本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用熒光定量PCR技術(shù)快速檢測HLA-B*1502等位基因的核酸、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

癲癇是慢性反復(fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征，屬于高發(fā)性神經(jīng)性疾病，為僅次于頭痛的第二大神經(jīng)科常見病。治療癲癇最為重要的是控制發(fā)作，目前主要依靠藥物治療。治療藥物主要包含卡馬西平、苯妥英鈉、乙琥胺、丙戊酸鈉等常規(guī)藥物及拉莫三嗪、奧卡西平、托吡酯等新型藥物，其中以前兩者藥物使用最多，是目前常用的一線抗癲癇藥物。但使用卡馬西平等藥物可能導(dǎo)致嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)，甚至引發(fā)致命性的史蒂文斯-約翰遜綜合征(Stevens-Johnson Syndrome，SJS)或中毒性表皮壞死松解癥(Toxic Epidermal Necrolysis，TEN)，后者的致死率達(dá)30％，患者并無特效藥可以治療，只能接受類似燒燙傷的處理，并可能引起敗血癥并發(fā)多重器官衰竭而死亡。

有研究證實(shí)，卡馬西平誘導(dǎo)的SJS/TEN與患者是否攜帶HLA-B*1502等位基因有很大關(guān)聯(lián)。美國食品藥品管理局(FDA)給出了相關(guān)規(guī)范，將HLA-B*1502等位基因列為卡馬西平誘導(dǎo)SJS/TEN的基因關(guān)聯(lián)生物標(biāo)記物。

HLA-B*1502是一種人類白血球抗原(HLA)等位基因。HLA是一個(gè)由一系列緊密連鎖的基因座位所組成的具有高度多態(tài)性的復(fù)合體，該復(fù)合體位于人第6號(hào)染色體短臂上6p21.3，全長4000kb，由200個(gè)以上基因座位組成的基因復(fù)合體，是迄今已知基因中等位基因多態(tài)性最高的基因復(fù)合體。HLA包括有Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類基因部分，HLA-B*1502屬于Ⅰ類型中的HLA-B基因中的一個(gè)等位基因。HLA-B基因序列復(fù)雜，每個(gè)基因型與其他基因型相比，只有數(shù)個(gè)不相連的不同基因位點(diǎn)，因此分型難度相當(dāng)大。

目前DNA分型方法主要分為兩種：基于核酸序列識(shí)別的方法和基于序列分子構(gòu)型的方法?；诤怂嵝蛄凶R(shí)別的方法主要有：PCR-RFLP，PCR-SSR，PCR-SSP和PCR-SBT。其中PCR-SBT測序方法是現(xiàn)世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的HLA分型方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但PCR-SBT主要針對(duì)HLA-B基因位點(diǎn)進(jìn)行測序，雖屬于HLA分型中的高分辨率方法，但要求較高，需要提供精密儀器，成本較高且耗時(shí)長，測序法步驟多，且開管操作，易造成基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室污染；PCR-SSP方法是用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與HLA等位基因序列互補(bǔ)探針進(jìn)行雜交，然后確定HLA-B基因型的方法，操作過程復(fù)雜，耗時(shí)也較長。PCR-SSR利用與HLA等位基因序列互補(bǔ)的引物，對(duì)待測樣本DNA進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，需多管引物進(jìn)行判斷，不太適用臨床操作，且利用電泳或肉眼觀察結(jié)果，可能會(huì)造成誤判，本法勞動(dòng)強(qiáng)度大，也易造成基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室污染，費(fèi)時(shí)長。

目前市場已有的檢測HLA-B*1502試劑盒是基于PCR-SSP方法的臺(tái)灣Pharmigene公司的PG1502試劑盒，但由于其價(jià)格較高，且不能區(qū)分多種等位基因從而造成假陽性，也不便在內(nèi)地市場推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)檢測能力的不足，本發(fā)明的目的是提供一組用于快速檢測HLA-B*1502等位基因的核酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于快速檢測HLA-B*1502等位基因的試劑盒及其檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一組用于快速檢測HLA-B*1502等位基因的核酸，該核酸包括檢測引物和檢測探針，其中，所述檢測引物包括正向引物1、正向引物2和反向引物，所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID No.1，所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

