本發(fā)明是關于生物質能利用技術，特別涉及一種色圈法快速篩檢核誘變高效產氫菌株的方法。
背景技術：
隨著化石能源的日益消耗，可再生能源吸引了越來越多的注意。從經濟發(fā)展和生態(tài)環(huán)境保護的角度來看，氫能是非常具有吸引力的替代能源，其燃燒產物是水，不產生任何污染。發(fā)酵法生物制氫具有獨特的優(yōu)勢，以其產氫效率高，穩(wěn)定性強，控制要求簡單，操作成本低，靈活性高等特點成為新能源的一個重要發(fā)展方向。Zhang等人綜述了產氣腸桿菌產氫的研究進展(Zhang et al,2011)。Mahyudin等人通過丙烯醇和質子自殺誘變法獲得了產氣腸桿菌突變株AY-2，其產氫量高于野生菌(Mahyudin et al,1997)。Lu等人通過He-Ne激光輻射的方法獲得了穩(wěn)定高產的產氫菌突變株HB-5M(Luetal,2007)。Song等人通過對陰溝腸桿菌過表達氫酶基因，使得改造菌產氫量大幅度提高。因此如何選育優(yōu)良的高效產氫菌種是發(fā)酵法生物制氫的關鍵技術問題。
近幾年微生物誘變育種方法已經廣泛用于發(fā)酵工業(yè)，包括物理誘變方法如紫外輻射和離子束，以及化學誘變方法如疊氮化鈉、二乙基硫酸鹽和乙基甲磺酸鹽。在這些誘變方法中，操作者的健康安全性和誘變效率是主要問題。60Co-γ射線具有強穿透力，并且誘變時間短，誘變效率高，是一種獲得目標突變株的高效誘變方法。但是針對發(fā)酵產氫菌株，利用核輻射誘變的研究至今罕見報道。
傳統(tǒng)篩選優(yōu)勢產氫菌株的方法是隨機大量挑選平板細胞，接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過發(fā)酵測試對比野生菌株考察其產氫量有無提高，從而選出產氫量明顯提高的優(yōu)勢菌株。但是該方法費時費力成本較高，尤其是對于大量篩檢核誘變后的產氫菌突變體時，往往因工作量過于龐大而難以完成全部篩檢任務。例如將產氣腸桿菌的菌懸液(含有細胞約1╳108個/mL)在600Gy的γ射線下進行核輻射誘變，由于細胞致死率約為85％，故至少會產生1.5╳107個/mL突變單細胞活體。數量龐大，難以全部進行發(fā)酵驗證，故目前尚沒有建立一種系統(tǒng)高效的方法篩選核誘變后的高效產氫菌株。
我們注意到色圈法利用溴甲酚紫遇酸變色的特點，可以對產酸細菌進行篩選。產酸量越多，其色圈越大。而產氫菌在生產氫氣的同時伴隨著酸的產生，利用色圈大小挑選酸產量高的優(yōu)勢產氫菌是可行的。本發(fā)明提出利用色圈法篩選產酸量多的產氫菌突變株，以間接得到產氫能力顯著提高的產氫菌突變株，是一種快速篩檢核誘變高效產氫菌株的高效可行方法。
技術實現要素：
本發(fā)明要解決的技術問題是克服現有技術中的不足，提供一種色圈法快速篩檢核誘變高效產氫菌株的方法。
為解決上述技術問題，本發(fā)明的解決方案是：
提供一種色圈法快速篩檢核誘變高效產氫菌株的方法，包括下述步驟：
(1)取1ml產氫菌接種至100ml LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、180rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)6h至產氫菌生長到對數生長期；離心除去液體培養(yǎng)基，用生理鹽水制備菌懸液；玻璃珠振蕩分散后，以無菌濾紙或脫脂棉過濾，形成單細胞菌懸液；
(2)在多個試管內分別加入1ml單細胞菌懸液，并將各試管同時浸于冰水中；分別用不同劑量的60Co-γ射線對各試管內的菌懸液進行輻射，輻射結束后繼續(xù)冰浴1-2小時；將輻射過的菌懸液分別接種在100ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基中；用LB液體培養(yǎng)基稀釋106倍后，取0.1ml菌懸液涂在固體平板培養(yǎng)基上；
根據輻射前后的菌落數計算各輻射劑量下的致死率，致死率LR＝(U-T)/U×100％；其中U為輻射前存活的總菌落數，T為輻射后存活的菌落數；(存活的菌落數采用肉眼觀察)
(3)選擇致死率在85-95％之間的菌懸液，用LB液體培養(yǎng)基稀釋106倍后，均勻涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，在37℃條件下倒置培養(yǎng)12～24小時，至菌株周圍出現明顯的黃色色圈；挑選長勢良好并周圍具有相對更大黃色色圈的菌株，作為具備更高產氫能力的菌株；
所述LB液體培養(yǎng)基按下述配比關系配置而成：取0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.5g NaCl，加入至100mL去離子水中，混勻即可；
所述固體平板培養(yǎng)基按下述配比關系配置而成：取0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.5g NaCl、2g瓊脂粉，加入至100mL去離子水中，混勻即可；
