本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物質(zhì)能源技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用玉米秸稈水解液耦合合成氣發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法。

背景技術(shù)：

我國的生物質(zhì)資源十分豐富，玉米秸稈作為我國第一大秸稈資源，年產(chǎn)量超過2億噸，約占總秸稈資源的35%，主要成分為木質(zhì)纖維素，經(jīng)酸或酶水解后可以產(chǎn)生低聚糖、戊糖和己糖等，是一種優(yōu)良的生物質(zhì)資源。露天焚燒或者作為生活燃料燃燒是目前秸稈的主要處理方式，既浪費了資源又對環(huán)境造成了污染。隨著能源危機(jī)和環(huán)境污染等問題的日益嚴(yán)重，生物質(zhì)能源以其清潔和可再生的特性受到廣泛的關(guān)注，以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇已成為當(dāng)前領(lǐng)域的熱點。

與乙醇相比，丁醇無論是在能量密度還是與汽油的配伍性上都具有明顯的優(yōu)勢，是一種優(yōu)良的生物質(zhì)燃料。目前的生產(chǎn)方法主要有化工合成法和生物發(fā)酵法。然而隨著化石能源的枯竭，化工合成法在可持續(xù)性上受到很大的限制。而傳統(tǒng)的丙酮丁醇發(fā)酵法副產(chǎn)物較多，底物轉(zhuǎn)化率低，并且原料來源主要是玉米和糖蜜，成本較高。探索一條新的丁醇生產(chǎn)途徑具有十分重要的意義。

合成氣來源于煤、石油、生物質(zhì)和有機(jī)廢物的氣化，其主要成份為 CO、Ｈ₂ 和 CO₂，還含有少量甲烷和硫氮化合物，可通過厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化為甲烷、乙醇、乙酸、丁醇和丁酸等燃料和化學(xué)品，來源廣泛且價格低廉。生物質(zhì)的氣化過程可以消除不同原料間的化學(xué)差異性，一些有毒物質(zhì)和難以降解的有機(jī)物也可以被利用，可以直接越過傳統(tǒng)生物轉(zhuǎn)化過程中木質(zhì)素難以充分利用的障礙，因此合成氣厭氧發(fā)酵技術(shù)被認(rèn)為是一項極具潛力和競爭力的技術(shù)。目前合成氣的研究主要集中在制乙醇和丁醇上，將有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)醇的研究也越來越多。本發(fā)明利用混合菌發(fā)酵的技術(shù)，研究了以玉米秸稈水解液為原料耦合合成氣發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種利用玉米秸稈水解液耦合合成氣發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其材料來源廣泛，副產(chǎn)物少，不僅實現(xiàn)了資源的合理利用，而且減少了環(huán)境污染，同時也為丁醇的生產(chǎn)提供了一條新途徑。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種利用玉米秸稈水解液耦合合成氣發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其以玉米秸稈水解液為原料，首先利用酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum ATCC25755）進(jìn)行丁酸發(fā)酵，然后接種能夠轉(zhuǎn)化有機(jī)酸為對應(yīng)醇的菌株Clostridium ljungdahlii ATCC 55380并通入合成氣進(jìn)行丁醇發(fā)酵；具體包括如下步驟：

（1）玉米秸稈水解液制備：將玉米秸稈與1wt%的稀硫酸按固液比1g：7－9ml的比例混合均勻，121℃滅菌處理1－2h，調(diào)節(jié)pH至4.7－4.9后加入纖維素酶和木聚糖酶進(jìn)行酶解糖化，獲得玉米秸稈水解液；

（2）玉米秸稈水解液脫毒：將D301陰離子交換樹脂置于三角瓶中，然后加入步驟（1）制備所得的玉米秸稈水解液進(jìn)行搖床震蕩處理，處理結(jié)束后過濾，取濾液備用；

（3）菌種活化：將酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755、菌株Clostridium ljungdahlii ATCC 55380分別接種到液體活化培養(yǎng)基中，37℃厭氧靜置培養(yǎng)1.5－2天，獲得酪丁酸梭菌種子液、菌株Clostridium ljungdahlii種子液；

（4）丁酸發(fā)酵：向步驟（2）所得濾液中添加發(fā)酵培養(yǎng)基，然后接種酪丁酸梭菌種子液于37℃厭氧培養(yǎng)60－72h，獲得丁酸發(fā)酵后的水解液；