如上所述的核酸，優(yōu)選的，所述核酸還包括內(nèi)部質(zhì)控，其包括質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

如上所述的核酸，優(yōu)選的，所述核酸還包括作為所述檢測引物的陽性對(duì)照物、和/或作為所述內(nèi)部質(zhì)控的陽性對(duì)照物，其中，所述檢測引物的陽性對(duì)照物含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，所述內(nèi)部質(zhì)控的陽性對(duì)照物含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

一種用于快速檢測HLA-B*1502等位基因的試劑盒，該試劑盒包括：

正向引物1：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

正向引物2：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

反向引物：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示

檢測探針：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述檢測探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)；

檢測引物的陽性對(duì)照物：含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述試劑盒還包括：作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對(duì)、質(zhì)控探針和質(zhì)控陽性對(duì)照物，其中，所述質(zhì)控引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，該質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于所述檢測探針的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于所述檢測探針的淬滅基團(tuán)，所述質(zhì)控陽性對(duì)照物含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，試劑盒還包括10×PCR緩沖液、Fast Advanced Master Mix、礦物油、陰性對(duì)照物：無核酸酶水。

一種快速檢測HLA-B*1502等位基因的方法，該方法包括以下步驟：

(1)從樣品中提取DNA；

(2)對(duì)提取的所述DNA，同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；其中，所述反應(yīng)體系1中檢測引物對(duì)1的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述反應(yīng)體系2中檢測引物對(duì)2的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，該檢測探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)；

(3)收集熒光信號(hào)，選擇對(duì)應(yīng)熒光基團(tuán)的熒光檢測模式，基線調(diào)整取3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；

(4)結(jié)果判定：待測樣品的所述反應(yīng)體系1和所述反應(yīng)體系2的熒光增長曲線均超過閾值線，有明顯的擴(kuò)增曲線，則判斷為陽性，如所述反應(yīng)體系1和所述反應(yīng)體系2中任一反應(yīng)體系或均無明顯的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述反應(yīng)體系1和所述反應(yīng)體系2還包括有作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，該質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于所述檢測探針的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于所述檢測探針的淬滅基團(tuán)。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，在所述反應(yīng)體系1和所述反應(yīng)體系2中，所述檢測引物對(duì)1的終濃度均為120-250nmol/L，所述檢測引物對(duì)2的終濃度均為120-250nmol/L，所述檢測探針的終濃度為150-200nmol/L，所述質(zhì)控的引物對(duì)和所述質(zhì)控探針的終濃度均為100-150nmol/L；所述熒光基團(tuán)為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，在所述反應(yīng)體系1和所述反應(yīng)體系2中，所述檢測引物對(duì)1的終濃度均為150nmol/L，所述檢測引物對(duì)2的終濃度均為120nmol/L，所述檢測探針的終濃度為200nmol/L，所述內(nèi)部質(zhì)控的引物對(duì)均為120nmol/L，所述質(zhì)控探針的終濃度為150nmol/L；所述檢測探針的5＇端連接FAM，3＇端連接MGB，所述質(zhì)控探針的5＇端連接JOE，3＇端連接BHQ1。

如上所述的方法，優(yōu)選地，步驟(2)中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(4)中，所述閾值線的Ct值為25，所述待測樣本的所述反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的FAM、JOE均有明顯的擴(kuò)增曲線，F(xiàn)AM信號(hào)的Ct值≤25，JOE信號(hào)的Ct值≤25為陽性；所述反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的JOE均有明顯的擴(kuò)增曲線，且JOE信號(hào)的Ct值≤25，兩體系中任一體系FAM沒有明顯的擴(kuò)增曲線，或FAM信號(hào)的Ct值＞25為陰性。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，還設(shè)有陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽性對(duì)照為以含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、和/或含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列為模板，進(jìn)行所述反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；所述陰性對(duì)照為以無核酸酶水為模板，進(jìn)行所述反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；

在步驟(4)中，所述陽性對(duì)照的反應(yīng)體系1和2的FAM均有明顯的擴(kuò)增曲線且FAM信號(hào)的Ct值≤20，和/或JOE有明顯的擴(kuò)增曲線且JOE信號(hào)的Ct值≤25，符合要求；所述陰性對(duì)照的反應(yīng)體系1和2的FAM、JOE均沒有明顯的擴(kuò)增曲線，符合要求；否則，應(yīng)重新進(jìn)行檢測。

