本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是鑒別紫黑色條紋果皮番茄的CAPS分子標(biāo)記方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

番茄(Solanum lycopersicum)屬于茄科茄屬，是世界第一大蔬菜作物，起源于南美安第斯山脈，在16世紀(jì)左右被西班牙殖民者引入歐洲，經(jīng)過(guò)幾次強(qiáng)烈馴化和改良后成為現(xiàn)代栽培番茄。相較于其他性狀，番茄果肉的顏色的馴化歷程相對(duì)較短，幾乎都是最近100年涌現(xiàn)出來(lái)的?，F(xiàn)有栽培番茄的成熟果實(shí)顏色主要為紅色、黃色和粉色，這是由于果實(shí)中富含番茄紅素和類(lèi)胡蘿卜素等色素的原因。盡管番茄紅素和類(lèi)胡蘿卜素都是對(duì)人體非常有益的天然色素，但這兩類(lèi)色素都屬于脂溶性物質(zhì)，必須通過(guò)正確的烹調(diào)或加工才能被人體良好吸收，對(duì)于食品結(jié)構(gòu)單一的貧困人群發(fā)揮作用比較困難。因此，開(kāi)發(fā)含有其他天然營(yíng)養(yǎng)色素的番茄品種，是番茄育種工作的重要發(fā)展方向。

此前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些野生種番茄，如S.chilense和S.cheesmaniae等，具有深藍(lán)色的果實(shí)，富含花青素。研究表明，花青素作為強(qiáng)抗氧化劑，具有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫力、抵抗突變等功效，且屬于水溶性物質(zhì)，鮮食即可吸收。因此，這些野生種番茄是開(kāi)發(fā)新型番茄品種的重要種質(zhì)資源。目前，美國(guó)俄勒岡州立大學(xué)利用野生藍(lán)色番茄資源，育成紫色番茄OSU Blue等品種，以色列研究者也利用分子生物學(xué)技術(shù)，在番茄染色體上定位了一個(gè)控制花青素含量的顯性基因座用于OSU Blue等品種的育種。2013年，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所在國(guó)內(nèi)首次自主育成紫黑色條紋果皮番茄，并命名為“金陵墨玉”，其成熟果皮性狀與國(guó)外OSU Blue等品種存在顯著差別，呈紫黑色條紋狀?！敖鹆昴瘛被ㄇ嗨睾渴瞧胀ㄔ耘喾训?0倍以上，平均單果重30克，果實(shí)大小均勻，口感風(fēng)味濃郁，高抗病毒病，耐葉霉病，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。經(jīng)過(guò)遺傳分析，“金陵墨玉”的紫黑色果皮性狀為隱性性狀，并非由已知的Aft顯性基因控制。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)與“金陵墨玉”紫黑色果皮性狀連鎖的新型分子標(biāo)記，用于指導(dǎo)育種。

酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列，簡(jiǎn)稱(chēng)CAPS，是一種共顯性分子標(biāo)記，原理是根據(jù)己知位點(diǎn)的DNA序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，利用這些引物擴(kuò)增該位點(diǎn)上的某一特定DNA片段，然后用某種限制性?xún)?nèi)切酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)凝膠電泳分離酶切片段，觀察其多態(tài)性。CAPS技術(shù)實(shí)質(zhì)上是將PCR技術(shù)與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，即RFLP技術(shù)相結(jié)合，因此又被稱(chēng)為PCR-RFLP。本發(fā)明采用CAPS標(biāo)記方法進(jìn)行“金陵墨玉”特異性狀的標(biāo)記及鑒別，通過(guò)人工設(shè)計(jì)的PCR引物，進(jìn)而快速篩選、培育紫黑色條紋果皮番茄——“金陵墨玉”，對(duì)培育富含花青素番茄新品種具有重要的理論及實(shí)踐意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了快速鑒別、育種富含花青素的番茄——金陵墨玉，提供更高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的新品種，本發(fā)明公開(kāi)了鑒別番茄紫黑色果皮性狀連鎖的CAPS標(biāo)記方法及應(yīng)用，可應(yīng)用于番茄品種改良分子輔助育種，在苗期即可進(jìn)行初期篩選，大大縮短育種周期，其技術(shù)方案如下：