（5）合成氣丁醇發(fā)酵：以步驟（4）所得丁酸發(fā)酵后的水解液為基質(zhì)，加入儲備液和維生素溶液，然后接種菌株Clostridium ljungdahlii種子液，最后通入合成氣于37℃厭氧培養(yǎng)5－6天即得。

具體的，步驟（1）中，纖維素酶的用量為15－20U/g秸稈，木聚糖酶的用量為200－220U/g秸稈；酶解糖化的條件為48℃、120rpm－150 rpm搖床振蕩48－60h。

步驟（2）具體為：將100g D301陰離子交換樹脂置于500ml三角瓶中，然后加入300ml步驟（1）制備所得的玉米秸稈水解液，在搖床中于28－32℃、120rpm震蕩處理1－1.5h后過濾。

步驟（3）中，酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755使用的液體活化培養(yǎng)基組成為：30g/ L葡萄糖，5g/ L酵母膏，5g/L蛋白胨，6g/L NaC1，3g/L ( NH₄)₂·SO₄，1.5 g/L K₂HPO₄，0.6g/L MgSO₄·7H₂O，0.03 g/L FeSO₄·7H₂O，0.3 g/L L-鹽酸半胱氨酸，0.5mg/L刃天青（用作無氧指示劑），pH6.0。

步驟（3）中，菌株Clostridium ljungdahlii ATCC 55380使用的活化培養(yǎng)基組成為：0.80g/L NaC1，1.0g/L NH₄C1，0.10g/L KCl，0.2g/L MgSO₄·7H₂O，0.04g CaCl₂，0.2g/L KH₂PO₄，1.0g/L NaHCO₃，1.0g/L酵母膏，5.0g/L MES（2-嗎啉乙磺酸），5.0g/L木糖，0.4g/L L-鹽酸半胱氨酸，10 ml/L微量金屬元素溶液，10 ml/L維生素溶液，0.5mg/L刃天青（用作無氧指示劑），pH5.80；其中，

微量金屬元素溶液的配方如下：2.0g/L氨三乙酸，1g/L硫酸錳，0.8g/L硫酸亞鐵銨，0.2g/L氯化鈷，0.2g/L硫酸鋅，0.02g/L氯化銅，0.02g/L氯化鎳，0.02g/L鉬酸鈉，0.02g/L硒酸銨，0.02g/L鎢酸鈉；

維生素溶液的配方如下：10mg/L維生素B6，5 mg/L硫胺素，5 mg/L維生素B2，5 mg/L泛酸鈣，5mg/L硫辛酸，5mg/L對氨基苯甲酸，5 mg/L煙堿酸，5mg/L維生素B12，2mg/L生物素，2mg/L葉酸。

上述的活化培養(yǎng)基均經(jīng)過沸水浴煮沸除氧，添加刃天青脫氧至瓶內(nèi)由粉色轉(zhuǎn)為無色，121℃滅菌20min。接種前添加維生素溶液（經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾）。酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum的接種量為5%，菌株Clostridium ljungdahlii的接種量為10%，接種操作均在厭氧培養(yǎng)箱中完成，培養(yǎng)條件均為37℃厭氧靜置培養(yǎng)。

步驟（4）中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：5g/ L 酵母膏，5g/ L蛋白胨，6g/L NaC1，3g/L ( NH₄)₂·SO₄，1.5 g/L K₂HPO₄，0.6g/L MgSO₄·7H₂O，0.03 g/L FeSO₄·7H₂O，0.5mg/L刃天青，pH用10mol/L NaOH溶液調(diào)至6.0。步驟（4）制備所得丁酸發(fā)酵后的水解液分裝至250ml厭氧瓶，裝液量20ml。酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum的接種量為5%。

步驟（5）具體為：向步驟（4）所得丁酸發(fā)酵后的水解液中添加60ml 儲備液和0.8 ml維生素溶液，然后接種10%菌株Clostridium ljungdahlii種子液，通入200ml合成氣，于37℃、150rpm厭氧培養(yǎng)5－6天，每天補加100ml合成氣；

所述合成氣中各原料氣的體積百分比為：CO 60%、Ｈ₂ 35%和CO₂ 5%；

所述儲備液配方如下：1L儲備液中含有20g MES，10ml微量金屬元素溶液，0.2g L-鹽酸半胱氨酸，pH用10mol/L NaOH溶液調(diào)至7.0，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾；其中，