本發(fā)明提供了一組用于快速檢測HLA-B*1502等位基因的核酸及檢測試劑盒，同時(shí)建立了一種比較高效、靈敏的HLA-B*1502等位基因的快速檢測方法。提供同時(shí)檢測的兩孔檢測體系的核酸，其是針對(duì)不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，可用于檢測特異性檢測HLA-B*1502等位基因。

本發(fā)明的檢測試劑盒和方法，使用方便，操作簡便，自動(dòng)化程度高，大大簡化了操作過程，并減少了在操作過程的污染，檢測效果好，具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度的特點(diǎn)。提供的檢測方法采用完全閉管操作，操作簡單、方便快捷、通過直接探測PCR過程中熒光信號(hào)值的獲得檢測的結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測，克服了常規(guī)PCR技術(shù)的易污染、出現(xiàn)假陽性，能有效避免非特異性擴(kuò)增難題，并且適合大批量樣本的檢測。

本發(fā)明提供的檢測試劑盒及方法，用于檢測HLA-B*1502等位基因時(shí)，為了避免漏檢、及初步判斷樣本DNA量是否在允許范圍內(nèi)，設(shè)有內(nèi)部質(zhì)控，為了判斷檢測體系是否正常，還設(shè)有陰性對(duì)照和檢測引物的陽性對(duì)照；為了避免假陰性及漏檢，設(shè)有檢測引物和內(nèi)部質(zhì)控的陽性對(duì)照，其陽性對(duì)照檢測成陽性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果及漏檢；為了避免假陽性及漏檢，設(shè)有檢測引物和內(nèi)部質(zhì)控的陰性對(duì)照，其陰性對(duì)照檢測成陰性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果及漏檢；檢測試劑盒及方法設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，有效避免漏檢、錯(cuò)檢的可能。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明運(yùn)用ARMS引物配合熒光探針區(qū)分HLA-B*1502等位基因上的特異位點(diǎn)，還有如下有益效果和顯著進(jìn)步：

(1)靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)10拷貝突變基因的穩(wěn)定檢出，檢測結(jié)果可信。

(2)特異性強(qiáng)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的上下游引物均為特異性引物，結(jié)合檢測探針，具有很高的特異性，對(duì)存在于中國人群中HLA-B*1502以外HLA-B基因座等位基因攜帶者的DNA樣本均無交叉反應(yīng)。

(3)操作簡便：本發(fā)明應(yīng)用Fast Advanced Master Mix預(yù)混在反應(yīng)體系中，一步加樣，無需將樣本與酶混合，減少了酶與樣本混合的步驟，減少了樣本的污染，操作更簡單。

(4)成本低，本發(fā)明應(yīng)用2種反應(yīng)體系，兩孔一測試，一次PCR反應(yīng)即可檢測，有效降低檢測成本。

(5)檢測速度快，結(jié)果直觀，整個(gè)檢測過程兩個(gè)小時(shí)內(nèi)可完成，依靠CT值即可判斷結(jié)果，無需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步檢測分析。

(6)安全：整個(gè)試劑盒不包含有毒有害物質(zhì)，對(duì)操作人員和環(huán)境無危害。

本發(fā)明涉及的HLA-B*1502等位基因檢測試劑盒具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)周期短，操作簡單，安全無毒，成本低等顯著優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒檢測陽性對(duì)照的擴(kuò)增曲線。

圖2為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒檢測陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線。

圖3為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒檢測陰性樣本1的擴(kuò)增曲線。

圖4為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒檢測陰性樣本2的擴(kuò)增曲線。

圖5為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒檢測陽性樣本3的擴(kuò)增曲線。

圖6為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法中反應(yīng)體系1檢測靈敏度的擴(kuò)增曲線。

圖7為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法中反應(yīng)體系2檢測靈敏度的擴(kuò)增曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，本發(fā)明提供的核苷酸序列的互補(bǔ)序列也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，如無特殊說明，所用試劑為常規(guī)試劑，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的檢測試劑盒的工作原理是根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過設(shè)計(jì)HLA-B*1502等位基因序列特異性TaqMan探針及配套引物組成的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)HLA-B*1502等位基因的檢測。本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針可用于對(duì)HLA-B*1502等位基因的特異性檢測。