所述篩選培養(yǎng)基的pH值為7，其組分及配比關系為：每100ml篩選培養(yǎng)基中含有2g葡萄糖、0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.5g NaCl、2g瓊脂粉、0.04％溴甲酚紫，余量為去離子水。
本發(fā)明中，所述用不同劑量的60Co-γ射線是指從200～1000Gy不同劑量的60Co-γ射線，其劑量間隔根據實驗精度要求設置。例如，使用200、400、600、800、1000Gy劑量的60Co-γ射線進行輻射。
本發(fā)明中，所述產氫菌是產氣腸桿菌、丁酸梭菌或陰溝腸桿菌中的任意一種。
本發(fā)明中，所述單細胞菌懸液的濃度為1×108個/ml。
發(fā)明原理描述：
產氫菌的主要發(fā)酵代謝產氫方程式為：
C6H12O6+2H2O→2CH3COOH+2CO2+4H2
C6H12O6→CH3CH2CH2COOH+2CO2+2H2
產氫菌發(fā)酵代謝產生H2的同時也產生了乙酸和丁酸，如果產氫菌的產氫量提高，那么乙酸和丁酸的產量也會隨之增加。溴甲酚紫是一種酸堿指示劑，變色范圍pH＝5.2～6.8，其變色的色圈會隨著酸量增多而變大。挑選長勢良好并具有較大黃色色圈的細胞，可以確定產酸量高的菌株，從而能夠篩選出相應產氫能力更高的菌株。
與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明利用產氫菌發(fā)酵生產氫氣過程中必然伴隨產酸的特點，在篩選培養(yǎng)基中根據細胞周圍色圈的大小篩選出產酸量多的細胞，以間接得到產氫能力顯著提高的產氫菌突變株。此方法對于篩選核誘變后高效產氫菌的目標突變株，能夠大大提高篩選工作效率，減少了勞動時間成本。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實施方式
下面結合附圖與具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細描述。下面的實施例可以使本專業(yè)的專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
本發(fā)明所用產氫菌是產氣腸桿菌、丁酸梭菌或陰溝腸桿菌中的任意一種，均采購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
實施例1
(1)取1ml產氣腸桿菌接種至100ml LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、180rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)6h至產氫菌生長到對數生長期。離心除去液體培養(yǎng)基，用生理鹽水制備菌懸液，玻璃珠振蕩分散，以無菌濾紙或脫脂棉過濾，形成單細胞菌懸液(濃度為1×108個/ml)。所述LB液體培養(yǎng)基的組成為：取0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.5g NaCl，加入至100mL去離子水中，混勻。
(2)在多個試管內分別移入1ml單細胞菌懸液，并將各試管同時浸于冰水中；分別用200、400、600、800、1000Gy劑量的60Co-γ射線對試管內的菌懸液進行輻射，輻射結束后繼續(xù)冰浴1小時。將輻射過的菌懸液分別接種在100ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，用LB液體培養(yǎng)基稀釋106倍后，取0.1ml菌懸液涂在固體平板培養(yǎng)基上。所述固體平板培養(yǎng)基的組成為：取0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.5g NaCl、2g瓊脂粉，加入至100mL去離子水中，混勻。根據輻射前后的菌落數計算各輻射劑量下的致死率，致死率LR＝(U-T)/U×100％；其中U為輻射前存活的總菌落數，T為輻射后存活的菌落數(采用肉眼觀察確定存活的菌落數)。
(3)選擇致死率為85％(輻射劑量600Gy)的菌懸液，用LB液體培養(yǎng)基稀釋106倍后，均勻涂布于篩選培養(yǎng)基平板上。所述篩選培養(yǎng)基(pH＝7)的組成為：每100ml篩選培養(yǎng)基中含有2g葡萄糖、0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.5g NaCl、2g瓊脂粉、0.04％溴甲酚紫，余量為去離子水。在37℃條件下倒置培養(yǎng)12小時，至細胞周圍出現明顯的黃色色圈。挑選長勢良好并且具有相對更大黃色色圈的菌株，作為具備更高產氫能力(提高了81.8％)的菌株。
實施例2
