本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用于細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞爬片的制備方法，特別涉及一種通過(guò)靜電紡絲機(jī)制備載藥細(xì)胞爬片的方法。

背景技術(shù)：

在進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，需要經(jīng)常使用細(xì)胞爬片，細(xì)胞爬片是將蓋玻片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基中，使其在玻片上能夠生長(zhǎng)，細(xì)胞爬片根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要有圓形和方形的，并且大小不同。利用細(xì)胞爬片進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，可以很好的排除體內(nèi)諸多的干擾因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，因此，制備細(xì)胞爬片是體外細(xì)胞培養(yǎng)的一種重要技術(shù)。

靜電紡絲技術(shù)制備的納米纖維膜結(jié)構(gòu)類似于細(xì)胞外基質(zhì)，其三維立體結(jié)構(gòu)使得材料具有高比表面積，且便于制備，已被廣泛應(yīng)用于組織工程中。玉米醇溶蛋白(Zein)是從天然材料玉米蛋白粉中提取出來(lái)的，具有良好成膜性能，已經(jīng)在藥物釋放領(lǐng)域有了深入的研究。申請(qǐng)?zhí)枮?01210084617.7的專利中，記載了用于細(xì)胞培養(yǎng)的載體材料，即玉米醇溶蛋白和聚乙烯醇靜電紡出的納米纖維膜的制備方法。

關(guān)于制備細(xì)胞爬片的方法，在申請(qǐng)?zhí)枮?01410141763.8的專利一文中，僅記載了一種直接將消毒后的爬片浸入到培養(yǎng)液內(nèi)，而后放入培養(yǎng)板中，將細(xì)胞懸垂液加入進(jìn)行培養(yǎng)的方法。申請(qǐng)?zhí)枮?01510175512.6的文獻(xiàn)中，公開(kāi)了一種對(duì)玻片表面進(jìn)行處理的方法，但仍然沒(méi)有任何載藥細(xì)胞爬片的制備，從而適用不同細(xì)胞培養(yǎng)需求的記載。

因此，制備安全無(wú)毒、可降解的載藥細(xì)胞爬片，成為亟待解決的課題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為解決目前存在的上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種通過(guò)靜電紡絲制備載藥細(xì)胞爬片的方法，這種方法可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中所需藥量來(lái)控制載藥量，簡(jiǎn)單易行，實(shí)用性強(qiáng)。

本發(fā)明通過(guò)靜電紡絲制備載藥細(xì)胞爬片的方法，包括如下步驟：

a.取普通蓋玻片，用蒸餾水浸泡沖洗干凈后，置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌備用，滅菌條件為121℃，20min；

b.稱取玉米醇溶蛋白、聚乳酸，分別溶于六氟異丙醇中，配制成質(zhì)量百分比濃度分別為14％和6％的殼層和核層紡絲溶液，并向殼核層溶液中分別加入設(shè)定量的地塞米松(DEX)和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2)，磁力攪拌4h備用；

c.用步驟b制得的紡絲溶液在靜電紡絲機(jī)上紡絲，紡絲電壓為15KV，紡絲速度殼核層分別為0.8ml/h和0.6ml/h，紡絲距離為12cm，當(dāng)紡絲層達(dá)到設(shè)定厚度后，將步驟a所述的滅菌蓋玻片放置在該紡絲層上，再繼續(xù)紡絲至設(shè)定厚度，紡絲結(jié)束；

d.紡絲結(jié)束，將步驟c獲得的紡絲物從靜電紡絲機(jī)的接收裝置取下，切割整形后放入真空干燥箱干燥后即獲得以蓋玻片為基板，其外圍包裹有同軸殼核層纖維膜的載藥細(xì)胞爬片。

步驟b中所述加入的DEX為殼層紡絲溶液中玉米醇溶蛋白質(zhì)量的5％，加入的rhBMP-2為核層紡絲溶液中聚乳酸質(zhì)量的0.012％～0.03％。根據(jù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)需求可選取其它藥物種類和質(zhì)量。

本發(fā)明采用的蓋玻片直徑為13mm，制備出的細(xì)胞爬片直徑為14mm。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果：

