專利名稱：有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)，具體涉及一株可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的細(xì)菌菌株(Pseudomonas sp.WBC-3)，還涉及一種有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的制備方法。
我國(guó)是高毒農(nóng)藥生產(chǎn)大國(guó)，其中有機(jī)磷農(nóng)藥約占整個(gè)農(nóng)藥的57％。對(duì)硫磷一類的有機(jī)磷農(nóng)藥被大量用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與害蟲防治，但其殘毒會(huì)造成環(huán)境與食品的嚴(yán)重污染，并產(chǎn)生大量的殺蟲劑廢物，嚴(yán)重影響了人們的身體健康及農(nóng)產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯，引起越來(lái)越多的社會(huì)的廣泛關(guān)注。一方面，國(guó)家石化局和農(nóng)業(yè)部制訂出中國(guó)農(nóng)藥工業(yè)“十五”發(fā)展規(guī)劃，要求在“十五”期間，削減生產(chǎn)高毒有機(jī)磷殺蟲劑，同時(shí)大力開(kāi)發(fā)新型高效低毒替代產(chǎn)品；另一方面，針對(duì)目前該類農(nóng)藥的大量使用對(duì)人類造成的影響，如何有效地處理，避免殘藥對(duì)環(huán)境及人類的損害，成為人們亟待解決的問(wèn)題。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，傳統(tǒng)的處理有機(jī)磷農(nóng)藥殘留主要采取化學(xué)法(40℃時(shí)以0.1N的NaOH處理)或焚燒、掩埋的方法，這些方法的副作用大，往往造成環(huán)境的二次污染，并且作用很慢。
曾有文獻(xiàn)報(bào)道了微生物處理有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。多株微生物可以共代謝的方式礦化對(duì)硫磷，即一株菌將對(duì)硫磷降解成對(duì)硝基苯酚后再由其他菌株進(jìn)行徹底的分解。但至今尚未有一株菌進(jìn)行對(duì)硫磷有機(jī)磷農(nóng)藥徹底降解的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是提供一種有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌，利用該菌能完全降解對(duì)硫磷和甲基對(duì)硫磷，并能降解其他多種農(nóng)藥，可用于治理有機(jī)磷類農(nóng)藥及部分芳烴類化合物引起的環(huán)境污染與食品污染。
本發(fā)明另一目的是提供一種方法易行、操作方便的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的制備方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明敘述如下本發(fā)明所提供的典型微生物是假單胞菌屬的一株命名為WBC-3的菌株(Pseudomonas sp.WBC-3，CCTCC No.M201027)。該菌種的主要特征為菌體呈短桿狀，極生單鞭毛，革蘭氏染色陰性，氧化葡萄糖產(chǎn)酸、硝酸鹽還原及V.P.反應(yīng)陰性，過(guò)氧化氫酶和氧化酶測(cè)定陽(yáng)性。豐富培養(yǎng)基上菌落白色，光滑，邊緣整齊。能以對(duì)硝基苯酚(PNP)或?qū)α蛄鬃鑫ㄒ惶嫉瓷L(zhǎng)，在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(外加PNP濃度為100ppm-500ppm或外加MPAR濃度為100ppm-800ppm)中、28-32℃搖床培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)很快。在pH6-8、溫度20-40℃范圍內(nèi)均生長(zhǎng)良好；該菌的16S rDNA序列的GenBank編號(hào)為AY040872。
本發(fā)明采用先富集后篩選的方法獲得該菌。其步驟如下1)將含有機(jī)磷農(nóng)藥污染土樣配制成10-30％的菌懸液，菌懸液按5％計(jì)接種于外加甲基對(duì)硫磷0.005％的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)至穩(wěn)定生長(zhǎng)期。培養(yǎng)基為K2HPO40.02％，KH2PO40.08％，MgSO40.02％，CaSO4.2H2O0.01％，NaMoO4.2H2O0.00033％，F(xiàn)eSO4.7H2O0.0005％，(NH4)2SO40.05-0.1％；培養(yǎng)條件為28-32℃.搖床培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)很快，PH6-8.溫度20-40℃范圍內(nèi)均生長(zhǎng)良好。