實(shí)施例1引物、探針、驗(yàn)證模板設(shè)計(jì)

本發(fā)明通過在dbMHC數(shù)據(jù)庫中將HLA-B*1502等位基因序列與HLA-B其它基因序列進(jìn)行比對(duì)，找出HLA-B*1502等位基因序列的特異區(qū)域。通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，特異位點(diǎn)區(qū)域基本集中在外顯子2與外顯子3區(qū)域內(nèi)，依靠個(gè)別特異位點(diǎn)可將HLA-B*1502等位基因與其它HLA-B等位基因區(qū)別開來。因此，根據(jù)這些特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)了兩條特異性ARMS檢測引物對(duì)和一條TaqMan熒光檢測探針，通過對(duì)特異性檢測引物和TaqMan熒光檢測探針的篩選和體系的優(yōu)化，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系，利用兩孔反應(yīng)液即可實(shí)現(xiàn)對(duì)HLA-B*1502等位基因的高靈敏度和高特異性檢測。經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，最終確定檢測HLA-B*1502等位基因的特異性檢測引物包括正向引物1(1502-F1)、正向引物2(1502-F2)、反向引物(1502-R)和檢測探針(1502-P)，如下：

1502-F1(SEQ ID No.1):5’-TTCGACAGCGACGCCCGCGAG-3’；

1502-F2(SEQ ID No.2):5’-CCGGAGTATTGGGACCGGA-3’；

1502-R(SEQ ID No.3):5’-CGCAGGTTCCGCAGGC-3’；

1502-P(SEQ ID No.4):5’-TCTCCAAGACCAACA-3’。

正向引物1和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增序列的大小為140bp；正向引物2和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增序列的大小為77bp。既可以作為正向引物1的陽性對(duì)照物又可作為正向引物2的陽性對(duì)照物，其核苷酸序列包含如SEQ ID No.8所示的序列。

SEQ ID No.8：

5’-TTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGCGCCCCGGGCGCCATGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGAACACACAGATCTCCAAGACCAACACACAGACTTACCGAGAGAGCCTGCGGAACCTGCG-3’。

進(jìn)一步，為了對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和實(shí)驗(yàn)操作過程進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)控，同時(shí)檢測樣本的質(zhì)量，避免漏檢，本發(fā)明設(shè)計(jì)了看家基因ACTB作為內(nèi)參基因，通過內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對(duì)、質(zhì)控探針的篩選和體系優(yōu)化，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR內(nèi)部質(zhì)控檢測體系，其中，質(zhì)控引物對(duì)(ACTB-F、ACTB-R)、質(zhì)控探針(ACTB-P)如下：

ACTB-F(SEQ ID No.5)：5’-GACGGGGTCACCCACACT-3’；

ACTB-R(SEQ ID No.6)：5’-GATTTCCCGCTCGGCCG-3’；

ACTB-P(SEQ ID No.7)：5’-ACCGAGCGCGGCTACAGCTTCAC-3’。

作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增序列的大小為

156bp，將擴(kuò)增序列作為內(nèi)部質(zhì)控陽性對(duì)照物即包含如SEQ ID No.9所示序列作為驗(yàn)證是否漏檢的陽性對(duì)照。

SEQ ID No.9：

5’-GACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACGAGGGGTATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTCACCGAGCGCGGCTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGCGGGAAATC-3’。

實(shí)施例2采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測HLA-B*1502等位基因的方法

根據(jù)實(shí)施例1篩選設(shè)計(jì)的檢測引物對(duì)和檢測探針、質(zhì)控引物對(duì)、質(zhì)控探針進(jìn)行合成，可在檢測探針和質(zhì)控探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)，其中，熒光基團(tuán)為FAM、JOE、CY3、HEX、中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