本發(fā)明所采用的藥物載體材料為生物相容性良好的天然蛋白類物質(zhì)，以及高分子材料聚乳酸，安全無(wú)毒可體內(nèi)降解，利用靜電紡絲的方法制備出的覆蓋普通蓋玻片的載藥納米纖維膜具有三維多孔結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)和增殖。且這種細(xì)胞爬片解決了將蓋玻片置于培養(yǎng)皿底部被夾持時(shí)出現(xiàn)的不穩(wěn)定，如傾覆和側(cè)翻等現(xiàn)象，針對(duì)不同細(xì)胞培養(yǎng)有效提高了實(shí)驗(yàn)效果。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中所制備的細(xì)胞爬片的實(shí)物照片；

圖2是實(shí)施例1中所述細(xì)胞爬片的微觀掃描電鏡圖；

圖3是應(yīng)用實(shí)施例1中細(xì)胞培養(yǎng)一周的電鏡圖；

圖4是應(yīng)用實(shí)施例3中細(xì)胞培養(yǎng)一周的電鏡圖；

圖5是應(yīng)用實(shí)施例4中細(xì)胞培養(yǎng)一周的電鏡圖；

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這些實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋說(shuō)明，并不限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

(1)取普通蓋玻片21個(gè)，蒸餾水浸泡沖洗后，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；

(2)分別稱取玉米醇溶蛋白0.2598g，聚乳酸0.1019g，并分別溶于1ml六氟異丙醇(25℃，密度為1.596g/ml)中，作為殼層和核層溶液，并在核層溶液中加入100μl含有12μg的rhBMP-2水溶液(含有1％BSA的無(wú)菌水，用來(lái)穩(wěn)定rhBMP-2，保證其活性)，室溫下磁力攪拌4h；

(3)進(jìn)行靜電紡絲前對(duì)靜電紡絲裝置進(jìn)行紫外滅菌2h，紡絲過(guò)程中開(kāi)啟紫外燈，減少紡絲過(guò)程中的污染；

(4)調(diào)節(jié)靜電紡絲工藝參數(shù)分別為：紡絲電壓為15KV，紡絲距離為12cm，紡絲速率殼層和核層分別為0.8ml/h和0.6ml/h；

(5)靜電紡絲20min后，將步驟(1)所述的蓋玻片固定在已紡得的納米纖維膜上,再繼續(xù)紡絲40min后結(jié)束；

(6)從接收裝置上取下紡絲物，切割整形后在溫度為37℃，真空度為0.09MPa的真空干燥箱內(nèi)干燥一周，即獲得以蓋玻片為基板，其外圍包裹有同軸殼核層纖維膜的載藥細(xì)胞爬片。所制細(xì)胞爬片外觀照片如圖1所示，微觀掃描電鏡圖如圖2所示。

實(shí)施例2

(1)取普通蓋玻片21個(gè)，蒸餾水浸泡沖洗后，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；

(2)分別稱取玉米醇溶蛋白0.2598g，聚乳酸0.1019g，并分別溶于1ml六氟異丙醇(25℃，密度為1.596g/ml)中，作為殼層和核層溶液，并在核層溶液中加入100μl含有30μg的rhBMP-2的水溶液，室溫下磁力攪拌4h；

(3)進(jìn)行靜電紡絲前對(duì)靜電紡絲裝置進(jìn)行紫外滅菌2h，紡絲過(guò)程中開(kāi)啟紫外燈，減少紡絲過(guò)程中的污染；

(4)調(diào)節(jié)靜電紡絲工藝參數(shù)分別為：紡絲電壓為15KV，紡絲距離為12cm，紡絲速率殼層和核層分別為0.8ml/h和0.6ml/h；

(5)靜電紡絲20min后，將步驟(1)所述的蓋玻片固定在已紡得的納米纖維膜上,再繼續(xù)紡絲40min后結(jié)束；

(6)從接收裝置上取下紡絲物，切割整形后在溫度為37℃，真空度為0.09MPa的真空干燥箱內(nèi)干燥一周，即獲得以蓋玻片為基板，其外圍包裹有同軸殼核層纖維膜的載藥細(xì)胞爬片。

實(shí)施例3

(1)取普通蓋玻片21個(gè)，蒸餾水浸泡沖洗后，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；

(2)分別稱取玉米醇溶蛋白0.2598g，聚乳酸0.1019g，并分別溶于1ml六氟異丙醇(25℃，密度為1.596g/ml)中，作為殼層和核層溶液，并在殼層溶液中加入玉米醇溶蛋白質(zhì)量的5％的DEX，室溫下磁力攪拌4h；