微量金屬元素溶液的配方如下：2.0g/L氨三乙酸，1g/L硫酸錳，0.8g/L硫酸亞鐵銨，0.2g/L氯化鈷，0.2g/L硫酸鋅，0.02g/L氯化銅，0.02g/L氯化鎳，0.02g/L鉬酸鈉，0.02g/L硒酸銨，0.02g/L鎢酸鈉；

所述維生素溶液的配方如下：10mg/L維生素B6，5 mg/L硫胺素，5 mg/L維生素B2，5 mg/L泛酸鈣，5mg/L硫辛酸，5mg/L對氨基苯甲酸，5 mg/L煙堿酸，5mg/L維生素B12，2mg/L生物素，2mg/L葉酸。

和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明使用的菌種酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum ATCC25755）和菌株Clostridium ljungdahlii ATCC 55380 均為普通市售產(chǎn)品。酪丁酸梭菌可以同時利用木糖和葡糖糖在厭氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，Clostridium ljungdahlii 是一種目前研究的較多的合成氣乙醇發(fā)酵菌株，并且在合成氣發(fā)酵過程中能夠?qū)⒍∷徂D(zhuǎn)化為丁醇。本發(fā)明方法以稀硫酸預(yù)處理的玉米秸稈為原料，通過添加纖維素酶和木聚糖酶對玉米秸稈進(jìn)行酶解糖化獲得玉米秸稈水解液，然后再以玉米秸稈水解液為原料，首先利用酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum ATCC25755進(jìn)行丁酸發(fā)酵，然后接種能夠轉(zhuǎn)化有機(jī)酸為對應(yīng)醇的菌株Clostridium ljungdahlii ATCC 55380并通入合成氣實現(xiàn)了發(fā)酵生產(chǎn)丁醇。本發(fā)明方法中所用材料來源廣泛、副產(chǎn)物少，不僅實現(xiàn)了農(nóng)業(yè)廢棄物資源的合理利用，而且減少了環(huán)境污染，同時也為丁醇的生產(chǎn)提供了一條新途徑。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。

下述實施例中，所使用菌種酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricumATCC25755）和菌株Clostridium ljungdahlii ATCC 55380均購自美國菌種保藏中心（ATCC）。

實施例1

一種利用玉米秸稈水解液耦合合成氣發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，具體步驟如下：

1）玉米秸稈水解液的制備

稱取玉米秸稈15g置于300mL三角瓶中，添加120 mL 質(zhì)量濃度1%的稀硫酸（w/v=1:8），混合攪拌均勻并于121℃滅菌處理60 min。冷卻至室溫后用10mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值為4.8，按15U/g玉米秸稈、200U/g玉米秸稈的用量添加纖維素酶和木聚糖酶，于48℃、120 rpm搖床振蕩48h用以進(jìn)行酶解糖化。結(jié)束后用布氏漏斗過濾，除去未糖化的秸稈殘渣，獲得玉米秸稈水解液。

2）玉米秸稈水解液脫毒

在500ml三角瓶中加入100g D301陰離子交換樹脂，然后加入300ml步驟（1）制備所得的玉米秸稈水解液，在搖床中于30℃、120rpm震蕩處理1h，處理結(jié)束后過濾，取濾液備用。

3）菌種活化

將酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755、菌株Clostridium ljungdahlii ATCC 55380分別接種到液體活化培養(yǎng)基中，37℃厭氧靜置培養(yǎng)2天，獲得酪丁酸梭菌種子液、菌株Clostridium ljungdahlii種子液；其中，

酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755使用的液體活化培養(yǎng)基組成為：30g/ L葡萄糖，5g/ L酵母膏，5g/L蛋白胨，6g/L NaC1，3g/L ( NH₄)₂·SO₄，1.5 g/L K₂HPO₄，0.6g/L MgSO₄·7H₂O，0.03 g/L FeSO₄·7H₂O，0.3 g/L L-鹽酸半胱氨酸，0.5mg/L刃天青（用作無氧指示劑），pH6.0；

菌株Clostridium ljungdahlii ATCC 55380使用的活化培養(yǎng)基組成為：0.80g/L NaC1，1.0g/L NH₄C1，0.10g/L KCl，0.2g/L MgSO₄·7H₂O，0.04g CaCl₂，0.2g/L KH₂PO₄，1.0g/L NaHCO₃，1.0g/L酵母膏，5.0g/L MES（2-嗎啉乙磺酸），5.0g/L木糖，0.4g/L L-鹽酸半胱氨酸，10 ml/L微量金屬元素溶液，10 ml/L維生素溶液，0.5mg/L刃天青（用作無氧指示劑），pH5.80；其中，

