本發(fā)明屬于色譜分離技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人尿激肽原酶粗制品的制備方法。
背景技術(shù)：
人尿激肽原酶(Urinary Kallidinogenase，KN)，是從人尿中分離提取的由238個氨基酸組成的糖蛋白，等電點在4左右，分子量約54000D。人尿激肽原酶能夠激活人血漿激肽原轉(zhuǎn)化為激肽，從而行使一系列生理功能，例如，起到擴張毛細血管，松弛血管平滑肌，改善微循環(huán)，增加血流量，抗凝，溶血栓等作用，對極性腦梗死等具有顯著的療效。
人尿胰蛋白酶抑制劑(Urinary trypsininhibitor，UTI)是從人尿中分離純化的由143個氨基酸組成的糖蛋白，等電點在2左右，分子量約65000D，人尿胰蛋白酶抑制劑具有抑制多種蛋白酶、糖酶和脂酶等酶的活性，從而抑制炎癥介質(zhì)的過度釋放，抑制全身性炎癥反應(yīng)，改善微循環(huán)和組織灌注，起到保護臟器等作用。
尿蛋白產(chǎn)品主要的生產(chǎn)步驟包括：通過尿蛋白的吸附、洗脫、沉淀等步驟制備尿蛋白粗制品，然后尿蛋白粗制品經(jīng)過精制，得到尿蛋白精制品。吸附劑、洗脫液、平衡液等都會對尿蛋白粗制品的收率和純度產(chǎn)生影響。
中國專利申請CN102660525公開了一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法，包括如下步驟：采用陰離子交換樹脂作為吸附劑，收集尿液中的尿蛋白后，使用0.5－1.0M的NaCl溶液進行集中洗脫，將洗脫液上樣金屬螯合親和層析住，金屬螯合親和層析柱平衡液為0.01－0.2M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0－2M，pH6.0－9.0，使用pH4.5－2.8的0.01－0.2M醋酸－醋酸鈉溶液作為洗脫溶液，從而實現(xiàn)KN和UTI的分離。通過該方法，可快速吸附KN并集中系統(tǒng)，提高KN的穩(wěn)定性的優(yōu)點，但是該方法在陰離子交換樹脂和金屬螯合親和層析柱洗脫時的KN收率都較低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
中國專利申請CN105754977公開了一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法，包括如下步驟：將陰離子交換樹脂作為吸附劑吸附尿蛋白，用NaCl溶液進行洗脫，收集洗脫液；將洗脫液進行超濾濃縮，調(diào)節(jié)超濾濃縮液的pH值為3.2-4.2，電導(dǎo)為0.05-8Ms/cm，再上樣已經(jīng)用平衡液平衡好的陽離子交換樹脂，沖洗，平衡液為0.01-0.5mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液，電導(dǎo)為0.05-8Ms/cm，pH值為3.2-4.2，用洗脫液洗脫，收集洗脫液，在洗脫液中加入65％硫酸銨粉末攪拌，收集沉淀，得人尿激肽原酶粗制品。該方法在陰離子樹脂洗脫時的KN收率較低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
因此，研究開發(fā)操作簡單、收率高、純度較高的人尿激肽原酶粗制品的制備方法具有重要的產(chǎn)業(yè)化意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在收率不夠理想的問題，本發(fā)明提供人尿激肽原酶粗制品的制備方法，對陰離子交換樹脂、金屬螯合親和層析柱的洗脫液和平衡液等進行了優(yōu)化，提高了人尿激肽原酶粗制品收率，降低了生產(chǎn)成本，獲得的人尿激肽原酶粗制品產(chǎn)品質(zhì)量好，KN比活高。
本發(fā)明提供一種人尿激肽原酶粗制品的制備方法，包括如下步驟：
S1收集吸附尿蛋白后的吸附劑，洗脫，收集尿蛋白洗脫峰；
S2將步驟S1得到的尿蛋白洗脫峰進行超濾濃縮，調(diào)節(jié)pH為4～5.8，電導(dǎo)率為20～70mS/cm，得到濃縮液；
S3將步驟S2得到的濃縮液上樣金屬螯合親和層析柱，平衡液沖洗金屬螯合親和層析柱，然后使用水作為洗脫液進行洗脫，收集人尿激肽原酶洗脫峰；所述平衡液由0.5～2mol/L的磷酸鹽緩沖液和0.01～0.1mol/L的醋酸溶液以3～5：1的體積比組成，平衡液的pH為4～5.8；
S4向步驟S3得到的人尿激肽原酶洗脫峰中緩慢加入硫酸銨，攪拌，靜置，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品。
采用上述技術(shù)方案，可以實現(xiàn)高效收集以及KN和UTI的高效分離，提高了人尿激肽原酶粗制品收率，降低了生產(chǎn)成本，獲得的粗制品產(chǎn)品質(zhì)量好，KN比活高。
