本發(fā)明涉及細胞工程和基因工程技術(shù)，具體涉及一種重組人MEN1小基因及其無義突變體穩(wěn)定細胞株的建立方法和依照該方法建立的重組人MEN1小基因及其無義突變體穩(wěn)定細胞株。

背景技術(shù)：
：

基因的無義突變在細胞內(nèi)產(chǎn)生了含有提前終止密碼子(premature translation termination codon，PTC)的異常mRNA。這些含有PTC的mRNA在第一輪翻譯過程中被細胞內(nèi)的無義突變介導(dǎo)的mRNA降解途徑(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)所識別和降解，從而消除這種mRNA翻譯產(chǎn)生的截短的、有毒的蛋白質(zhì)對機體的危害。NMD途徑是一種重要的真核生物基因轉(zhuǎn)錄后監(jiān)督機制，是基因表達的翻譯調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，許多癌癥和腫瘤的致病原因是由于無義突變導(dǎo)致抑癌基因表達水平嚴重降低或缺失。因此，抑癌基因無義突變及其翻譯調(diào)控的研究，有助于揭示基因突變引發(fā)癌癥的發(fā)病機制。

多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤I型(multiple endocrine neoplasia type 1，MEN1)是一種常染色體顯性遺傳紊亂性疾病，以甲狀旁腺、胰島細胞和垂體前葉三種內(nèi)分泌腺腫瘤的聯(lián)合發(fā)生為特征。一些病人也可能發(fā)展成為腎上腺皮層腫瘤、類癌瘤、血管纖維瘤、膠原瘤和脂肪瘤。抑癌基因MEN1由10個外顯子構(gòu)成，其編碼區(qū)域長1830bp，編碼了一個包含610個氨基酸的蛋白，即Menin蛋白。分子生物學(xué)研究已經(jīng)證實近乎10％的MEN1病人的MEN1基因發(fā)生了無義突變。

目前國內(nèi)外尚無一細胞株可用于篩選由于無義突變導(dǎo)致的多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病的治療藥物，因此急需建立相應(yīng)的細胞株以供體外篩選由于無義突變導(dǎo)致的多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病及其它腫瘤的潛在治療藥物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的在于提供一種重組人MEN1小基因及其無義突變體的穩(wěn)定細胞株，該細胞株可用于篩選由于無義突變導(dǎo)致的腫瘤及其它疾病的治療藥物。

本發(fā)明提供的一種重組人MEN1小基因，含有BamHⅠ序列(6bp)、外顯子2+內(nèi)含子2+外顯子3+內(nèi)含子3+外顯子4+內(nèi)含子4+外顯子5(2928bp)、EcoRⅠ序列(6bp)、外顯子6+內(nèi)含子6+外顯子7+內(nèi)含子7+外顯子8+內(nèi)含子8+外顯子9+內(nèi)含子9+外顯子10(2762bp)、HindⅢ序列(6bp)；其中7～448、2014～2222、2433～2561、2894～2934、2941～3028、3671～3807、4269～4404、4841～5005、5223～5702為外顯子；其核苷酸序列為SEQ ID NO：1。

本發(fā)明提供的四種重組人MEN1小基因無義突變體，其是由所述的重組人MEN1小基因通過PCR定點突變技術(shù)分別將其核苷酸序列中424位由C突變?yōu)門(M1)、3697位由T突變?yōu)锳(M2)、3697位由T突變?yōu)镚(M3)、4906位由C突變?yōu)镚(M4)。

本發(fā)明提供的一種穩(wěn)定細胞株，其含有上述重組人MEN1小基因。

本發(fā)明提供的四種穩(wěn)定細胞株，其分別含有上述重組人MEN1小基因無義突變體M1、M2、M3、M4。

本發(fā)明提供的一種穩(wěn)定細胞株的建立方法，包括如下步驟：

1)利用基因重組技術(shù)將人MEN1小基因克隆到含有c-myc標(biāo)簽和HA標(biāo)簽的哺乳動物表達載體pcDNA3.1(-)中，構(gòu)建成pCMV-MEN1；

2)利用PCR定點突變技術(shù)，分別得到424位由C突變?yōu)門、3697位由T突變?yōu)锳、3697位由T突變?yōu)镚、4906位由C突變?yōu)镚，人MEN1小基因無義突變質(zhì)粒pCMV-MEN1-M1、pCMV-MEN1-M2、pCMV-MEN1-M3、pCMV-MEN1-M4；

3)培養(yǎng)HeLa細胞，培養(yǎng)液為DMEM，添加10％胎牛血清，不添加抗生素培養(yǎng)，0.25％胰蛋白酶消化細胞，按2×10⁵cell/mL密度種于6孔細胞培養(yǎng)板；

4)利用Attractene Transfection Reagent將質(zhì)粒pCMV-MEN1、pCMV-MEN1-M1、pCMV-MEN1-M2、pCMV-MEN1-M3、pCMV-MEN1-M4分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞，24hr后，胰酶消化細胞，按照1：10稀釋種于6孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基中加入G418(終濃度為400μg/mL)篩選，每2～4天更換一次含有G418的培養(yǎng)液；

5)G418篩選15～20天，6孔板出現(xiàn)細胞克隆團，挑取細胞克隆團通過RT-PCR鑒定，陽性克隆采用有限稀釋法在96孔板中進行單克隆化培養(yǎng)；

6)待96孔板中單細胞長至匯合度80％以上，進行傳代培養(yǎng)，并通過RT-PCR進行鑒定；

7)RT-PCR鑒定為陽性單克隆，擴大培養(yǎng)，提取基因組，進行PCR鑒定，最終獲得五種穩(wěn)定細胞株HMEN1-WT、HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3和HMEN1-M4；