應(yīng)用設(shè)計(jì)的檢測引物及檢測探針，對(duì)HLA-B*1502等位基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測，采用反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2，兩孔反應(yīng)體系，均用30μL反應(yīng)體系：其中，檢測引物對(duì)1的終濃度均為120-250nmol/L，檢測引物對(duì)2的終濃度均為120-250nmol/L，檢測探針的終濃度為150-200nmol/L，所述質(zhì)控的引物對(duì)和所述質(zhì)控探針的終濃度均為100-150nmol/L，還有Fast Advanced Master Mix 10μL，10×PCR buffer 4μL，其余用無核酸酶水補(bǔ)足。

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)選為如表1所示：

表1：實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

其中，在階段2設(shè)有15個(gè)循環(huán)，60℃的退火延伸溫度，有利于突變模板的富集。在3階段設(shè)有30個(gè)循環(huán)，60℃的退火延伸溫度可以保證更好的擴(kuò)增特異性。

收集熒光信號(hào)，選擇對(duì)應(yīng)熒光基團(tuán)的熒光檢測模式，基線調(diào)整取3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線，待測樣品的所述反應(yīng)體系1和所述反應(yīng)體系2的熒光增長曲線均超過閾值線，有明顯的擴(kuò)增曲線，則判斷為陽性，如所述反應(yīng)體系1和所述反應(yīng)體系2中任一反應(yīng)體系或均無明顯或典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。

將HLA-B*1502等位基因的檢測陽性對(duì)照物進(jìn)行上述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)的檢測引物及反應(yīng)體系可有效擴(kuò)增出HLA-B*1502等位基因。

對(duì)血液品進(jìn)行檢測時(shí)，避免漏檢，如有的反應(yīng)孔中未加檢測樣本的情況出現(xiàn)，在每個(gè)反應(yīng)孔中設(shè)置有內(nèi)部質(zhì)控，具體的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成如表2所示。

表2：實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成

應(yīng)用Fast Advanced Master Mix預(yù)混在反應(yīng)體系中，一步加樣，只需要加入樣品DNA，即可進(jìn)行檢測，無需將樣本與酶混合，減少了酶與樣本混合的步驟，減少了樣本的污染，操作更簡單。

上述的方法中，探針與熒光和淬滅基團(tuán)相連，檢測探針的熒光-淬滅基團(tuán)為優(yōu)選為FAM-MGB，其它熒光-淬滅基團(tuán)組合也同樣適用，比如，HEX-BHQ1、HEX-TAMRA、FAM-TAMRA、FAM-BHQ1、CY3-BHQ1、CY3-BHQ2等，檢測時(shí)選擇相應(yīng)的熒光檢測模式。質(zhì)控探針的熒光-淬滅基團(tuán)為優(yōu)選為JOE-BHQ1，應(yīng)當(dāng)注意的是檢測探針與質(zhì)控探針熒光基團(tuán)標(biāo)記為不同檢測模式的熒光基團(tuán)。

對(duì)于人血液樣品DNA和人咽拭子樣品進(jìn)行檢測時(shí)，質(zhì)控探針的信號(hào)有明顯的擴(kuò)增曲線。

上述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)可使用的儀器包括ABI實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)、Stratagene定量多聚酶鏈反應(yīng)儀(例如MX4000，MX3000，MX3005)。

實(shí)施例3用于快速檢測HLA-B*1502等位基因的試劑盒

用于快速檢測HLA-B*1502等位基因的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒包括以下成分：

正向引物1：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

正向引物2：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

反向引物：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示

檢測探針：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述檢測探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)；

檢測引物的陽性對(duì)照物：含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。

為了避免漏檢，錯(cuò)檢，還包括：作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對(duì)、質(zhì)控探針和質(zhì)控陽性對(duì)照物，其中，質(zhì)控引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，該質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于所述檢測探針的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于所述檢測探針的淬滅基團(tuán)，質(zhì)控陽性對(duì)照物含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

為了防止反應(yīng)體系在PCR擴(kuò)增過程中揮發(fā)，影響檢測效果，試劑盒還包括有礦物油。

為了便于反應(yīng)體系的配置，試劑盒還包括10×PCR緩沖液；Fast Advanced Master Mix，陰性對(duì)照物：無核酸酶水。其中Fast Advanced Master Mix，可選用ABI(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；10×PCRbuffer(Mg²⁺Plus)選用TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司，也可應(yīng)用市場上其他公司的緩沖液與DNA聚合酶。