優(yōu)選地，所述步驟S2中，調(diào)節(jié)pH為4.5～5.5，電導(dǎo)率為25～60mS/cm。
優(yōu)選地，所述步驟S3中，平衡液由0.8～1.2mol/L的磷酸鹽緩沖液和0.03～0.5mol/L的醋酸溶液以3～4：1的體積比組成，平衡液的pH為4.2～5.0。
優(yōu)選地，所述步驟S3中，平衡液由1.0～1.2mol/L的磷酸鹽緩沖液和0.1～0.3mol/L的醋酸溶液以4：1的體積比組成，平衡液的pH為4.4～4.8，電導(dǎo)率為40～55mS/cm。
優(yōu)選地，所述步驟S1中，吸附劑為陰離子交換樹脂。更優(yōu)選地，陰離子交換樹脂為強堿型陰離子交換樹脂，如：大孔型強陰離子交換樹脂、強堿型陰離子交換柱Q Sepharose H.p、Q Sepharose F.F、Q Sepharose 4F.F、Q Sepharose XL、QAE Sephadex A-25、QAE Sephadex A-50或STREAMLINE。所述大孔型強陰離子交換樹脂CAS號為9037-24-5。
優(yōu)選地，所述步驟S1中，洗脫液為0.3～2mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH為4～6，NaCl的濃度為0.01～0.45mol/L。
優(yōu)選地，所述金屬螯合親和層析柱的金屬離子為Cu2+、Zn2+或Ni2+。
優(yōu)選地，所述金屬螯合親和層析柱的金屬離子為Cu2+。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過使用pH為4～6的0.3～2mol/L的磷酸鹽緩沖液作為陰離子交換樹脂的洗脫液，可以實現(xiàn)KN從吸附劑中的充分洗脫，洗脫收率提高；通過使用0.5～2mol/L的磷酸鹽緩沖液和0.01～0.1mol/L的醋酸溶液以3～5：1的體積比組成金屬螯合親和層析柱的平衡液，水作為洗脫液，可以實現(xiàn)KN和UTI的高效分離，提高了人尿激肽原酶粗制品收率，大大降低了KN和UTI后續(xù)精制的難度，降低了生產(chǎn)成本，獲得的人尿激肽原酶粗制品產(chǎn)品質(zhì)量好，KN比活高。
附圖說明
圖1本發(fā)明實施例一中經(jīng)親和層析的人尿激肽原酶洗脫峰的HPLC圖。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
實施例一人尿激肽原酶粗制品的制備
人尿激肽原酶粗制品的制備方法包括如下步驟：收集吸附尿蛋白并水沖洗后的陰離子交換柱Q Sepharose F.F 100kg，洗脫，洗脫液為pH為4.5的0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液，NaCl的濃度為0.3mol/L，收集尿蛋白洗脫峰；將得到的尿蛋白洗脫峰進行超濾濃縮，調(diào)節(jié)pH為4.5，電導(dǎo)率為40mS/cm，得到濃縮液；將得到的濃縮液上樣已平衡好的Cu2+金屬螯合親和層析柱(Chelating sepharose Fast Flow，購自通用電氣醫(yī)療集團(GE公司、GE Healthcare)，平衡液沖洗金屬螯合親和層析柱，平衡液由1.0mol/L的磷酸鹽緩沖液和0.15mol/L的醋酸溶液以4：1的體積比組成，平衡液的pH為4.5，電導(dǎo)率為40mS/cm，然后使用去離子水作為洗脫液進行洗脫，收集人尿激肽原酶洗脫峰，進行HPLC檢測，結(jié)果如圖1所示；向得到的人尿激肽原酶洗脫峰中緩慢加入硫酸銨，攪拌至飽和，靜置，加入硅藻土5g，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品(KN粗制品)41g。收集上樣穿透液和沖洗穿透液，緩慢加入硫酸銨，攪拌至飽和，靜置，加入硅藻土20g，收集沉淀，得到人尿胰蛋白酶抑制劑粗制品(UTI粗制品)303g。
從圖1可知，經(jīng)本實施例提供的平衡液和洗脫液洗脫收集的人尿激肽原酶洗脫峰的人尿激肽原酶含量高達69.02％，而人尿胰蛋白酶抑制劑(對應(yīng)的保留時間為8.5)的含量低。
實施例二人尿激肽原酶粗制品的制備
人尿激肽原酶粗制品的制備方法包括如下步驟：收集吸附尿蛋白并水沖洗后的大孔型強陰離子交換樹脂100kg，洗脫，洗脫液為pH為4的1mol/L的磷酸鹽緩沖液，NaCl的濃度為0.1mol/L，收集尿蛋白洗脫峰；將得到的尿蛋白洗脫峰進行超濾濃縮，調(diào)節(jié)pH為4.5，電導(dǎo)率為40mS/cm，得到濃縮液；將得到的濃縮液上樣已平衡好的Cu2+金屬螯合親和層析柱(Chelating sepharose Fast Flow，購自通用電氣醫(yī)療集團(GE公司、GE Healthcare))，平衡液沖洗金屬螯合親和層析柱，平衡液由1.0mol/L的磷酸鹽緩沖液和0.15mol/L的醋酸溶液以4：1的體積比組成，平衡液的pH為4.5，電導(dǎo)率為40mS/cm，然后使用去離子水作為洗脫液進行洗脫，收集人尿激肽原酶洗脫峰；向得到的人尿激肽原酶洗脫峰中緩慢加入硫酸銨，攪拌至飽和，靜置，加入硅藻土5g，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品47g。收集上樣穿透液和沖洗穿透液，緩慢加入硫酸銨，攪拌至飽和，靜置，加入硅藻土20g，收集沉淀，得到人尿胰蛋白酶抑制劑粗制品327g。
