背景技術：

多環(huán)芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons,pahs)是廣泛存在于河道底泥沉積物中的一類典型持久性有機污染物(pops)，具有致癌、致畸變和致突變作用，是世界各國優(yōu)先控制的一類污染物。其中，四環(huán)以上的pahs被稱為高分子量多環(huán)芳烴(h-pahs)，h-pahs具有更強的毒性和難降解性，是治理pahs污染的重點和難點。大量研究表明，熒蒽是河道底泥中最常見的h-pahs類污染物，據(jù)有較高的檢出頻率和豐度。為此，實現(xiàn)河道底泥中熒蒽的有效去除對于治理河道底泥中h-pahs污染具有重要借鑒意義。

微生物修復技術是在人為優(yōu)化的條件下，利用微生物的生命代謝活動，來分解土壤或沉積物中的污染物，以修復受污染的環(huán)境。微生物修復中可以用來接種的微生物從其來源可分為土著微生物、外來微生物和基因工程菌；從微生物種類類型可分為細菌和真菌。目前已從土壤中分離到的能降解pahs的微生物有假單胞菌屬、黃桿菌屬、諾卡氏菌屬、弧菌屬、解環(huán)菌屬等，但是并沒有針對河道底泥中pahs污染的高效降解菌。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明目的在于提供一種篩選自河道底泥中的熒蒽高效降解菌及其應用。

本發(fā)明提供的一種熒蒽降解菌，該真菌為青霉菌屬(penicilliumpurpurogenumsp.)dtq-hk1。

本發(fā)明提高的產(chǎn)紫青霉菌屬(penicilliumpurpurogenumsp.)dtq-hk1已于2016年11月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏編號為：cgmccno.13181。

本發(fā)明提供的penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的形態(tài)特征如下：菌株在lb固體培養(yǎng)基上于28℃下恒溫培養(yǎng)先呈淡黃色后期呈灰綠色的毛絮狀菌落，背面呈淡黃色，直徑約為2-3mm，顯微鏡下和掃面電鏡可觀察到菌株有菌絲，頭部有1μm左右圓形孢子結構。

本發(fā)明提供的penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1從受熒蒽污染的河道底泥中篩選分離而來。

本發(fā)明的penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1作為菌劑應用于受熒蒽污染的河道底泥中。

本發(fā)明的有益效果在于：penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的篩選分離方法簡單，分離出的penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1能夠有效降解熒蒽，有利于修復熒蒽污染的河道底泥。

附圖說明

圖1(a)penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1培養(yǎng)基上菌落形態(tài)圖；

圖1(b)penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1顯微鏡下菌種形態(tài)圖；

圖1(c)penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1掃描電鏡下菌種形態(tài)圖；

圖2是penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的系統(tǒng)發(fā)育樹；

圖3是penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的生長曲線；

圖4是penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1在熒蒽-無機鹽培養(yǎng)液中的對熒蒽的降解效率圖；

圖5是penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1投加到熒蒽污染底泥中在菖蒲及麥芽糖共同作用下對熒蒽的降解效果圖。

具體實施方式

實施例1熒蒽高效降解菌的篩選及鑒定

取實驗待測底泥進行熒蒽降解菌的分離培養(yǎng)。首先，取5g底泥接種于50ml含熒蒽的msm培養(yǎng)基中，在120rpm搖床避光條件下室溫培養(yǎng)兩周，移取1ml土壤富集液于新的含熒蒽的無菌msm培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周后重復稀釋，進行連續(xù)四階段的馴化富集培養(yǎng)過程。培養(yǎng)結束后，用接種環(huán)取菌液在含有熒蒽的lb固體培養(yǎng)基上進行劃線分離，室溫下恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d，挑取不同形態(tài)的成型菌落分別接種到新的lb固體培養(yǎng)基上進行純化，重復劃線分離，直至固體培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)一致。將生長速度較快的純化菌種接種到含有熒蒽的msm培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，并在顯微鏡和掃描電鏡下對菌種形態(tài)進行觀察，結果如圖1(a)(b)(c)所示。

其中無機鹽培養(yǎng)基(msm培養(yǎng)基)的配制方法如下：稱取硫酸銨1g，磷酸二氫鉀0.8g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鎂0.05g，氯化鈣0.05g，氯化鐵0.01g，氯化鈉5g溶于1l超純水，用naoh調節(jié)ph至7.0±0.5，于121℃濕式高壓滅菌20min。

菌株的鑒定：

首先取5ml純菌培養(yǎng)液，經(jīng)10000rpm離心，棄去上清液，加入200μl緩沖液ga混懸菌落，加入20μlproteinasek溶液混勻，完成菌株dna的提取過程。然后以提取到的菌株dna為模板，進行pcr擴增及測序。pcr儀選用的是abi272。采用通用引物itsl(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)，pcr反應體系為：2xtaqmix10μl，primerf(20pm)1μl，primerr(20pm)1μl，template1μl，滅菌蒸餾水定容至20μl。菌株icdp1進行pcr擴增16srdna序，pcr反應條件為:94℃預變性4min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35次循環(huán)，72℃延伸10min，于4℃下保存。菌株dtq-hk1進行pcr擴增its序，pcr反應條件為：94℃預變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，此過程進行35次循環(huán)。最后72℃延伸10min，置于4℃條件下保存。利用引物對菌株進行pcr擴增its得到目的dna片段，得到的基因序列如下表seqid所示。

