰Ce3+。 結(jié)果如圖1所示。其中含有稀土元素鈰Ce3+的PD液體培養(yǎng)基，是用純度為99%的硝酸鈰 按實(shí)施例的相同方法配制的。對(duì)比例2 如實(shí)施例1所述，所不同的是步驟2中稀土元素鐠Pr3+替代為鉺Er3+。 結(jié)果如圖1所示。其中含有稀土元素鉺Er3+的PD液體培養(yǎng)基，是用純度為99%的硝酸鉺 按實(shí)施例的相同方法配制的。根據(jù)以上實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-2可知稀土元素鑭La3+、釹Nd3+和鐠Pr3+對(duì) 靈芝胞外三萜的產(chǎn)量具有顯著的促進(jìn)作用，胞外三萜的產(chǎn)量分別使可達(dá)到610. 08mg/L、 489. 22mg/L和340. 15mg/L ；而作為對(duì)比的稀土元素鈰Ce3+和鉺Er3+對(duì)靈芝胞外三萜產(chǎn)量 不但沒有促進(jìn)作用，甚至還體現(xiàn)一定的抑制作用。實(shí)施例4 一種利用稀土元素提高靈芝三萜產(chǎn)量液體發(fā)酵方法，步驟為1.將靈芝菌種CGMCC No. 5. 644接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，葡萄糖 20g，蒸餾水IOOOmL)中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速150r/min，溫度25 30°C，時(shí) 間7天，得到靈芝種子液。2.將上述獲得的靈芝種子液按6% (V/V)的接種量分別接入到含有濃度為 0. 001mmol/L、0. 01mmol/L、0. lmmol/L稀土元素鐠Pr3+的PD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速150r/min，溫度25 30°C，時(shí)間7天，過濾得發(fā)酵液和靈芝菌絲體， 15000r/min離心分離，得發(fā)酵液和靈芝菌絲體。分別提取靈芝胞外三萜和胞內(nèi)三萜。靈芝胞外三萜的提取如實(shí)施例1。胞內(nèi)三萜的提取取去除發(fā)酵液的1. Og靈芝菌絲體(干重)研成粉末，加50mL甲 醇超聲提取4h，過濾，取上清，濃縮蒸餾去除甲醇。得胞內(nèi)三萜。 取胞內(nèi)三萜加甲醇定容至5mL作為待測(cè)液。胞內(nèi)三萜的測(cè)定加待測(cè)樣品溶液0. ImL于試管中，再加香草醛0. 2mL,高氯酸 0. 5mL,混勻后于60°C水浴中保溫20min，取出后置冷水中15min，再加入冰醋酸5mL，于 550nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三萜類物質(zhì)含量。結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例5、6 將以上實(shí)施例4的步驟2中稀土元素鐠Pr3+分別替換成釹Nd3+、鑭La3+，重復(fù)實(shí)施例4的方法步驟，所得結(jié)果如圖2所示。作為對(duì)比例3、4，將以上實(shí)施例4的步驟2中稀土元素鐠Pr3+分別替換成鈰Ce3+、 鉺Er3+重復(fù)實(shí)施例4的方法步驟，所得結(jié)果如圖2所示。根據(jù)以上實(shí)施例4-6及對(duì)比例3-4可知稀土元素鐠Pr3+、鑭La3+和釹Nd3+對(duì) 靈芝胞內(nèi)三萜的產(chǎn)量具有明顯促進(jìn)作用，可分別是產(chǎn)量達(dá)到398. 49mg/L、347. 59mg/L和 341.05mg/L;而作為對(duì)比例的稀土元素鈰Ce3+對(duì)靈芝胞內(nèi)三萜的產(chǎn)量也具有一定的促進(jìn)作 用，可使產(chǎn)量達(dá)到298. 10mg/L，但稀土元素鉺Er3+卻抑制靈芝胞內(nèi)三萜的生產(chǎn)。
權(quán)利要求
一種利用稀土元素提高靈芝三萜產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，包括以下步驟(1)將靈芝菌種接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100～180r/min，溫度25～30℃，時(shí)間5～8天，得到靈芝種子液；所述的靈芝菌種為泰山赤靈芝(Ganoderma lucidum)，菌種編號(hào)為CGMCC No.5.644；所述的PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為馬鈴薯200g、葡萄糖20g和蒸餾水1000mL；(2)將步驟(1)制得的靈芝種子液按4 6％體積比接種量接入到含有濃度為0.001 0.15mmol/L稀土元素的PD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100～180r/min，溫度25～30℃，時(shí)間5～8天，得發(fā)酵液和靈芝菌絲體混合物，分離出發(fā)酵液及靈芝菌絲體備用；所述的稀土元素為鐠Pr3+、釹Nd3+或鑭La3+；所述的PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為馬鈴薯200g、葡萄糖20g和蒸餾水1000mL；(3)從步驟(2)所得的發(fā)酵液中提取靈芝胞外三萜，從靈芝菌絲體提取靈芝胞內(nèi)三萜。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的稀土元素為鑭或釹。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的稀土元素為鑭。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的稀土元素在PD液體培養(yǎng)基 中的濃度為鑭 0. 001-0. 01mmol/L、錢 0. 001-0. 01mmol/L 或鐠 0. 01-0. lmmol/L。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑵所述的含有濃度為 0. 001-0. 15mmol/L稀土元素的PD液體培養(yǎng)基是按以下方法制備的稱取純度為99%的硝酸鐠、硝酸釹或硝酸鑭，用蒸餾水配制成濃度lmol/L的溶液；加 入到所述PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，制得含有濃度為0. 001-0. 15mmol/L稀土元素的PD液體培 養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種利用稀土元素提高靈芝三萜產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法。該方法是利用靈芝細(xì)胞的液體培養(yǎng)，通過在培養(yǎng)基中添加稀土元素鐠Pr3+、釹Nd3+或鑭La3+，提高靈芝三萜的產(chǎn)量。所產(chǎn)靈芝三萜可用于抗腫瘤、保肝護(hù)肝、抗病毒等藥物的開發(fā)。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101892282SQ20101023070
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者任海霞, 任鵬飛, 劉巖, 姚強(qiáng), 宮志遠(yuǎn), 曲玲, 李瑾, 趙軍勝, 韓建東, 高興喜 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所