鑒別紫黑色條紋果皮番茄的CAPS分子標(biāo)記方法，其特征在于：所述紫黑色條紋果皮番茄所攜帶的分子標(biāo)記位于3號(hào)染色體行，序列為SEQ ID No.1的核苷酸堿基序列，所述紫黑色條紋果皮番茄基因組DNA模板經(jīng)PCR擴(kuò)增，其中紫黑色條紋果皮番茄的擴(kuò)增引物為SEQ ID No.3-4的核苷酸堿基序列，所述SEQ ID No.3-4的核苷酸堿基序列為人工設(shè)計(jì)，所述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)酶酶切，所述限制性?xún)?nèi)切酶為NheI限制性?xún)?nèi)切酶，經(jīng)酶切后可獲得區(qū)別于其他番茄果皮顏色的特異譜帶，所述紫黑色條紋果皮番茄特異性譜帶為一條613bp。

進(jìn)一步的，所述CAPS標(biāo)記方法包括如下步驟：

(1)以紫黑色條紋果皮番茄為母本，綠色番茄為父本進(jìn)行雜交，其中所述綠色番茄攜帶的分子標(biāo)記序列為SEQ ID No.2的核苷酸堿基序列，兩者雜交獲得F1代，所述F1代果實(shí)發(fā)育到紅熟期時(shí)果皮性狀全為綠色；

(2)將上述步驟(1)中獲得的F1代進(jìn)行自交，獲得F2代，所述F2果實(shí)發(fā)育到紅熟期時(shí)果皮性狀出現(xiàn)性狀分離；

(3)采集親本、F1代、F2代中成熟的果皮顏色不同的番茄植株葉片，使用CTAB法提取基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，以合成的堿基序列SEQ ID No.3-4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(4)提取將上述步驟(3)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl，在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果；確認(rèn)無(wú)誤后，使用膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(5)將上述步驟(4)中獲得的不同個(gè)體基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別使用Nhe I快速限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切；

(6)將上述步驟(5)酶切后的產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上檢測(cè)酶切結(jié)果，所述凝膠電泳反應(yīng)條件為85V/100mA電泳20分鐘。

其中，所述純合的紫黑色條紋果皮番茄母本DNA擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)法被NheI酶切，表現(xiàn)為1條長(zhǎng)度為613bp的條帶，純合的綠色父本DNA擴(kuò)增產(chǎn)物完全被NheI酶切，表現(xiàn)為2條長(zhǎng)度分別為390bp和223bp的條帶；雜合的F1代僅有1條染色體DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物可以被NheI酶切，表現(xiàn)為3條長(zhǎng)度分別為613、390和223bp的條帶。

所述紫黑色條紋果皮番茄F2代為隱性純合基因型，無(wú)法被NheI酶切，表現(xiàn)為1條長(zhǎng)度為613bp的條帶，綠色番茄的F2代為顯性純合或雜合，可以完全或部分被NheI酶切，表現(xiàn)為2條長(zhǎng)度分別為390bp和223bp的條帶，或3條長(zhǎng)度分別為613、390和223bp的條帶，橙色等過(guò)渡性狀F2代也可能為雜合或隱性純合，可以部分或完全被NheI酶切，表現(xiàn)為3條長(zhǎng)度分別為613、390和223bp的條帶，或2條長(zhǎng)度分別為390bp和223bp的條帶。