實(shí)施例4血液樣本DNA的提取

待測樣本基因組DNA采用寧波有成公司的血液基因組DNA提取試劑盒，具體詳述如下：

1)取含抗凝劑的血液200μL加入到離心管(自備)中，加入50μL Proteinase K,吹吸混勻或渦旋振蕩10s混勻。

2)在離心管中加入250μL裂解液BL，渦旋振蕩10s混勻。

3)室溫靜置10min充分裂解細(xì)胞。

4)在離心管中加入200μL無水乙醇，渦旋振蕩10s混勻。

5)將DNA吸附柱置于2mL收集管中，將上述溶液(700μL)全部轉(zhuǎn)移到DNA吸附柱中，13000rpm離心1min，棄濾液和收集管。

6)將DNA吸附柱置于新的2mL收集管中，向DNA吸附柱中加入500μL洗滌液BWB1，13000rpm離心1min，棄濾液。

7)將DNA吸附柱重新放回2mL收集管中，加入500μL洗滌液BWB2，13000rpm離心1min，棄濾液。

8)將DNA吸附柱置新的1.5mL無核酸酶污染的離心管中(本試劑盒提供)，于室溫靜置或超凈工作臺(tái)風(fēng)干3-5min，以徹底揮發(fā)殘余的乙醇。

9)向吸附柱柱膜中央上方小心加入50-100μL洗脫液TE(此步驟請(qǐng)謹(jǐn)慎操作，槍頭請(qǐng)勿接觸柱膜)，室溫靜置1-3min，13000rpm離心1min。洗脫液即為DNA溶液。

將步驟9)抽提好的DNA樣本，用紫外分光光度計(jì)檢測濃度和DNA質(zhì)量，要求DNA的濃度≥10ng/μL，DNA的質(zhì)量OD260/280在1.6～2.0。將符合要求的DNA用TE(pH8.0)稀釋到0.1～20ng/μL。要求最終加入反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2中的每個(gè)單管中的DNA總量為1～200ng，最佳上樣量為20～50ng/管。

實(shí)施例5本發(fā)明試劑盒對(duì)血液樣品的檢測

取實(shí)施例3的HLA-B*1502等位基因檢測試劑盒，其中，檢測探針采用FAM-MGB標(biāo)記，質(zhì)控探針采用JOE-BHQ1標(biāo)記，檢測引物、檢測探針、陽性對(duì)照物委托上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，F(xiàn)ast Advanced Master Mix，采用ABI(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；10×PCR buffer采用TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。將檢測引物的陽性對(duì)照物和質(zhì)控的陽性對(duì)照物取出，解凍后震蕩混勻，短時(shí)離心備用。

采用實(shí)施例2的方法對(duì)HLA-B*1502等位基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。其中在具體步驟中，不同于實(shí)施例2的操作如下，其它未提及的為相同步驟。

1)從樣品中提取DNA。具體采用實(shí)施例4中符合要求的基因組DNA用TE(10mmol/L，PH8.0)稀釋到1～10ng/μL作為檢測模板。

2)對(duì)提取的樣本DNA，同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；其中，反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2組成見下表3，在反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2中加入樣本DNA10μL。

表3：實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成

進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

根據(jù)熒光定量PCR擴(kuò)增儀Ct值分析檢測結(jié)果：JOE是內(nèi)控信號(hào)，用于檢測體系是否正常，樣本是否漏加及初步判斷樣本DNA量是否在允許范圍內(nèi)；FAM是檢測信號(hào)，判斷待測樣本中是否含有HLA-B*1502等位基因。

為了避免假陰性及漏檢，設(shè)有檢測引物和內(nèi)部質(zhì)控的陽性對(duì)照(STD)，其陽性對(duì)照檢測成陽性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果及漏檢；為了避免假陽性及漏檢，設(shè)有檢測引物和內(nèi)部質(zhì)控的陰性對(duì)照(NTC)，其陰性對(duì)照檢測成陰性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果及漏檢。陽性對(duì)照(STD)FAM信號(hào)Ct值作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是否有效的判定標(biāo)準(zhǔn)。