2)將上述培養(yǎng)菌懸液接入與步驟1)同樣的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以后傳代過(guò)程中外加甲基對(duì)硫磷濃度為0.01-0.08％，逐漸升高，自0.01％逐漸升高至0.08％；3)將上述最終培養(yǎng)菌液用平板稀釋法進(jìn)行分離純化，獲得在上述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)快、菌落規(guī)則、性狀穩(wěn)定的單菌落；4)經(jīng)生理生化鑒定，確定上述菌株是假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，保存于LB斜面，使用前以外加甲基對(duì)硫磷(0.01％-0.08％)的上述培養(yǎng)基進(jìn)行馴化。
本發(fā)明用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可有效地去除有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，與已報(bào)道的降解菌株相比，優(yōu)點(diǎn)在于具有野生菌株的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，篩選菌株降解性能穩(wěn)定，降解酶系豐富，降解底物范圍廣，可徹底降解對(duì)硫磷等有機(jī)磷類農(nóng)藥。對(duì)于保護(hù)環(huán)境，減少農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留，保護(hù)人們的健康具有重要的意義，適合在果蔬去農(nóng)藥毒、環(huán)境污染整治中進(jìn)行推廣應(yīng)用。
實(shí)施例1將斜面菌種接種于含0.06％對(duì)硝基苯酚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，活化至對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)基成分為K2HPO40.02％，KH2PO40.08％，MgSO40.02％，CaSO4.2H2O0.01％，NaMoO4.2H2O0.00033％，F(xiàn)eSO4.7H2O0.0005％，(NH4)2SO40.1％。將所得菌液按4％計(jì)接于含0.005％-0.1％甲基對(duì)硫磷的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)28小時(shí)左右測(cè)其OD600值。同樣以活化好的菌液接種到含0.02％-0.3％的甲基對(duì)硫磷的葡萄糖(濃度為0.1％)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定期測(cè)其OD600值。結(jié)果是該菌對(duì)甲基對(duì)硫磷的耐受濃度很高，在單純無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中可達(dá)到0.08％，在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中可達(dá)到0.2％。該菌對(duì)高濃底物的耐受是降解性能得以實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)。
實(shí)施例2同實(shí)施例1的方法，將0.04％對(duì)硝基苯酚中培養(yǎng)20小時(shí)，活化至對(duì)數(shù)期的菌液，按5％計(jì)接于含0.03％甲基對(duì)硫磷的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每隔一定時(shí)間取樣一次，經(jīng)萃取提純后進(jìn)行氣相色譜分析，測(cè)定培養(yǎng)基中甲基對(duì)硫磷的殘留量。中間產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的濃度則以其在405nm的特征光吸收值來(lái)測(cè)定。結(jié)果是該菌能夠以甲基對(duì)硫磷作為唯一碳源、氮源，將其水解成對(duì)硝基苯酚后再?gòu)氐捉到庾鳛樯L(zhǎng)基質(zhì)。生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)對(duì)底物的消耗最為旺盛，對(duì)于0.03％的甲基對(duì)硫磷在22小時(shí)即可降解完全。
實(shí)施例3將斜面菌種首先接種于含0.004％的2，3-二氯酚、鄰苯二酚或馬拉硫磷的富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基成分為K2HPO40.02％，KH2PO40.08％，MgSO40.02％，CaSO4.2H2O0.01％，NaMoO4.2H2O0.00033％，F(xiàn)eSO4.7H2O0.0005％，(NH4)2SO40.1％，酵母提取物0.02％。24小時(shí)培養(yǎng)至菌體的OD600分別達(dá)到1.5、1.5和0.5時(shí)，取出OD值為0.75的菌量做測(cè)定用的菌膜，以0.001％標(biāo)準(zhǔn)GGA溶液(成分為150ppm葡萄糖和150ppm谷氨酸)加0.001％的二氯酚或馬拉硫磷活化所做菌膜，用活化好的菌膜進(jìn)行呼吸耗氧實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)裝置為文獻(xiàn)(環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，1986，6184-192)所述。