進(jìn)一步的，所述PCR擴(kuò)增體系總體積為50μl，其中：模板DNA 5μl，5U/μl Taq-Plus DNA聚合酶0.5μl，含Mg²⁺的10×PCR Buffer for Taq5μl，dNTPs mixture 4μl，10μM的正向引物和反向引物各1μl，ddH₂O 33.5μl；所述PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5分鐘。

進(jìn)一步的，所述酶切反應(yīng)體系為：底物DNA 10μl，10×CutOne^TM Buffer 3μl，Lightning^TMNheI 1μl，ddH₂O 16μl；酶切條件為37℃孵育15分鐘，隨即80℃孵育20分鐘使限制酶失活，停止反應(yīng)。

進(jìn)一步的，所述分子標(biāo)記方法在番茄品種改良以及育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明采用的CAPS分子標(biāo)記方法，原理是根據(jù)己知位點(diǎn)的DNA序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，利用這些引物擴(kuò)增該位點(diǎn)上的某一特定DNA片段，然后用某種限制性?xún)?nèi)切酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)凝膠電泳分離酶切片段，觀察其多態(tài)性。其優(yōu)點(diǎn)是避免了傳統(tǒng)RFLP分析中的轉(zhuǎn)膜步驟，大大簡(jiǎn)化了操作，又能保持RFLP分析的精確度；而且很多限制性?xún)?nèi)切酶均可參與擴(kuò)增DNA酶切，檢測(cè)到多態(tài)性機(jī)會(huì)較大。本發(fā)明目的是獲得與紫黑色番茄——金陵墨玉果皮顏色性狀連鎖的CAPS分子標(biāo)記，進(jìn)而快速篩選番茄的紫黑色表皮性狀，應(yīng)用于番茄品種改良分子輔助育種，在苗期即可進(jìn)行初期篩選，大大縮短育種周期，對(duì)于培育富含花青素的番茄新品種具有重要的理論和實(shí)踐意義。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提供的CAPS標(biāo)記在親本紫黑色條紋果皮番茄、綠色番茄和雜交F1代中的酶切結(jié)果。

其中，M：DL2000DNA marker；1：親本紫黑色條紋果皮番茄；2：親本綠色番茄；3-5：雜交F1代。

圖2為本發(fā)明提供的CAPS標(biāo)記在F2代中的驗(yàn)證。

其中，M：DL2000DNA marker；1-5：紫黑色F2代；6-10：綠色F2代；11-16：橙色等其他顏色F2代。

圖3為本發(fā)明提供的CAPS標(biāo)記在自然群體中的應(yīng)用。

其中，M：1kb DNA ladder；1-2：紫黑色番茄；3-9：其他顏色番茄。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，如圖1至圖4所示：鑒別紫黑色條紋果皮番茄的CAPS分子標(biāo)記方法，所述紫黑色條紋果皮番茄所攜帶的分子標(biāo)記位于3號(hào)染色體上，序列為SEQ ID No.1的核苷酸堿基序列，所述紫黑色條紋果皮番茄基因組DNA模板經(jīng)PCR擴(kuò)增，其中紫黑色條紋果皮番茄的擴(kuò)增引物為SEQ ID No.3-4的核苷酸堿基序列，所述SEQ ID No.3-4的核苷酸堿基序列為人工設(shè)計(jì)，所述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)酶酶切，所述限制性?xún)?nèi)切酶為NheI限制性?xún)?nèi)切酶，經(jīng)酶切后可獲得區(qū)別于其他番茄果皮顏色的特異譜帶，所述紫黑色條紋果皮番茄特異性譜帶為一條613bp。

優(yōu)選地，所述CAPS標(biāo)記方法包括如下步驟：

(1)以紫黑色條紋果皮番茄為母本，綠色番茄為父本進(jìn)行雜交，其中所述綠色番茄攜帶的分子標(biāo)記序列為SEQ ID No.2的核苷酸堿基序列，兩者雜交獲得F1代，所述F1代果實(shí)發(fā)育到紅熟期時(shí)果皮性狀全為綠色；