對得到的基因序列進行分析，測序結果在ncbi網(wǎng)站上用blast程序進行分析，與genbank中核酸序列進行序列同源性比較。結果顯示菌株dtq-hk1的its基因序列與多種penicilliumsp.(青霉菌屬)具有高度同源性。從genbank基因數(shù)據(jù)庫中下載與菌株dtq-hk1序列相似性大于97％的及部分模式菌種的基因序列，通過clustalx軟件進行聚類分析后，利用mega5.0軟件以neighbor-joining計算方式生成系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。從圖2可以看出，菌株dtq-hk1與penicilliumsp.有99％的同源性，可以確定菌株dtq-hk1為青霉菌屬，并且在青霉菌屬中與penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1有99％的同源性。因此可以認定該菌株為penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1。

實施例2熒蒽的降解實驗

在得到penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1后，對penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的生長曲線進行測定，在無菌條件下分別在培養(yǎng)的第1,3,5,7,14,21,35,42d對體系中脂磷的含量進行測定，得到菌種penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的生長曲線如圖3。由菌種生長曲線可以發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)初期微生物生長速率較快，而在培養(yǎng)21d后，菌種生長速度明顯下降，在培養(yǎng)35d后菌種進入衰亡期，生物量呈下降趨勢。

在對菌種penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的生長曲線進行測定后，進一步研究菌種penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1對熒蒽的降解效果。首先，移取2ml培養(yǎng)7d后od600＝1的penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1菌株至50ml熒蒽濃度為50mg/l的msm培養(yǎng)基中，于28℃恒溫條件下避光振蕩培養(yǎng)42d，每隔7d取樣一次測定其中熒蒽的含量，做三組平行試驗，并設空白對照組。得到的熒蒽降解率隨時間變化的曲線如圖4所示，從圖4可以看出經(jīng)過42d的培養(yǎng)，培養(yǎng)基內熒蒽濃度由50mg·l^-1降至23.89mg·l^-1，penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1對熒蒽的降解率可以達到52.22％，同時，可以看出在培養(yǎng)前21d菌種對熒蒽降解率提高比較快，21d后菌種對熒蒽的降解率趨于平緩，降解效果變化不明顯。

其中熒蒽提取測定方法：取50ml待測樣品于250ml的分液漏斗中，分三次向其中加入50ml的乙酸乙酯，每次震蕩3min，收集三次萃取提取液，過無水硫酸鈉去除水分后旋轉蒸發(fā)濃縮至2ml左右，加入20ml甲醇(不能用一定量這樣不確定的詞語，要有具體數(shù)量或寫明到達的要求)進行溶劑替換后于50ml容量瓶定容，取1.5ml溶液于樣品瓶中hplc測定。hplc工作條件：色譜柱為venusilmpc18(150mm*4.6mm,5μm)，紫外檢測器，檢測波長324nm，柱溫30℃，流動相為甲醇，流速1ml·min^-1，進樣量為20μl。

實施例3熒蒽高效降解菌對污染底泥的修復實驗

試驗底泥的獲取過程如下：取天津工業(yè)大學泮湖表層沉積物(0-10cm)，剔除底泥內的碎石、植物殘體等雜物，在陰涼處風干，取風干土樣研磨過10目篩子，并測定其中熒蒽含量為0.97mg/kg(干土)。由于泥樣中熒蒽含量較低，為了試驗觀察向土樣中投加熒蒽，使底泥中熒蒽濃度最終為100mg/kg(干土)。投加方法：先稱取一定量風干土樣研磨過100目篩后平鋪于搪瓷盤內，稱取準確投加量的熒蒽用二氯甲烷溶解后轉移到有土樣的搪瓷盤內，在通風櫥中用玻璃棒不斷攪拌，使熒蒽在土樣中分布均勻，待二氯甲烷完全揮發(fā)后，把染熒蒽的干土樣緩慢加入到濕樣中，并將濕樣攪拌均勻，暗處熟化一周備用。

采用實驗室盆栽方式，將處理好的底泥干樣裝入2l塑料量杯中，加水使泥上保有3～5cm水層，以模擬河道底泥天然狀態(tài)。在底泥中種植菖蒲并投加penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1和麥芽糖，實驗培養(yǎng)期為3個月，每15d取樣一次測定體系中熒蒽的含量。結果如圖5所示，可以看出在菖蒲根系投加40mlod600＝2的penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1和90mg麥芽糖培養(yǎng)3個月后后，菖蒲-penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1-麥芽糖共同作用體系對熒蒽的去除效果可達到100％。

其中熒蒽提取方法如下：首先采集泥樣在陰涼處風干后用研缽將干土磨碎，過80目篩子后每份稱取5.00g過篩干泥樣，取上述處理好的干泥樣于離心管中，向其中投加20ml二氯甲烷：正己烷(v:v＝1:1)后，放置于超聲儀中超聲30min，再取離心管放置到離心機中2000rpm離心3min，收集上清液于平底燒瓶中，上述過程重復三次。將三次收集到的上清液進行濃縮凈化定容后，hplc測定其中熒蒽的含量。

seqidno:1

penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的its基因序列：

tctcgcggccacctcccacccttgtctctatacacctgttgctttggcgggcccaccggggccacctggtcgccgggggacgcacgtccccgggcccgcgcccgccgaagcgctctgcgaaccctgatgaagatgggctgtctgagtacgatgaaaattgtcaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattccgtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccctggcattccggggggcatgcctgtccgagcgtcatttctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggtgtggtccccccggggacctgcccgaaaggcagcggcgacgtccgtctggtcctcgagcgcatggggctctgtcactcgctcgggaaggacctgcgggggttggtcaccaccaca

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penicilliumpurpurogenumstraindtq-hk1的its基因序列：

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引物

itsl(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)

its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)