本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種密碼子優(yōu)化的Chi3L1(幾丁質(zhì)酶3樣物1)基因及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

幾丁質(zhì)是一種無(wú)臭無(wú)味的白色無(wú)定形物質(zhì)，廣泛存在于自然界，如甲殼類(lèi)動(dòng)物蟲(chóng)下、蟹的外殼，昆蟲(chóng)的甲殼以及細(xì)菌、真菌的細(xì)胞壁中。幾丁質(zhì)是高分子物質(zhì)，分子量可達(dá)1×10⁶以上，不溶于水、稀酸、堿、乙醇或其它有機(jī)溶劑。幾丁質(zhì)酶及幾丁質(zhì)酶樣蛋白屬于糖基水解蛋白家族18，他們廣泛分布在原核及真核生物中，兩者都能結(jié)合幾丁質(zhì)，前者具有剪切活性，而后者則無(wú)。

幾丁質(zhì)酶樣蛋白的重要成員幾丁質(zhì)酶3樣物1(Chi3L1)是重要的固有免疫和獲得性免疫的調(diào)節(jié)劑，主要由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等分泌表達(dá)，在組織損傷、凋亡、Th2介導(dǎo)免疫反應(yīng)、TGF-β1信號(hào)通路以及實(shí)質(zhì)結(jié)疤過(guò)程中起重要作用。CHI3L1能夠表達(dá)于各種細(xì)胞，尤其高表達(dá)于巨噬細(xì)胞晚期誘導(dǎo)分化階段，故有學(xué)者認(rèn)為CHI3L1是巨噬細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志。目前研究表明CHI3L1的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)為：(1)細(xì)胞生長(zhǎng)因子樣作用：CHI3L1可以磷酸化ERK1/2，通過(guò)這條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，CHI3L1可以促進(jìn)相應(yīng)細(xì)胞有絲分裂及生長(zhǎng)。另外CHI3L1還可以磷酸化AKT，從而激活PI3K，通過(guò)這條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，CHI3L1也可以促進(jìn)相應(yīng)細(xì)胞有絲分裂及生長(zhǎng)。(2)調(diào)節(jié)ECM重構(gòu)：CHI3L1可以減輕IL-1與TNF-a介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而減弱調(diào)亡信號(hào)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，限制ECM降解和調(diào)節(jié)ECM重構(gòu)，促進(jìn)結(jié)締組織增生，在一些疾病發(fā)生發(fā)雇過(guò)程中發(fā)揮重要作用。(3)拮抗凋亡：CHI3L1抗細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制還不清楚，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1/2及AKT的磷酸化起作用。

肝臟疾病的研究發(fā)現(xiàn)，Chi3L1不僅在酒精性肝病中表達(dá)升高，而且在肝纖維化及肝硬化中的表達(dá)也異常增高，并被認(rèn)為是肝纖維化潛在的標(biāo)志物。前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)Chi3L1處理的小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞，其白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α的表達(dá)會(huì)降低，與野生型的小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞相比，Chi3L1缺失的小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞在脂多糖LPS的刺激下，表達(dá)更高的IL-1β，TNF-α，單核細(xì)胞趨化因子-1和化學(xué)因子(C-X-C基序)配體1；在四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)Chi3L1基因敲除小鼠比野生型小鼠存在更嚴(yán)重的肝纖維化，而且肝臟巨噬細(xì)胞的功能之間也有差異，這些結(jié)果提示Chi3L1在肝纖維化過(guò)程中的炎癥反應(yīng)調(diào)控以及巨噬細(xì)胞的功能發(fā)揮中起著巨大作用。

目前研究已經(jīng)證實(shí)Chi3L1蛋白在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且其蛋白表達(dá)水平和腫瘤的發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)。因此針對(duì)Chi3L1蛋白研發(fā)抑制藥物是一條新的治療腫瘤的途徑，但由于目前的Chi3L1蛋白主要通過(guò)在人源性細(xì)胞中表達(dá)獲得，其表達(dá)量很低，難以滿(mǎn)足科研和臨床需求，而由于人和大腸桿菌有不同的密碼子系統(tǒng)，因此人源的基因并不適合直接在大腸桿菌中表達(dá)，綜合以上因素，我們?cè)诒景l(fā)明中采用針對(duì)大腸桿菌進(jìn)行密碼子優(yōu)化的Chi3L1基因，通過(guò)發(fā)酵獲得Chi3L1蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠獲得高濃度和純度的蛋白，可以滿(mǎn)足科研和臨床的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供密碼子優(yōu)化的Chi3L1基因，實(shí)現(xiàn)Chi3L1蛋白異源表達(dá)，以解決現(xiàn)有技術(shù)中Chi3L1表達(dá)量少，生物活性低的問(wèn)題。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株包含Chi3L1基因的重組細(xì)胞及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述Chi3L1重組蛋白在研發(fā)治療胃癌藥物中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種密碼子優(yōu)化的Chi3L1基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

包含權(quán)利要求1所述Chi3L1基因的重組載體在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。

