本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及抗病相關(guān)蛋白IbSWEET10及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)是一種重要的糧食、飼料以及工業(yè)原料用作物，并且在當(dāng)今世界上作為一種新型能源植物，其地位顯得尤為重要。我國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國，年種植面積338.7萬hm2，占世界總種植面積的42.2％，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的67.94％。我國目前正處于飛速發(fā)展的時期，對能源的需求持續(xù)增加，人們對甘薯的需求也日益增多，因此選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗及專用型新品種成為我國甘薯育種的主要目標(biāo)。甘薯是世界第七大糧食作物，但甘薯病蟲害在世界范圍內(nèi)普遍存在，嚴(yán)重威脅著各國甘薯生產(chǎn)，造成甘薯產(chǎn)量、品質(zhì)及貯藏性大幅度下降，世界各個甘薯生產(chǎn)國家一直比較重視甘薯的主要病蟲害的防治。甘薯蔓割病，又稱甘薯枯萎病、甘薯蔓枯病、甘薯萎蔫病或甘薯莖腐病，是典型的鐮刀菌導(dǎo)管病，是我國南方薯區(qū)的重要病害之一，且危害極大。甘薯蔓割病由甘薯蔓割病菌引起。甘薯蔓割病菌可在土壤中存活多年。甘薯蔓割病菌的致病機理為：通過秧苗基部或根部的傷口，或，由帶菌種薯通過導(dǎo)管侵入秧苗，在導(dǎo)管組織內(nèi)繁殖，致使患病植株發(fā)生全株性枯萎、死亡，表現(xiàn)出地上部葉片自下而上變黃脫落，莖維管束變褐色，最后莖部開裂，整株枯死。甘薯是無性繁殖作物，具有種間、種內(nèi)雜交不親和的特性，該特性嚴(yán)重限制了甘薯育種中的資源利用和親本自由組配。長期育種實踐表明，常規(guī)雜交育種方法難以選育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗蔓割病的甘薯新品種。因此，采用基因工程技術(shù)培育抗蔓割病的甘薯新品種是一種可行途徑。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何增強植物對甘薯蔓割病的抗性。為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種抗病相關(guān)蛋白。本發(fā)明所提供的抗病相關(guān)蛋白，名稱為蛋白質(zhì)IbSWEET10，來源于甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)，為如下1)或2)或3)：1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；3)將1)或2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與植物抗病性相關(guān)的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2由306個氨基酸殘基組成。為了使1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述3)中的蛋白質(zhì)IbSWEET10，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述3)中的蛋白質(zhì)IbSWEET10可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述3)中的蛋白質(zhì)IbSWEET10的編碼基因可通過將序列表中序列1自5′末端起第122至1042位所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述編碼蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子可為如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：(a1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；(a2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第122至1042位所示的DNA分子；(a3)與(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的DNA分子；(a4)在嚴(yán)格條件下與(a1)或(a2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列表中序列1由1250個核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發(fā)明的編碼蛋白質(zhì)IbSWEET10的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的蛋白質(zhì)IbSWEET10的核苷酸序列80％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼蛋白質(zhì)IbSWEET10且與植物抗病性相關(guān)，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發(fā)明的編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。含有編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述表達盒可為表達盒A；所述表達盒A包括啟動子、編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子和終止子。所述啟動子可為CaMV35S啟動子、NOS啟動子或OCS啟動子。所述終止子可為NOS終止子或OCSpolyA終止子。所述表達盒A的序列可為序列表中序列3所示。