1.一種來(lái)源于食木天牛的功能基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種來(lái)源于食木天牛的功能基因,其特征在于,所述基因包括3'UTR和一個(gè)978bp編碼325個(gè)氨基酸殘基的完整的開放閱讀框。
3.一種多功能纖維素酶,其特征在于,由權(quán)利要求1所述的功能基因編碼的蛋白,氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種多功能纖維素酶,其特征在于,所述氨基酸序列中含有1個(gè)假定的N-糖基化位點(diǎn)300-302;其蛋白質(zhì)分子量為37.1kDa,等電點(diǎn)為4.28。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種多功能纖維素酶,其特征在于,所述多功能纖維素酶含有1個(gè)GHF 5非常保守的潛在質(zhì)子供體156-165和1個(gè)親核試劑246-254。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種多功能纖維素酶,其特征在于,所述多功能纖維素酶的最適pH為5.0,在pH4.0-8.0的范圍內(nèi),酶的活性為60%以上;最適pH條件下,其最適反應(yīng)溫度為40℃,在30℃-80℃的范圍內(nèi),其酶活力為60%以上。
7.權(quán)利要求3~6任一所述的多功能纖維素酶的制備方法,其特征在于,包含以下步驟:
(1)獲取目的基因
將云斑天牛中腸經(jīng)冰上解剖后-80℃凍存,采用RNeasy試劑盒提取中腸組織的總RNA,以RNA為模板用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、oligo-dT反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA;設(shè)計(jì)目的基因引物SEQ ID NO:3~7,以云斑天牛Genomic DNA為模板,擴(kuò)增出目的基因;
(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒及重組BmNPV病毒
以云斑天牛中腸cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,回收目的基因,雙酶切目的片段及pFastBacTM1質(zhì)粒,回收酶切產(chǎn)物,經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒篩選、鑒定后,獲得重組質(zhì)粒pFast-BhCGHF5;利用BmNPV/Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建重組Bacmid,陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BmDH10Bac,獲得重組Bacmid DNA;
(3)重組Bacmid轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞
家蠶卵巢細(xì)胞培養(yǎng)BmN,在含12%胎牛血清的昆蟲TC-100培養(yǎng)基中培養(yǎng),在離心管中準(zhǔn)備兩種溶液,A:將Bacmid DNA 1ug加入100μL無(wú)胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基中,B:8μL cellfection試劑溶于100μL無(wú)胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基中,將A、B溶液混合均勻,室溫放置45-60min,加入800μL無(wú)胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基,使終體積為1mL,緩慢加至BmN細(xì)胞中,27℃培養(yǎng)5h后棄混合液,加入含12%FBS的TC-100培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),4-5天后,觀察細(xì)胞形態(tài),當(dāng)細(xì)胞漲大變圓、有成串融合的趨勢(shì)時(shí)收獲細(xì)胞,離心取上清進(jìn)行次代感染培養(yǎng),次代上清液用于注射;
(4)重組桿狀病毒感染家蠶
重組桿狀病毒感染家蠶54A五齡期起蠶,將蠶擱置冰上10min進(jìn)行麻醉,直至其靜止不動(dòng),將107的重組病毒注入到蠶幼蟲皮下組織,注入30分鐘后用桑葉喂食,在溫度25℃、濕度70%的環(huán)境中飼養(yǎng),在感染后5-6天內(nèi)收集家蠶血淋巴并存儲(chǔ)在-80℃;
(5)Western blot分析
將在蠶血中表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后,采用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,TTBS洗滌1次,然后用5%的脫脂奶粉室溫下封閉3h,TTBS洗滌三次,加入帶有His標(biāo)簽的羊抗鼠多克隆抗體,4℃過夜,TTBS洗滌3次,再用HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫孵育1h,TTBS洗三次,TBS洗滌一次,用HRP-DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色;
(6)重組纖維素酶的純化
將His TrapTM HP親和層析柱接到AKTApurifier 10蛋白層析儀上,用10倍柱床體積的EqμLibrium buffer平衡柱子,從-80℃超低溫冰箱中取出蠶血樣品,放室溫融化后超速離心、取上清加入4倍體積的binding buffer稀釋后上樣;收集流出液,繼續(xù)用平衡緩沖液洗柱以徹底去除雜蛋白,直至洗滌到基線;使用洗脫緩沖液進(jìn)行線性洗脫,收集洗脫峰,將僅有一條蛋白條帶的收集管,分裝凍存于-80℃?zhèn)溆茫徊⑼ㄟ^SDS-PAGE鑒定純化后的蛋白純度,純化后的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定按Bradford方法進(jìn)行,以牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
8.權(quán)利要求3~6任一所述的多功能纖維素酶在降解CMC-Na、纖維二糖或纖維三糖中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求3~6任一所述的多功能纖維素酶在利用新鮮植物或秸稈為原料合成生物能源中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求3~6任一所述的多功能纖維素酶在合成生物乙醇中的應(yīng)用。