包含權(quán)利要求1所述Chi3L1基因的重組細(xì)胞在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。

上述密碼子優(yōu)化的Chi3L1基因在發(fā)酵產(chǎn)Chi3L1蛋白中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。

一種Chi3L1蛋白的表達(dá)和純化方法，包括如下步驟：

(1)將權(quán)利要求1所述的SEQ ID NO.1所示基因克隆至表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒；

(2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)plysS細(xì)胞，得到重組菌；

(3)利用步驟(2)得到的重組菌發(fā)酵產(chǎn)種Chi3L1蛋白；

(5)采用Ni-NTA樹(shù)脂層析純化Chi3L1蛋白。

步驟(1)中，所述的表達(dá)質(zhì)粒為pRSET-A。

上述Chi3L1蛋白的表達(dá)和純化方法制備得到的Chi3L1重組蛋白在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。

上述Chi3L1重組蛋白在制備治療胃癌藥物中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。

有益效果：

本發(fā)明提供了一種成本低、簡(jiǎn)便易行的獲取Chi3L1重組蛋白的方法，本發(fā)明所述的Chi3L1重組蛋白具有很強(qiáng)的免疫活性和促腫瘤生長(zhǎng)的作用，可以作為免疫研究的活性藥物以及作為藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物，具有良好的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1：本發(fā)明中重組Chi3L1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)圖，其中1、2、3分別為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)0、2、4小時(shí)后Chi3L1蛋白表達(dá)量變化情況。

圖2：重組Chi3L1蛋白體外促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2分化。

圖3：重組Chi3L1蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1：重組Chi3L1蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。

先合成Chi3L1(如ESQ ID No.:1所示)基因，接著通過(guò)采用NdeⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)亞克隆至pRSET-A質(zhì)粒，得到pRSET-A-Chi3L1表達(dá)質(zhì)粒，具體構(gòu)建過(guò)程如下：

(1).酶切：將合成的Chi3L1的DNA片段用限制性?xún)?nèi)切酶NheI和HindⅢ進(jìn)行酶切，同時(shí)用對(duì)應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)pRSET-A空載穿梭質(zhì)粒進(jìn)行酶切。

表1酶切反應(yīng)體系

反應(yīng)條件：37℃水浴2h。上述酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的片段，使用Agarose Gel DNA Extraction Kit獲得純化的目的DNA片段。

(2).連接：將酶切后的Chi3L1表達(dá)片段與pRSET-A載體連接。

表3連接反應(yīng)體系

37℃4h后，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)菌，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2：本實(shí)施例描述了重組Chi3L1蛋白的表達(dá)及純化方法

表達(dá)質(zhì)粒pRSET-A在插入子上游有一連續(xù)編碼6個(gè)組氨酸(His₆)的堿基序列，因此，所表達(dá)的多肽在氨基端有His₆標(biāo)識(shí)，便于表達(dá)蛋白的純化和鑒定。表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)菌，過(guò)夜培養(yǎng)后以1:50在100ml SOB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD450為0.5左右時(shí)加入終濃度為0.5mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h；其中在0h、2h、4h分別取樣1ml，6000r/min離心5min，沉淀加入30μl Laemmli緩沖液，95℃加熱5min，取8μl經(jīng)SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色分析顯示隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，在相對(duì)分子質(zhì)量42kD位置附近的蛋白條帶逐漸增強(qiáng)，且4h時(shí)蛋白表達(dá)量最高(如圖1所示)。其余細(xì)菌離心沉淀，用于Chi3L1蛋白純化。

細(xì)菌沉淀加入裂解液(6M鹽酸胍,100mM NaH₂PO4,10mM Tris-Cl,pH 8.0)后超聲破碎，用Ni-NTA樹(shù)脂(Qiagen公司)層析純化，最后采用洗脫液(8M urea,100mMNaH₂PO4,10mM Tris-Cl,pH 3.5)洗脫，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，達(dá)到1.2mg/ml。

實(shí)施例3：重組Chi3L1蛋白促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2分化

采用1000μg/ml是純化后的Chi3L1蛋白處理巨噬細(xì)胞4小時(shí)，收集細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后RT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示CD163，CD206等巨噬細(xì)胞M2分化相關(guān)基因表達(dá)明顯增高，提示該Chi3L1重組蛋白能夠有效的促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2分化(圖2)。

實(shí)施例4：重組Chi3L1蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用

采用不同濃度的Chi3L1 0、100、250、500、1000μg/ml濃度分別處理AGS胃癌細(xì)胞，48小時(shí)后WST實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示AGS細(xì)胞的增殖率分別上升了了7.3％，6.0％，13.9％和25.1％，此結(jié)果提示Chi3L1對(duì)AGS胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，并且該促進(jìn)作用具有濃度依賴(lài)性(圖3)。