所述表達盒A中：序列表中序列3自5′末端起第1至835位為CaMV35S啟動子，第848至1768位為編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子，第1785至2037位為NOS終止子。所述重組載體可為將編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子(即序列表中序列1自5’末端起第122至1042位所示的DNA分子)通過含有編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子的表達盒插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10。重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10的構(gòu)建過程如下：(A)用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切載體pCAMBIA3301得到載體骨架，用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切載體pBI121，回收約3032bp的片段，將所述載體骨架和所述片段連接，得到重組質(zhì)粒pCBGUS；(B)用序列表中序列1自5′末端起第122至1042位所示的DNA分子替換重組質(zhì)粒pCBGUS的限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI識別序列間的片段(重組質(zhì)粒pCBGUS被限制性核酸內(nèi)切酶XbaI和SacI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)得到的重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10，重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10表達序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)IbSWEET10。所述重組質(zhì)粒pCBGUS與重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10的差別僅在于將重組質(zhì)粒pCBGUS的限制性核酸內(nèi)切酶XbaI和SacI識別序列間的DNA片段(重組質(zhì)粒pCBGUS被限制性核酸內(nèi)切酶XbaI和SacI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)替換為序列表中序列1自5′末端起第122至1042位所示的DNA分子。所述重組微生物可通過將所述重組載體導(dǎo)入出發(fā)微生物得到。所述出發(fā)微生物可為酵母、細菌、藻類或真菌。所述細菌可為革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。所述革蘭氏陰性細菌可為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。所述根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)具體可為根癌農(nóng)桿菌EHA105。所述重組微生物具體可為EHA105/pCB-IbSWEET10。EHA105/pCB-IbSWEET10是將重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105得到的重組農(nóng)桿菌。所述轉(zhuǎn)基因植物細胞系均不包括繁殖材料。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述IbSWEET10基因轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。下述b1)或b2)也屬于本發(fā)明的保護范圍；b1)所述蛋白質(zhì)IbSWEET10，或，編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子，或，含有編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細胞系，在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用；b2)所述蛋白質(zhì)IbSWEET10，或，編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子，或，含有編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細胞系，在培育抗病性改變的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所述b1)中，所述調(diào)控植物抗病性可為增強植物抗病性。所述b2)中，所述抗病性改變可為抗病性增強。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，可包括將編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子導(dǎo)入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比抗病性增強。上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述編碼蛋白質(zhì)IbSWEET10的核酸分子可為如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：(a1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；(a2)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第122至1042位所示的DNA分子；(a3)與(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的DNA分子；(a4)在嚴(yán)格條件下與(a1)或(a2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列表中序列1由1250個核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種植物育種方法。