對比例一人尿激肽原酶粗制品的制備
人尿激肽原酶粗制品的制備方法包括如下步驟：收集吸附尿蛋白并水沖洗后的陰離子交換柱Q Sepharose F.F 100kg，洗脫，洗脫液為0.8mol/L的NaCl溶液，收集尿蛋白洗脫峰；將得到的尿蛋白洗脫峰進行超濾濃縮，調(diào)節(jié)pH為4.5，電導(dǎo)率為40mS/cm，得到濃縮液；將得到的濃縮液上樣已平衡好的Cu2+金屬螯合親和層析柱(Chelating sepharose Fast Flow，購自通用電氣醫(yī)療集團(GE公司、GE Healthcare))，平衡液沖洗金屬螯合親和層析柱，平衡液由1.0mol/L的磷酸鹽緩沖液和0.15mol/L的醋酸溶液以4：1的體積比組成，平衡液的pH為4.5，電導(dǎo)率為40mS/cm，然后使用去離子水作為洗脫液進行洗脫，收集人尿激肽原酶洗脫峰；向得到的人尿激肽原酶洗脫峰中緩慢加入硫酸銨，攪拌至飽和，靜置，加入硅藻土5g，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品22g。收集上樣穿透液和沖洗穿透液，緩慢加入硫酸銨，攪拌至飽和，靜置，加入硅藻土20g，收集沉淀，得到人尿胰蛋白酶抑制劑粗制品282g。
對比例一與實施例一的區(qū)別在于：陰離子交換柱的洗脫液改為0.8mol/L的NaCl溶液。
對比例二人尿激肽原酶粗制品的制備
人尿激肽原酶粗制品的制備方法包括如下步驟：收集吸附尿蛋白并水沖洗后的大孔型強陰離子交換樹脂100kg，洗脫，洗脫液為pH為4.5的0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液，NaCl的濃度為0.3mol/L，收集尿蛋白洗脫峰；將得到的尿蛋白洗脫峰進行超濾濃縮，調(diào)節(jié)pH為8.0，電導(dǎo)率為2.2mS/cm，得到濃縮液；將得到的濃縮液上樣已平衡好的Cu2+金屬螯合親和層析柱(Chelating sepharose Fast Flow，購自通用電氣醫(yī)療集團(GE公司、GE Healthcare))，平衡液沖洗金屬螯合親和層析柱，平衡液的pH為8.0，含0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液和0.2mol/L的NaCl溶液，然后使用pH3.8的20mmol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液作為洗脫液進行洗脫，收集人尿激肽原酶洗脫峰；向得到的人尿激肽原酶洗脫峰中緩慢加入硫酸銨，攪拌至飽和，靜置，加入硅藻土5g，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品24g。收集上樣穿透液和沖洗穿透液，緩慢加入硫酸銨，攪拌至飽和，靜置，加入硅藻土20g，收集沉淀，得到人尿胰蛋白酶抑制劑粗制品296g。
對比例二與實施例一的區(qū)別在于：將得到的尿蛋白洗脫峰進行超濾濃縮，調(diào)節(jié)pH為8.0，電導(dǎo)率為2.2mS/cm，得到濃縮液；平衡液的pH為8.0，含0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液和0.2mol/L的NaCl溶液；使用pH3.8的20mmol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液作為洗脫液。
試驗例：人尿激肽原酶粗制品和人尿胰蛋白酶抑制劑粗制品的檢測
分別對實施例一、實施例二、對比例一、對比例二制得的KN粗制品和UTI粗制品使用熒光法進行檢測，結(jié)果如表1所示。
表1不同實施例的KN粗制品和UTI粗制品檢測結(jié)果表
從表1可知，實施例一，KN粗制品中KN的比活為5.8，UTI粗制品中UTI的比活為389實施例二，KN粗制品中KN的比活為6.2，UTI粗制品中UTI的比活為426對比例一，KN粗制品中KN的比活為0.8，UTI粗制品中UTI的比活為139對比例二，KN粗制品中KN的比活為1.1，UTI粗制品中UTI的比活為152
因此，本發(fā)明提供的人尿激肽原酶粗制品的制備方法能實現(xiàn)KN的高效洗脫，實現(xiàn)KN粗制品和UTI粗制品的高效分離，UTI基本集中在UTI粗制品中，KN基本集中在KN粗制品中，利于KN粗制品和UTI粗制品的后續(xù)精制。
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。