(3)進(jìn)行靜電紡絲前對(duì)靜電紡絲裝置進(jìn)行紫外滅菌2h，紡絲過(guò)程中開(kāi)啟紫外燈，減少紡絲過(guò)程中的污染；

(4)調(diào)節(jié)靜電紡絲工藝參數(shù)分別為：紡絲電壓為15KV，紡絲距離為12cm，紡絲速率殼層和核層分別為0.8ml/h和0.6ml/h；

(5)靜電紡絲20min后，將步驟(1)所述的蓋玻片固定在已紡得的納米纖維膜上,再繼續(xù)紡絲40min后結(jié)束；

(6)從接收裝置上取下紡絲物，切割整形后在溫度為37℃，真空度為0.09MPa的真空干燥箱內(nèi)干燥一周，即獲得以蓋玻片為基板，其外圍包裹有同軸殼核層纖維膜的載藥細(xì)胞爬片。

實(shí)施例4

(1)取普通蓋玻片21個(gè)，蒸餾水浸泡沖洗后，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；

(2)分別稱取玉米醇溶蛋白0.2598g，聚乳酸0.1019g，并分別溶于1ml六氟異丙醇(25℃，密度為1.596g/ml)中，作為殼層和核層溶液，并在殼層溶液中加入玉米醇溶蛋白質(zhì)量的5％的地塞米松(DEX)，核層溶液中加入100μl含有30μg的rhBMP-2的水溶液，室溫下磁力攪拌4h；

(3)進(jìn)行靜電紡絲前對(duì)靜電紡絲裝置進(jìn)行紫外滅菌2h，紡絲過(guò)程中開(kāi)啟紫外燈，減少紡絲過(guò)程中的污染；

(4)調(diào)節(jié)靜電紡絲工藝參數(shù)分別為：紡絲電壓為15KV，紡絲距離為12cm，紡絲速率殼層和核層分別為0.8ml/h和0.6ml/h；

(5)靜電紡絲20min后，將步驟(1)所述的蓋玻片固定在已紡得的納米纖維膜上,再繼續(xù)紡絲40min后結(jié)束；

(6)從接收裝置上取下紡絲物，切割整形后在溫度為37℃，真空度為0.09MPa的真空干燥箱內(nèi)干燥一周，即獲得以蓋玻片為基板，其外圍包裹有同軸殼核層纖維膜的載藥細(xì)胞爬片。

應(yīng)用實(shí)施例

對(duì)細(xì)胞爬片上的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.原料：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、實(shí)施例1、3、4中所得的細(xì)胞爬片

2.方法：分別取實(shí)施例1、3、4中的細(xì)胞爬片，放入紫外光下照射2h消毒，然后在無(wú)菌的條件下放置在24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，懸垂滴入1ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞密度為2×10⁴個(gè)/ml的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)一周細(xì)胞培養(yǎng)后，用戊二醛固定，并用乙醇梯度脫水干燥之后，使用掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞爬片上大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。

3.結(jié)果：圖3顯示為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在實(shí)施例1制得的細(xì)胞爬片上的生長(zhǎng)一周的形態(tài)，觀察可得，細(xì)胞在細(xì)胞爬片的納米纖維膜上粘附，細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，呈長(zhǎng)梭形、圓球形、扁平型等多種形態(tài)，證明其細(xì)胞培養(yǎng)效果優(yōu)良。

圖4顯示為對(duì)實(shí)施例3中的細(xì)胞爬片進(jìn)行大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)一周后的形態(tài)可得，細(xì)胞粘附在蓋玻片周圍的纖維膜上，細(xì)胞部分呈長(zhǎng)梭形，部分扁平型，證明載入的藥物起到了促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的優(yōu)良結(jié)果。

圖5顯示為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在實(shí)施例4制得的細(xì)胞爬片上生長(zhǎng)一周的形態(tài)，觀察可得，細(xì)胞在納米纖維膜上粘附，長(zhǎng)勢(shì)良好，多呈現(xiàn)扁平型，證明載入的DEX和rhBMP-2對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了作用。