某些對(duì)細(xì)胞呼吸代謝有較大毒性的化合物，試驗(yàn)過(guò)程同時(shí)開(kāi)展了以鄰苯二酚、二氯酚、亞胺硫磷、二嗪農(nóng)、殺螟松、馬拉硫磷為唯一碳源的培養(yǎng)試驗(yàn)在0.04％的對(duì)硝基苯酚中活化的菌種以4％接種于5mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(含0.004％底物)中，于30℃振蕩培養(yǎng)，48小時(shí)后測(cè)其OD600的變化。結(jié)果見(jiàn)表1。表1可見(jiàn)該菌對(duì)于某些芳烴衍生物，如2，3-二氯酚、鄰苯二酚、鄰苯二胺、對(duì)苯二酚、馬拉硫磷等有較強(qiáng)的代謝活性；另外，對(duì)于3，4-二氯酚、PNP、二嗪農(nóng)、殺螟松、喹硫磷、辛硫磷、樂(lè)果等也有一定代謝活性。用2，3-二氯酚、鄰苯二酚、馬拉硫磷、二嗪農(nóng)、殺螟松、二嗪農(nóng)、亞胺硫磷等物質(zhì)分別培養(yǎng)WBC-3菌時(shí)也顯示了同樣的結(jié)果，表明該菌是一株可降解多種底物的高效菌株。
表1培養(yǎng)結(jié)果底物BODm 可生化性*(以O(shè)D600表示)甲胺磷 0.390.37+亞胺硫磷0 0.0299 -殺螟松 0.260.0730 +二嗪農(nóng) 0.250.0494 +喹硫磷 0.18 —+辛硫磷 0.15 —+樂(lè)果0.220.15+馬拉硫磷0.510.4906 +2，4，5-T 0 0 -五氯酚鈉0 0 -3，4-二氯酚 0.21 —+2，3-二氯酚 1.521.519 +++對(duì)硝基苯酚(PNP) 0.220.1529 +對(duì)苯二酚0.68 —++鄰苯二酚1.591.492 +++鄰苯二胺0.70 —++*+，表示可生化；++，表示生化性較強(qiáng)；+++，表示生化性很強(qiáng)；-，表示無(wú)生化性
權(quán)利要求
1.一種有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌，其特征在于該微生物是假單胞菌屬Pseudomonas sp.WBC-3菌株，CCTCC NO.M201027；該菌的16S rDNA序列為GenBank Accession No.AY040872。
2.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的制備方法，其步驟是A)將含有有機(jī)磷農(nóng)藥污染土樣配制成菌懸液，懸液按5％計(jì)接種于外加甲基對(duì)硫磷0.005％的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為K2HPO40.02％，KH2PO40.08％，MgSO40.02％，CaSO4.2H2O0.01％，NaMoO4.2H2O0.00033％，F(xiàn)eSO4.7H2O0.0005％，NH4)2SO40.05-0.1％，培養(yǎng)條件為28-32℃搖床培養(yǎng)，PH6-8，溫度20-40℃；B)將上述培養(yǎng)菌懸液接入步驟A)同樣的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以后傳代過(guò)程中外加甲基對(duì)硫磷濃度為0.01％-0.08％C)將上述培養(yǎng)菌液用平板稀釋法進(jìn)行分離純化；D)經(jīng)生理生化鑒定，確定上述菌株是假單胞菌屬Pseudomonassp.，保存于LB斜面，使用前外加甲基對(duì)硫磷的上述培養(yǎng)基進(jìn)行馴化。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌及其制備方法。該微生物是假單胞菌WBC－3菌株,CCTCCNO.M201027,該菌的16SrDNA序列號(hào)為GenBank AccessionNo.AY040872。制備該菌株的步驟是首先將含有有機(jī)磷農(nóng)藥污染土樣配制成菌懸液,懸液接種含甲基對(duì)硫磷的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基;其次是將上述菌懸液接入培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;第三是上述培養(yǎng)菌液用平板稀釋法進(jìn)行分離純化;第四是經(jīng)生理生化鑒定,確定上述菌株是假單胞菌,保存于LB斜面,使用前外加甲基對(duì)硫磷的培養(yǎng)基進(jìn)行馴化。本發(fā)明篩選的菌株降解性能穩(wěn)定,降解酶系豐富,降解底物范圍廣,能完全降解對(duì)硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥,適合在果蔬農(nóng)藥去毒。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1329138SQ01128319
公開(kāi)日2002年1月2日 申請(qǐng)日期2001年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月7日
發(fā)明者張先恩, 陳亞麗, 劉虹, 夏祥明, 王銀善 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所