SEQUENCE LISTING

<110> 一種密碼子優(yōu)化的Chi3L1基因及其應(yīng)用

<120> 南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院

<130> SG20161108001

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1152

<212> DNA

<213> 密碼子優(yōu)化的Chi3L1基因核苷酸序列

<400> 1

atgggcgtaa aggcctcaca aacaggattt gtggtccttg tcttactaca atgctgtagt 60

gcttataagc ttgtatgtta ttatacgagc tggagtcaat atagagaggg agacggcagt 120

tgcttccctg atgccttaga tagatttttg tgtactcata taatatattc gttcgctaat 180

ataagtaacg accacataga tacatgggag tggaatgatg tcacgcttta tgggatgttg 240

aatacactta agaaccgaaa tcccaattta aagacgctcc ttagtgtagg gggctggaac 300

tttggcagtc aacgattttc aaagatagcc agcaacactc aaagtaggag gacatttata 360

aagagcgtac ctccctttct acgaacacac ggattcgacg gccttgatct cgcgtggttg 420

tatcccggac gacgagacaa gcagcatttt acgactctta taaaggaaat gaaggccgag 480

tttataaaag aggcacaacc tggaaagaag caactattgc tatcagccgc gttgtcggcc 540

gggaaggtca caatagactc gagttacgac attgctaaga ttagccaaca tttagatttt 600

atatccataa tgacttatga cttccacgga gcctggagag ggacaacagg gcatcattcg 660

ccactttttc gggggcaaga ggacgccagt cccgataggt tctcgaacac agattacgca 720

gtcggatata tgttacgcct tggggctcca gctagcaagc tcgtcatggg aataccaacg 780

tttggacgct cgtttacatt ggcgagttca gagactggag tgggagcccc tatatcaggc 840

ccaggaatac ctggccgatt tacaaaggag gctggaactt tagcgtatta cgaaatttgt 900

gattttctca gaggggcgac cgtacaccgg atacttgggc aacaagtacc gtacgctacg 960

aagggaaatc aatgggtcgg atatgacgat caagagtccg tcaagagtaa ggtgcaatat 1020

ttgaaggacc gccagttggc aggggcgatg gtgtgggcgc ttgatttgga cgattttcaa 1080

gggagttttt gcggacaaga ccttcgattt ccccttacaa atgccattaa ggatgctctt 1140

gctgctactt ag 1152

<210> 2

<211> 382

<212> PRT

<213> Chi3L1蛋白氨基酸序列

<400> 2

Gly Val Lys Ala Ser Gln Thr Gly Phe Val Val Leu Val Leu Leu Gln

1 5 10 15

Cys Cys Ser Ala Tyr Lys Leu Val Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser Gln

20 25 30

Tyr Arg Glu Gly Asp Gly Ser Cys Phe Pro Asp Ala Leu Asp Arg Phe

35 40 45

Leu Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Ser Asn Asp His

50 55 60

Ile Asp Thr Trp Glu Trp Asn Asp Val Thr Leu Tyr Gly Met Leu Asn

65 70 75 80

Thr Leu Lys Asn Arg Asn Pro Asn Leu Lys Thr Leu Leu Ser Val Gly

85 90 95

Gly Trp Asn Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn Thr

100 105 110

Gln Ser Arg Arg Thr Phe Ile Lys Ser Val Pro Pro Phe Leu Arg Thr

115 120 125

His Gly Phe Asp Gly Leu Asp Leu Ala Trp Leu Tyr Pro Gly Arg Arg

130 135 140

Asp Lys Gln His Phe Thr Thr Leu Ile Lys Glu Met Lys Ala Glu Phe

145 150 155 160

Ile Lys Glu Ala Gln Pro Gly Lys Lys Gln Leu Leu Leu Ser Ala Ala

165 170 175

Leu Ser Ala Gly Lys Val Thr Ile Asp Ser Ser Tyr Asp Ile Ala Lys

180 185 190

Ile Ser Gln His Leu Asp Phe Ile Ser Ile Met Thr Tyr Asp Phe His

195 200 205

Gly Ala Trp Arg Gly Thr Thr Gly His His Ser Pro Leu Phe Arg Gly

210 215 220

Gln Glu Asp Ala Ser Pro Asp Arg Phe Ser Asn Thr Asp Tyr Ala Val

225 230 235 240

Gly Tyr Met Leu Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ser Lys Leu Val Met Gly

245 250 255

Ile Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly

260 265 270

Val Gly Ala Pro Ile Ser Gly Pro Gly Ile Pro Gly Arg Phe Thr Lys

275 280 285

Glu Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Asp Phe Leu Arg Gly

290 295 300

Ala Thr Val His Arg Ile Leu Gly Gln Gln Val Pro Tyr Ala Thr Lys

305 310 315 320

Gly Asn Gln Trp Val Gly Tyr Asp Asp Gln Glu Ser Val Lys Ser Lys

325 330 335

Val Gln Tyr Leu Lys Asp Arg Gln Leu Ala Gly Ala Met Val Trp Ala

340 345 350

Leu Asp Leu Asp Asp Phe Gln Gly Ser Phe Cys Gly Gln Asp Leu Arg

355 360 365

Phe Pro Leu Thr Asn Ala Ile Lys Asp Ala Leu Ala Ala Thr

370 375 380