本發(fā)明所提供的植物育種方法，可包括如下步驟：增加植物中所述蛋白質(zhì)IbSWEET10的含量或活性，從而增強植物的抗病性。上述任一所述抗病性可為抗蔓割病。上述任一所述抗病性可為抗甘薯蔓割病菌引起的病害。上述任一所述植物可為如下c1)至c5)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)薯蕷科植物；c4)甘薯；c5)甘薯品種栗子香。實驗證明，利用本發(fā)明提供的抗病相關(guān)蛋白IbSWEET10及其編碼基因能增強植物對蔓割病的抗性：與甘薯品種栗子香野生型幼苗相比，甘薯轉(zhuǎn)基因株系L96幼苗、甘薯轉(zhuǎn)基因株系L99幼苗和甘薯轉(zhuǎn)基因株系L130幼苗的蔓割病病級降低和褐化比例顯著降低；而甘薯品種栗子香野生型幼苗和甘薯轉(zhuǎn)空載體陽性幼苗的蔓割病病級和褐化比例均無顯著差異。因此，抗病相關(guān)蛋白IbSWEET10及其編碼基因在調(diào)控植物抗病性中具有重要的理論意義和實用價值。附圖說明圖1為甘薯擬轉(zhuǎn)基因植株的PCR擴增結(jié)果。圖2為甘薯轉(zhuǎn)基因株系的鑒定結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。ND98(記載于如下文獻中：Heetal.，PlantCellTissueandOrganCulture，2009，96:69-74.ND98在該文獻中的名稱為LM1)為一甘薯品系，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)甘薯遺傳育種研究室獲得，以重復(fù)本實驗。栗子香(王玉萍等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36(9)：1000-1005)為一甘薯品種，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)甘薯遺傳育種研究室獲得，以重復(fù)本實驗。克隆載體pMD19-T為寶生物工程(大連)公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為6013。載體pCAMBIA3301為Cambia公司產(chǎn)品。載體pBI121為Clontech公司產(chǎn)品。植物總RNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，目錄號為DP432。PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit為寶生物工程(大連)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為6110A。甘薯蔓割病菌和PDA培養(yǎng)基均記載于如下文獻中：戶勛，余萍，方一泓，李薇.甘薯蔓割病菌對甘薯的誘導(dǎo)抗性和PR蛋白的性質(zhì)測定.2007年11月，福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)。實施例1、IbSWEET10基因的獲得IbSWEET10基因的獲得的步驟如下：1、模板的獲得用植物總RNA提取試劑盒提取ND98幼嫩葉片的總RNA，將該總RNA用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA。2、從采用抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建的差減cDNA文庫中獲得了EST序列。EST序列的核苷酸序列如序列表中序列4所示。3、根據(jù)EST序列的核苷酸序列，設(shè)計并合成引物3GSP1和3GSP2。4、完成步驟3后，以步驟1獲得的cDNA為模板，以步驟3合成的3GSP1和3GSP2為引物，利用RACE方法擴增獲得約1100bp的3’-RACE片段，將3’-RACE片段和克隆載體pMD19-T連接，得到重組質(zhì)粒2。將重組質(zhì)粒2進行測序，獲得3’-RACE片段的核苷酸序列。根據(jù)3’-RACE片段的核苷酸序列，設(shè)計并合成引物5GSP1和5GSP2。5、完成步驟4后，以步驟1獲得的cDNA為模板，以步驟4合成的5GSP1和5GSP2為引物，利用RACE方法擴增獲得約200bp的5’-RACE片段，將5’-RACE片段和克隆載體pMD19-T連接，得到重組質(zhì)粒3。將重組質(zhì)粒3進行測序，獲得5’-RACE片段的核苷酸序列。6、完成步驟5后，利用DNAMAN6.0軟件拼接候選的IbSWEET10基因。依據(jù)拼接候選的IbSWEET10基因序列進一步設(shè)計并合成IbSWEET10基因ORF的引物O-F和O-R。7、完成步驟6后，以步驟1獲得的cDNA為模板，以步驟6合成的O-F和O-R為引物，PCR擴增獲得約921bp的PCR擴增產(chǎn)物并測序。上述引物3GSP1、3GSP2、5GSP1、5GSP2、O-F和O-R的核苷酸序列信息詳見表2。結(jié)果表明，步驟7獲得的PCR擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第122至1042位所示，將該序列所示的基因命名為IbSWEET10基因，其編碼的蛋白命名為IbSWEET10蛋白或蛋白質(zhì)IbSWEET10，氨基酸序列如序列表中序列2所示。表2.引物序列信息引物名稱序列信息5'-3'3GSP15'-ATGGCTCTCACTGGTCATCAATT-3'3GSP25'-TCATCTCATTCATCGTCTTCCTTTC-3'5GSP15'-GTAGAATGTTGGCAGTGGAGAAAG-3'5GSP25'-AAAGCAAAAGCCAATTGATGACC-3'O-F5'-ATGGCTCTCACTGGTCATCAA-3'O-R5'-TTAAGCTCCCACAGCCTGAA-3'實施例2、IbSWEET10蛋白在增強甘薯的蔓割病抗性中的應(yīng)用一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、人工合成序列表中序列1所示的雙鏈DNA分子。