微量金屬元素溶液的配方如下：2.0g/L氨三乙酸，1g/L硫酸錳，0.8g/L硫酸亞鐵銨，0.2g/L氯化鈷，0.2g/L硫酸鋅，0.02g/L氯化銅，0.02g/L氯化鎳，0.02g/L鉬酸鈉，0.02g/L硒酸銨，0.02g/L鎢酸鈉；

維生素溶液的配方如下：10mg/L維生素B6，5 mg/L硫胺素，5 mg/L維生素B2，5 mg/L泛酸鈣，5mg/L硫辛酸，5mg/L對氨基苯甲酸，5 mg/L煙堿酸，5mg/L維生素B12，2mg/L生物素，2mg/L葉酸。

上述的活化培養(yǎng)基均經(jīng)過沸水浴煮沸除氧，添加0.5mg/L刃天青脫氧至瓶內(nèi)由粉色轉(zhuǎn)為無色，121℃滅菌20min。接種前添加維生素溶液（經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾）。酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum的接種量為5%，菌株Clostridium ljungdahlii的接種量為10%，接種操作均在厭氧培養(yǎng)箱中完成，培養(yǎng)條件均為37℃厭氧靜置培養(yǎng)。

（4）丁酸發(fā)酵：

向步驟（2）所得濾液中添加發(fā)酵培養(yǎng)基，然后接種酪丁酸梭菌種子液于37℃厭氧培養(yǎng)72h，獲得丁酸發(fā)酵后的水解液并測定丁酸含量；制備所得丁酸發(fā)酵后的水解液分裝至250ml厭氧瓶，裝液量20ml；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：5g/ L 酵母膏，5g/ L蛋白胨，6g/L NaC1，3g/L ( NH₄)₂·SO₄，1.5 g/L K₂HPO₄，0.6g/L MgSO₄·7H₂O，0.03 g/L FeSO₄·7H₂O，0.5mg/L刃天青，pH用10mol/L NaOH溶液調(diào)至6.0。酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum的接種量為5%。

（5）合成氣丁醇發(fā)酵：

步驟（5）具體為：向步驟（4）所得丁酸發(fā)酵后的水解液中添加60ml 儲備液和0.8ml維生素溶液，然后接種10%菌株Clostridium ljungdahlii種子液，通入200ml合成氣，于37℃、150rpm厭氧培養(yǎng)6天，每天補加100ml合成氣，測定丁醇含量。

所述合成氣中各原料氣的體積百分比為：CO 60%、Ｈ₂ 35%和CO₂ 5%；

所述儲備液（stock solution）配方如下：1L儲備液中含有20g MES，10ml微量金屬元素溶液，0.2g L-鹽酸半胱氨酸，pH用10mol/L NaOH溶液調(diào)至7.0，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾；其中，

微量金屬元素溶液的配方如下：2.0g/L氨三乙酸，1g/L硫酸錳，0.8g/L硫酸亞鐵銨，0.2g/L氯化鈷，0.2g/L硫酸鋅，0.02g/L氯化銅，0.02g/L氯化鎳，0.02g/L鉬酸鈉，0.02g/L硒酸銨，0.02g/L鎢酸鈉；

所述維生素溶液的配方如下：10mg/L維生素B6，5 mg/L硫胺素，5 mg/L維生素B2，5 mg/L泛酸鈣，5mg/L硫辛酸，5mg/L對氨基苯甲酸，5 mg/L煙堿酸，5mg/L維生素B12，2mg/L生物素，2mg/L葉酸。

試驗結(jié)果：

步驟（4）丁酸發(fā)酵后的水解液中丁酸濃度為66.6 mmol/L。添加儲備液和維生素溶液后稀釋為16.7 mmol/L，經(jīng)合成氣丁醇發(fā)酵后丁醇產(chǎn)量為8.2 mmol/L，轉(zhuǎn)化率為49.1%。由此可見：本發(fā)明以玉米秸稈水解液為原料耦合合成氣發(fā)酵生產(chǎn)丁醇在技術(shù)上是完全可行的，是一種生產(chǎn)丁醇的新途徑。