(1)取1ml丁酸梭菌接種至100ml LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、180rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)6h至產氫菌生長到對數生長期。離心除去液體培養(yǎng)基，用生理鹽水制備菌懸液，玻璃珠振蕩分散，以無菌濾紙或脫脂棉過濾，形成單細胞菌懸液(濃度為1×108個/ml)。所述LB液體培養(yǎng)基的組成為：取0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.5g NaCl，加入至100mL去離子水中，混勻。
(2)在多個試管內分別移入1ml單細胞菌懸液，并將各試管同時浸于冰水中；分別用200、400、600、800、1000Gy劑量的60Co-γ射線對試管內的菌懸液進行輻射，輻射結束后繼續(xù)冰浴1.5小時。將輻射過的菌懸液分別接種在100ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，用LB液體培養(yǎng)基稀釋106倍后，取0.1ml菌懸液涂在固體平板培養(yǎng)基上。所述固體平板培養(yǎng)基的組成為：取0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.5g NaCl、2g瓊脂粉，加入至100mL去離子水中，混勻。根據輻射前后的菌落數計算各輻射劑量下的致死率，致死率LR＝(U-T)/U×100％；其中U為輻射前存活的總菌落數，T為輻射后存活的菌落數(采用肉眼觀察確定存活的菌落數)。
(3)選擇致死率為90％(輻射劑量600Gy)的菌懸液，用LB液體培養(yǎng)基稀釋106倍后，均勻涂布于篩選培養(yǎng)基平板上。所述篩選培養(yǎng)基(pH＝7)的組成為：每100ml篩選培養(yǎng)基中含有2g葡萄糖、0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.5g NaCl、2g瓊脂粉、0.04％溴甲酚紫，余量為去離子水。在37℃條件下倒置培養(yǎng)18小時，至細胞周圍出現明顯的黃色色圈。挑選長勢良好并且具有相對更大黃色色圈的菌株，作為具備更高產氫能力(提高了92.4％)的菌株。
實施例3
(1)取1ml陰溝腸桿菌接種至100ml LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、180rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)6h至產氫菌生長到對數生長期。離心除去液體培養(yǎng)基，用生理鹽水制備菌懸液，玻璃珠振蕩分散，以無菌濾紙或脫脂棉過濾，形成單細胞菌懸液(濃度為1×108個/ml)。所述LB液體培養(yǎng)基的組成為：取0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.5g NaCl，加入至100mL去離子水中，混勻。
(2)在多個試管內分別移入1ml單細胞菌懸液，并將各試管同時浸于冰水中；分別用200、400、600、800、1000Gy劑量的60Co-γ射線對試管內的菌懸液進行輻射，輻射結束后繼續(xù)冰浴2小時。將輻射過的菌懸液分別接種在100ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，用LB液體培養(yǎng)基稀釋106倍后，取0.1ml菌懸液涂在固體平板培養(yǎng)基上。所述固體平板培養(yǎng)基的組成為：取0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.5g NaCl、2g瓊脂粉，加入至100mL去離子水中，混勻。根據輻射前后的菌落數計算各輻射劑量下的致死率，致死率LR＝(U-T)/U×100％；其中U為輻射前存活的總菌落數，T為輻射后存活的菌落數(采用肉眼觀察確定存活的菌落數)。
(3)選擇致死率為95％(輻射劑量800Gy)的菌懸液，用LB液體培養(yǎng)基稀釋106倍后，均勻涂布于篩選培養(yǎng)基平板上。所述篩選培養(yǎng)基(pH＝7)的組成為：每100ml篩選培養(yǎng)基中含有2g葡萄糖、0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.5g NaCl、2g瓊脂粉、0.04％溴甲酚紫，余量為去離子水。在37℃條件下倒置培養(yǎng)24小時，至細胞周圍出現明顯的黃色色圈。挑選長勢良好并且具有相對更大黃色色圈的細胞，作為具備更高產氫能力(提高了68.9％)的菌株。
最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有很多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容中直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。