以該雙鏈DNA分子為模板，以O(shè)S-F-XbaI：GCTCTAGAATGGCTCTCACTGGTCATCAA(下劃線為限制性內(nèi)切酶XbaI的識別序列)和OS-R-SacI：CGAGCTCTTAAGCTCCCACAGCCTGAA(下劃線為限制性內(nèi)切酶SacI的識別序列)為引物進行PCR擴增，得到N端含有限制性內(nèi)切酶XbaI和C端含有限制性內(nèi)切酶SacI的雙鏈DNA分子。2、將步驟1中得到的N端含有限制性內(nèi)切酶XbaI和C端含有限制性內(nèi)切酶SacI的雙鏈DNA分子連接至克隆載體pMD19-T，得到重組質(zhì)粒pMD19-IbSWEET10。3、完成步驟2后，用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI雙酶切重組質(zhì)粒pMD19-IbSWEET10，回收約1.0kb的片段1。4、用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切載體pCAMBIA3301，回收約11256bp的載體骨架1。5、用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切載體pBI121，回收包含約3032bp的片段2。6、將片段2與載體骨架1連接，得到重組質(zhì)粒pCBGUS。7、用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI雙酶切重組質(zhì)粒pCBGUS，回收約12000bp的載體骨架2。8、將片段1和載體骨架2連接，得到重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10進行結(jié)構(gòu)描述如下：將重組質(zhì)粒pCBGUS的限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI識別序列間的小片段替換為序列表中序列1自5’末端起第122至1042位所示的DNA分子。重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10表達序列表中序列2所示的IbSWEET10蛋白。重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10具有一個表達盒A，表達盒A的核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中序列表中序列3自5’末端起第1至835位為CaMV35S啟動子，第848至1768位為IbSWEET10蛋白的編碼基因，第1785至2037位為NOS終止子。二、重組農(nóng)桿菌的獲得和甘薯轉(zhuǎn)基因植株的再生1、將重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，得到重組農(nóng)桿菌甲，將重組農(nóng)桿菌甲命名為EHA105/pCB-IbSWEET10。2、剝?nèi)￠L約0.5mm的栗子香的莖尖分生組織，置于胚性愈傷組織誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基(含2.0mg/L2，4-D和3.0％蔗糖的MS固體培養(yǎng)基)上，27±1℃培養(yǎng)8周，得到胚性愈傷組織，然后將胚性愈傷組織置于胚性愈傷組織誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基(含2.0mg/L2，4-D和3.0％蔗糖的MS液體培養(yǎng)基)中，水平搖床上振蕩光暗交替培養(yǎng)3d(具體條件為：100r/min；27℃；光暗交替培養(yǎng)的周期為：光照時間為13h，黑暗時間11h；光照強度為500lx)，得到直徑為0.7-1.3mm的胚性細胞團。3、完成步驟2后，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將EHA105/pCB-IbSWEET10轉(zhuǎn)化胚性細胞團，然后置于共培養(yǎng)基(含30mg/LAS、2.0mg/L2，4-D的MS固體培養(yǎng)基)上，28℃暗培養(yǎng)3d。4、完成步驟3后，將胚性細胞團用含900mg/L頭孢噻肟鈉(cefotaximesodium，CS)和2.0mg/L2，4-D的MS液體培養(yǎng)基洗滌2次，然后置于選擇培養(yǎng)基(含2.0mg/L2，4-D、100mg/LCS和0.5mg/L草銨膦(phosphinothricin，PPT)的固體MS培養(yǎng)基)上，27±1℃暗培養(yǎng)10-12周(每2周需更換一次選擇培養(yǎng)基)。5、完成步驟4后，將胚性細胞團置于體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有1.0mg/LABA、100mg/LCS和0.5mg/LPPT的MS固體培養(yǎng)基)上，27±1℃光暗交替培養(yǎng)(光照時間為13h，黑暗時間11h；光照強度為3000lx)2-4周，得到抗性愈傷組織。6、完成步驟5后，將抗性愈傷組織置于MS固體培養(yǎng)基上，27±1℃光暗交替培養(yǎng)(光暗交替培養(yǎng)的周期為：光照時間為13h，黑暗時間11h；光照強度為3000lx)4-8周，即獲得150株甘薯擬轉(zhuǎn)基因植株，依次命名L1-L150。7、分別提取步驟6獲得的甘薯擬轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片的基因組DNA，并以該基因組DNA為模板，以T35-F：5'-TTGATGTGATATCTCCACTGACG-3'和TS-R：5'-GGTAGAGACCGATCTGGAGGA-3'為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；如果PCR擴增產(chǎn)物中含有約700bp的條帶，則相應(yīng)的甘薯擬轉(zhuǎn)基因植株即為甘薯轉(zhuǎn)基因陽性植株。用等體積水代替甘薯擬轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片的基因組DNA，進行PCR擴增，作為陰性對照。