(2)將上述步驟(1)中獲得的F1代進(jìn)行自交，獲得F2代，所述F2果實(shí)發(fā)育到紅熟期時(shí)果皮性狀出現(xiàn)性狀分離；

(3)采集親本、F1代、F2代中成熟的果皮顏色不同的番茄植株葉片，使用CTAB法提取基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，以合成的堿基序列SEQ ID No.3-4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(4)提取將上述步驟(3)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl，在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果；確認(rèn)無(wú)誤后，使用膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(5)將上述步驟(4)中獲得的不同個(gè)體基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別使用LightningTM Nhe I快速限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切；

(6)將上述步驟(5)酶切后的產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上檢測(cè)酶切結(jié)果，所述凝膠電泳反應(yīng)條件為85V/100mA電泳20分鐘。

其中，所述純合的紫黑色條紋果皮番茄母本DNA擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)法被NheI酶切，表現(xiàn)為1條長(zhǎng)度為613bp的條帶，純合的綠色父本DNA擴(kuò)增產(chǎn)物完全被NheI酶切，表現(xiàn)為2條長(zhǎng)度分別為390bp和223bp的條帶；雜合的F1代僅有1條染色體DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物可以被NheI酶切，表現(xiàn)為3條長(zhǎng)度分別為613、390和223bp的條帶。

所述紫黑色條紋果皮番茄F2代為隱性純合基因型，無(wú)法被NheI酶切，表現(xiàn)為1條長(zhǎng)度為613bp的條帶，綠色番茄的F2代為顯性純合或雜合，可以完全或部分被NheI酶切，表現(xiàn)為2條長(zhǎng)度分別為390bp和223bp的條帶，或3條長(zhǎng)度分別為613、390和223bp的條帶，橙色等過(guò)渡性狀F2代也可能為雜合或隱性純合，可以部分或完全被NheI酶切，表現(xiàn)為3條長(zhǎng)度分別為613、390和223bp的條帶，或2條長(zhǎng)度分別為390bp和223bp的條帶。

優(yōu)選地，所述PCR擴(kuò)增體系總體積為50μl，其中：模板DNA 5μl，5U/μl Taq-Plus DNA聚合酶0.5μl，含Mg2+的10×PCR Buffer for Taq5μl，dNTPs mixture 4μl，10μM的正向引物和反向引物各1μl，ddH2O 33.5μl；所述PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5分鐘。

優(yōu)選地，所述酶切反應(yīng)體系為：底物DNA 10μl，10×CutOneTM Buffer 3μl，Lightning ^TMNheI 1μl，ddH2O 16μl；酶切條件為37℃孵育15分鐘，隨即80℃孵育20分鐘使限制酶失活，停止反應(yīng)。

優(yōu)選地，所述分子標(biāo)記方法在番茄品種改良以及育種中的應(yīng)用。

一、實(shí)施例1

步驟一：供試材料

本試驗(yàn)所用的母本為紫黑色櫻桃番茄“金陵墨玉”，父本為綠色番茄“JDLBS”，均來(lái)自于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所。經(jīng)過(guò)雜交組合獲得F1代，然后自交獲得F2分離群體。