陽性對(duì)照(STD)具體是采用只混合有檢測引物的陽性對(duì)照物和質(zhì)控的陽性對(duì)照物的模板，進(jìn)行上述步驟2)中的熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果圖如圖1所示，陰性對(duì)照(NTC)具體是采用無核酸酶水作為模板，進(jìn)行上述步驟2)中的熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果圖如圖2所示。

利用實(shí)施例4中的方法共提取了294份抗凝血的基因組DNA，其中，294份抗凝血的來源于湖北省人民醫(yī)院。對(duì)294份基因組DNA進(jìn)行上述檢測，其中，檢測結(jié)果的判斷方法優(yōu)選為：NTC檢測結(jié)果：1502-1、1502-2反應(yīng)體系FAM、JOE均不起線即沒有明顯的擴(kuò)增曲線，符合要求；STD檢測結(jié)果：1502-1、1502-2反應(yīng)體系FAM信號(hào)均起線即有明顯的擴(kuò)增曲線且Ct≤20，JOE起線且Ct≤25，符合要求。待測樣本檢測結(jié)果：1502-1、1502-2兩個(gè)反應(yīng)體系FAM、JOE均起線，F(xiàn)AM信號(hào)CT值≤25，JOE信號(hào)CT值≤25為陽性；1502-1、1502-1兩個(gè)體系JOE均起線且Ct≤25，兩體系中任一體系FAM不起線或Ct＞25為陰性。對(duì)于陰性樣品兩種情況(標(biāo)記為陰性樣品1和2)的擴(kuò)增圖，如圖3和4所示，對(duì)于陽性樣品(標(biāo)記為陽性樣品3)的擴(kuò)增圖，如圖5所示。

結(jié)果表明，對(duì)提取294份抗凝血的基因組DNA的檢測結(jié)果和sanger測序法(采用北京擎科生物技術(shù)有限公司的試劑)檢測結(jié)果一致，說明本發(fā)明提的試劑盒及方法準(zhǔn)確、可靠。

實(shí)施例6本發(fā)明試劑盒及方法靈敏度的檢測

將以現(xiàn)有基因工程技術(shù)合成的含有HLA-B*1502基因序列(SEQ ID No.8)的質(zhì)粒DNA干粉用TE(10mmol/L，PH8.0)復(fù)溶，定量后稀釋。取1×10⁴copies/μL的質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍稀釋，稀釋2個(gè)梯度，然后以4種濃度梯度(1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL和1×10¹copies/μL)的質(zhì)粒DNA為模板，按實(shí)施例5中的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測結(jié)果如圖6和圖7所示。

由圖6和圖7可見本發(fā)明的熒光PCR方法靈敏度高，10copies/μL基因DNA即可檢出。該檢測結(jié)果表明本發(fā)明所建立的HLA-B*1502等位基因運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法及其試劑盒檢測靈敏度高，與現(xiàn)有技術(shù)相比，能有效避免假陰性。

實(shí)施例7：本發(fā)明試劑盒及方法的特異性檢測

運(yùn)用實(shí)施例5中試劑盒及檢測方法，對(duì)存在于中國人群中HLA-B*1502以外HLA-B基因座等位基因攜帶者的DNA樣本，由湖北省人民醫(yī)院提供，包括HLA-B*0702、HLA-B*0705、HLA-B*1301、HLA-B*1302、HLA-B*1501、HLA-B*1525、HLA-B*2704、HLA-B*3501、HLA-B*3503、HLA-B*3505、HLA-B*3802、HLA-B*3901、HLA-B*3905、HLA-B*4001、HLA-B*4006、HLA-B*4601、HLA-B*4801、HLA-B*4803、HLA-B*5101、HLA-B*5201、HLA-B*5401、HLA-B*5502、HLA-B*5701、HLA-B*5801進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測結(jié)果均為陰性，說明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物探針，對(duì)HLA-B*1502以外HLA-B基因座等位基因均無交叉反應(yīng)，不會(huì)出現(xiàn)非特異性的結(jié)果，特異性強(qiáng)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢海吉力生物科技有限公司

<120> 用于快速檢測HLA-B*1502等位基因的核酸、試劑盒及方法

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cgtctggacc tggctggccg ggacctgact gactacctca tgaagatcct caccgagcgc 120

ggctacagct tcaccaccac ggccgagcgg gaaatc 156