用甘薯品種栗子香野生型植株的幼嫩葉片的基因組DNA代替甘薯擬轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片的基因組DNA，進行PCR擴增，作為對照。用重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10代替甘薯擬轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片的基因組DNA，進行PCR擴增，作為陽性對照。部分實驗結(jié)果見圖1(M為DNA分子Marker，W為陰性對照，P為陽性對照，WT為甘薯品種栗子香野生型植株的幼嫩葉片的基因組DNA，L4、L5、L6、L10、L14、L56、L63、L96、L99、L121和L130均為甘薯擬轉(zhuǎn)基因植株)。結(jié)果表明，L4、L5、L6、L10、L14、L56、L63、L96、L99、L121和L130均為甘薯轉(zhuǎn)基因陽性植株。采用無性繁殖的方法擴繁鑒定得到的甘薯轉(zhuǎn)基因陽性植株，由一株轉(zhuǎn)基因幼苗擴繁得到的植株作為一個株系。將L96、L99和L130的株系命名為甘薯轉(zhuǎn)基因株系L96、甘薯轉(zhuǎn)基因株系L99和甘薯轉(zhuǎn)基因株系L130。四、對照根癌農(nóng)桿菌的獲得和甘薯轉(zhuǎn)空載體植株的再生用重組質(zhì)粒pCBGUS代替重組質(zhì)粒pCB-IbSWEET10，其它同步驟三，得到重組農(nóng)桿菌乙(命名為EHA105/pCBGUS)和甘薯轉(zhuǎn)空載體陽性植株。四、蔓割病抗性鑒定1、甘薯轉(zhuǎn)基因株系的鑒定用植物總RNA提取試劑盒提取甘薯植株(甘薯品種栗子香野生型植株(WT)、甘薯轉(zhuǎn)空載體陽性植株(OCK)、甘薯轉(zhuǎn)基因株系L96的植株、甘薯轉(zhuǎn)基因株系L99的植株和甘薯轉(zhuǎn)基因株系L130的植株)的幼嫩葉片的總RNA，將該總RNA用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，然后以該cDNA為模板，實時定量檢測甘薯植株中IbSWEET10基因的相對表達量(以Ibactin基因作為內(nèi)參基因)。檢測IbSWEET10基因的引物為5’-TTTCTGTTCAAAAGTCCGATGC-3’和5’-CATTCCACGCTCTTGGTGC-3’。檢測Ibactin基因的引物為5’-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC-3’和5’-TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC-3’。將甘薯品種栗子香野生型植株中IbSWEET10基因的相對表達量作為1，其它甘薯植株中IbSWEET10基因的相對表達量見圖2(WT為甘薯品種栗子香野生型植株，OCK為甘薯轉(zhuǎn)空載體陽性植株，L96為甘薯轉(zhuǎn)基因株系L96的植株，L99為甘薯轉(zhuǎn)基因株系L99的植株，L130為甘薯轉(zhuǎn)基因株系L130的植株)。結(jié)果表明，甘薯轉(zhuǎn)基因株系L96的植株、甘薯轉(zhuǎn)基因株系L99的植株和甘薯轉(zhuǎn)基因株系L130的植株中IbSWEET10基因的相對表達量分別為甘薯品種栗子香野生型植株中IbSWEET10基因的相對表達量的2.99倍、2.53倍和3.48倍。甘薯品種栗子香野生型植株和甘薯轉(zhuǎn)空載體陽性植株中IbSWEET10基因的相對表達量無顯著差異。2、蔓割病抗性鑒定實驗重復(fù)三次，每個株系每次種植10株。具體操作步驟如下：a、將甘薯蔓割病菌接種于PDA培養(yǎng)基，28℃光暗交替培養(yǎng)(光暗交替培養(yǎng)的周期為：光照時間為13h，黑暗時間11h；光照強度為500lx)3d，然后28℃暗培養(yǎng)7d，得到菌絲。b、完成步驟a后，將所述菌絲轉(zhuǎn)移至三角瓶，加入100mL無菌蒸餾水，100r/min振蕩30min，然后用雙層無菌紗布過濾，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，得到濃度為1.0×107個/mL的孢子懸浮液。c、將長勢基本一致的甘薯幼苗(甘薯品種栗子香野生型幼苗(WT)、甘薯轉(zhuǎn)空載體陽性幼苗、甘薯轉(zhuǎn)基因株系L96的幼苗，甘薯轉(zhuǎn)基因株系L99的幼苗或甘薯轉(zhuǎn)基因株系L130的幼苗)剪口，對齊后置于孢子懸浮液中30min，然后插入無菌沙壤土中正常培養(yǎng)。完成步驟c9天后，記錄甘薯幼苗的蔓割病發(fā)病程度和褐化比例(褐化比例＝褐化莖桿長度/莖桿全長×100％)，并按照文獻((方樹民等.甘薯品種對蔓割病抗性的研究.植物保護學(xué)報，1988，15(3)：185-190.)中的蔓割病病級劃分標(biāo)準(zhǔn)進行病級調(diào)查。蔓割病病級劃分標(biāo)準(zhǔn)具體見表3。表3部分實驗結(jié)果見表4。結(jié)果表明，與甘薯品種栗子香野生型幼苗相比，甘薯轉(zhuǎn)基因株系L96幼苗、甘薯轉(zhuǎn)基因株系L99幼苗和甘薯轉(zhuǎn)基因株系L130幼苗的蔓割病病級和褐化比例均顯著降低；而甘薯品種栗子香野生型幼苗和甘薯轉(zhuǎn)空載體陽性幼苗的蔓割病病級和褐化比例均無顯著差異?？梢?，在甘薯中過表達IbSWEET10基因可增強甘薯對蔓割病的抗性。表4<110>抗病相關(guān)蛋白IbSWEET10及其編碼基因與應(yīng)用<120>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1250<212>DNA<213>甘薯Ipomoeabatatas（L.）Lam.