步驟二：性狀鑒定

待果實(shí)發(fā)育到紅熟期，目測(cè)鑒定成熟果皮顏色性狀。F1代全為綠色，F(xiàn)2代出現(xiàn)性狀分離。

步驟三：CPAS分子標(biāo)記的獲取

采集親本、F1、F2代中成熟但果皮顏色不同的番茄植株葉片，使用CTAB法提取基因組DNA。然后以提取的基因組DNA為模板，人工合成堿基序列為SEQ ID No.3-4作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系總體積為50μl，其中：模板DNA 5μl，Taq-Plus DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，10X PCR Buffer for Taq(含Mg²⁺)5μl，dNTPs mixture(2.5mM each)4μl，10μM的正向引物和反向引物各1μl，ddH₂O 33.5μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5分鐘。取10μl PCR產(chǎn)物，在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。確認(rèn)無(wú)誤后，使用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)不同個(gè)體基因組DNA的PCR產(chǎn)物，分別使用Lightning^TM Nhe I快速限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系為：底物DNA 10μl，10X CutOne^TM Buffer 3μl，Lightning^TM NheI 1μl，ddH₂O 16μl。酶切條件為37℃孵育15分鐘，隨即80℃孵育20分鐘使限制酶失活，停止反應(yīng)。然后在1％瓊脂糖凝膠上，85V/100mA電泳20分鐘，檢測(cè)酶切結(jié)果。

對(duì)于親本和F1代，酶切結(jié)果如圖1所示。純合的紫黑色條紋果皮番茄“金陵墨玉”親本DNA擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)法被NheI酶切，表現(xiàn)為1條長(zhǎng)度為613bp的條帶。純合的綠色親本“JDLBS”DNA擴(kuò)增產(chǎn)物完全被NheI酶切，表現(xiàn)為2條長(zhǎng)度分別為390bp和223bp的條帶。而雜合的F1代僅有1條染色體DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物可以被NheI酶切，表現(xiàn)為3條長(zhǎng)度分別為613、390和223bp的條帶。

對(duì)于F2代，酶切結(jié)果如圖2所示。紫黑色條紋果皮番茄F2代為隱性純合基因型，無(wú)法被NheI酶切，表現(xiàn)為1條長(zhǎng)度為613bp的條帶。綠色F2代為顯性純合或雜合，可以完全或部分被NheI酶切，表現(xiàn)為2條長(zhǎng)度分別為390bp和223bp的條帶，或3條長(zhǎng)度分別為613bp、390bp和223bp的條帶。橙色等過(guò)渡性狀F2代也可能為雜合或隱性純合，可以部分或完全被NheI酶切，表現(xiàn)為3條長(zhǎng)度分別為613、390和223bp的條帶，或2條長(zhǎng)度分別為390bp和223bp的條帶。

二、在自然群體中的驗(yàn)證

對(duì)江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所收集的9個(gè)番茄品種進(jìn)行CAPS標(biāo)記驗(yàn)證。采用與步驟三同樣的方法，提取這些番茄葉片的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示。紫黑色條紋果皮番茄均表現(xiàn)為隱性純合基因型，酶切結(jié)果為1條長(zhǎng)度為613bp的條帶。其他顏色表現(xiàn)為顯性純合或雜合基因型，可以完全或部分被NheI酶切，表現(xiàn)為2條長(zhǎng)度分別為390bp和223bp的條帶，或3條長(zhǎng)度分別為613、390和223bp的條帶。

本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所做的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其他不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。

序列表

<110> 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 鑒別紫黑色條紋果皮番茄的CAPS分子標(biāo)記方法及應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 613

<212> DNA

<213> 番茄 (Solanum lycopersicum)

<400> 1

gttgctttta cttaattttt gtgtgctagt caaatatata cattcaaagc tgataattat 60

caatgatata atggaaaaaa taatattatt tatgtattaa ttttataaaa atatcatata 120

ttaagaacat tattttagca aggacaatat ataaataaac agacaataat attgattagt 180

ttttactcca actaaacttg tataactgca ggtaagggcg gagttagcat agagttaggg 240

tttcatccga atttctttcg gcgaaaaata ttgtttcatc tgttttattt tatgtagtat 300

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tgattttttt gaaataaaat ttatatattt ataaactatg taaaatgtat tttaagtcac 420

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<210> 2

<211> 613

<212> DNA

<213> 番茄 (Solanum lycopersicum)

<400> 2

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atacatgatt aacataattt tttagatata tataatatag atatatacta gttctaagaa 600

catgcgtagc acg 613

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gttgctttta cttaattttt g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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