<400>1gaaaattccggagagtaaagatcctaagcagttttatatctctctaaacacagtagatat60atatacacacacacatatatatagagagagatttcttacagttaactaagagaacaacac120tatggctctcactggtcatcaattggcttttgcttttggtgttcttggaaacatcatctc180attcatcgtcttcctttctccactgccaacattctaccagatgtacaagaagaaatcaac240ggaaggatatcaatcaatcccctatgtggttgcactgttcagtgcaatgctttggatata300ctatgcattcgtgaaggccaacgactccactcttctcattactatcaactcctttggtat360ctttattgagaccatttacgttgtctttttcctctgctactcaaccaagaaaaccaggat420ccaaactttgaagtttcttggtctgttcgtggcggggggcttcggtgcaattcttcttgt480cactcagtttctgttcaaaagtccgatgcgactccacgtggttggatggatcgccctcgt540gttctcggtgtgtgtgtttgttgcgccattgttcatagtgagacaagtgatccgcaccaa600gagcgtggaatgcatgccagtactcctctcggtcttcctcaccgtaaatgctgtcatgtg660gttcttctacggcttgttcttaaaagacatgaacattgctcttccaaatgttctgggctt720catcttcgggatcctccagatcggtctctacctgaagtacaaagacgcgaagaaagacgc780agtgaaggagcaaaagcttccagaagtgacaacactgccaaaaccagtcataatcttgga840agacaataacgacactaacgacaacaacaacaacaagcgcagcagcaagcttcctgaact900caccgaggaacaaatcatcgacatcgtcaaactcggaaccctcgtgtgctccgagaaaat960ccagaagagcgccgccgccgccgcttcaccgttcgacaagaacgccgccactgctcctaa1020gcttcaggctgtgggagcttaattcaatacaagattatccattgatacagcatatgcatg1080cgctatatatataaatatatatatgtatgtggtgaattttgctttgggtggtttaattta1140gtttttgctatggcattactttactttgtaaacgtacgctaattggaatttggtataatt1200aatgtttaatgcatgaaggttaatctaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1250<210>2<211>306<212>PRT<213>甘薯Ipomoeabatatas（L.）Lam.<400>2MetAlaLeuThrGlyHisGlnLeuAlaPheAlaPheGlyValLeuGly151015AsnIleIleSerPheIleValPheLeuSerProLeuProThrPheTyr202530GlnMetTyrLysLysLysSerThrGluGlyTyrGlnSerIleProTyr354045ValValAlaLeuPheSerAlaMetLeuTrpIleTyrTyrAlaPheVal505560LysAlaAsnAspSerThrLeuLeuIleThrIleAsnSerPheGlyIle65707580PheIleGluThrIleTyrValValPhePheLeuCysTyrSerThrLys859095LysThrArgIleGlnThrLeuLysPheLeuGlyLeuPheValAlaGly100105110GlyPheGlyAlaIleLeuLeuValThrGlnPheLeuPheLysSerPro115120125MetArgLeuHisValValGlyTrpIleAlaLeuValPheSerValCys130135140ValPheValAlaProLeuPheIleValArgGlnValIleArgThrLys145150155160SerValGluCysMetProValLeuLeuSerValPheLeuThrValAsn165170175AlaValMetTrpPhePheTyrGlyLeuPheLeuLysAspMetAsnIle180185190AlaLeuProAsnValLeuGlyPheIlePheGlyIleLeuGlnIleGly195200205LeuTyrLeuLysTyrLysAspAlaLysLysAspAlaValLysGluGln210215220LysLeuProGluValThrThrLeuProLysProValIleIleLeuGlu225230235240AspAsnAsnAspThrAsnAspAsnAsnAsnAsnLysArgSerSerLys245250255LeuProGluLeuThrGluGluGlnIleIleAspIleValLysLeuGly260265270ThrLeuValCysSerGluLysIleGlnLysSerAlaAlaAlaAlaAla275280285SerProPheAspLysAsnAlaAlaThrAlaProLysLeuGlnAlaVal290295300GlyAla305<210>3<211>2037<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3agattagccttttcaatttcagaaagaatgctaacccacagatggttagagaggcttacg60cagcaggtctcatcaagacgatctacccgagcaataatctccaggaaatcaaataccttc120ccaagaaggttaaagatgcagtcaaaagattcaggactaactgcatcaagaacacagaga180aagatatatttctcaagatcagaagtactattccagtatggacgattcaaggcttgcttc240acaaaccaaggcaagtaatagagattggagtctctaaaaaggtagttcccactgaatcaa300aggccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaa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