8)將上述五種細胞株凍于液氮中保藏。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明建立的穩(wěn)定細胞株HMEN1-WT基因組整合野生型的人MEN1小基因；HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3、HMEN1-M4分別整合MEN1小基因的無義突變體M1、M2、M3、M4。本發(fā)明建立的上述五種穩(wěn)定細胞株，可用于無義突變導(dǎo)致腫瘤的治療藥物的篩選。

附圖說明：

圖1是重組人MEN1小基因結(jié)構(gòu)示意圖。該小基因含有BamHⅠ序列(6bp)、外顯子2+內(nèi)含子2+外顯子3+內(nèi)含子3+外顯子4+內(nèi)含子4+外顯子5(2928bp)、EcoRⅠ序列(6bp)、外顯子6+內(nèi)含子6+外顯子7+內(nèi)含子7+外顯子8+內(nèi)含子8+外顯子9+內(nèi)含子9+外顯子10(2762bp)、HindⅢ序列(6bp)。

圖2是重組人MEN1小基因表達載體鑒定圖。泳道1是pcDNA3.1(-)空質(zhì)粒；泳道2是重組質(zhì)粒pCMV-MEN1；泳道3是重組質(zhì)粒pCMV-MEN1的PCR鑒定。

圖3是重組人MEN1小基因轉(zhuǎn)染HeLa細胞的RT-PCR鑒定圖。泳道1為未轉(zhuǎn)染細胞的陰性對照；泳道2為重組人MEN1小基因轉(zhuǎn)染細胞。

圖4是重組人MEN1小基因無義突變體測序鑒定圖譜。

圖5是利用實時熒光定量PCR檢測重組人MEN1小基因及其無義突變體穩(wěn)定細胞株mRNA表達水平。

圖6是利用Western blot檢測不同濃度的通讀藥物PTC124處理穩(wěn)定細胞株后全長MEN1蛋白的表達水平。

具體實施方式

實施例1

1、重組人MEN1小基因表達載體的構(gòu)建

利用BamHⅠ和HindⅢ對人MEN1小基因進行雙酶切得到5.7kb的基因片段，電泳回收。含有c-myc標(biāo)簽和HA標(biāo)簽的哺乳動物高效表達載體pcDNA3.1(-)也使用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切成線性載體，電泳回收。將其與回收的人MEN1小基因片段使用T4DNA連接酶連接，得到重組質(zhì)粒pCMV-MEN1，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定。

2、重組人MEN1小基因無義突變體的構(gòu)建

設(shè)計四對部分序列互補的突變引物，分別使424位由C突變?yōu)門(M1)、3697位由T突變?yōu)锳(M2)、3697位由T突變?yōu)镚(M3)、4906位由C突變?yōu)镚(M4)，使用高保真酶以重組質(zhì)粒pCMV-MEN1為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ消化模板，取10μL產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌，挑取克隆提取質(zhì)粒，測序鑒定，分別得到突變質(zhì)粒pCMV-MEN1-M1、pCMV-MEN1-M2、pCMV-MEN1-M3、pCMV-MEN1-M4。

3、HeLa細胞的培養(yǎng)與傳代

細胞來源于山西大學(xué)生物技術(shù)研究所。將長期保存于液氮的HeLa細胞從凍存盒中取出，靜置至細胞凍存管中液氮全部揮發(fā)；迅速在37℃的循環(huán)水浴鍋中將細胞凍存液完全融化，1000×g離心5min；棄掉上清，將沉淀中的細胞用1mL新鮮的細胞培養(yǎng)液(含10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)懸??；吸取細胞懸液接入細胞培養(yǎng)瓶(25cm²)中，將培養(yǎng)基補到3～4mL，旋緊細胞培養(yǎng)瓶蓋；在水平方向混勻細胞培養(yǎng)液，在37℃5％CO₂的二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。待細胞匯合度達到70％以上即可傳代，將細胞瓶中舊培養(yǎng)液棄掉，用2mL無菌PBS洗滌細胞2次；加入1mL 0.25％的胰酶，使其覆蓋全部細胞，37℃消化5～7min；用1mL細胞培養(yǎng)液(含血清)終止胰酶的消化作用，然后將細胞從瓶壁上吹洗起來，至細胞為單個細胞；按照1：2～1：4的比例將細胞分別接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

4、HeLa細胞的轉(zhuǎn)染及篩選

(1)轉(zhuǎn)染第一天，將HeLa細胞按2×10⁵cell/mL密度種于6孔培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)使得次日細胞匯合度達到90～95％。

(2)轉(zhuǎn)染第二天，在1.5mL無菌離心管中按下述步驟配制質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑Attractene Transfection Reagent混合液，用于轉(zhuǎn)染6孔板內(nèi)培養(yǎng)的細胞。①取1.2μg質(zhì)粒溶于100μL不含血清及抗生素的DMEM中；②添加4.5μL Attractene Transfection Reagent，混勻后室溫靜置10～15min；③將上述混合液添加至6孔板內(nèi)培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液中混勻；④放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24hr。

(3)轉(zhuǎn)染細胞的篩選

轉(zhuǎn)染24hr后，胰酶消化細胞，按1∶10稀釋接種于6孔培養(yǎng)板中，加G418(400μg/mL)篩選，每2～4天更換一次含有G418的篩選培養(yǎng)液，篩選15～20天，可見培養(yǎng)板中出現(xiàn)細胞克隆團。

(4)細胞株的單克隆化及擴大培養(yǎng)

篩選15～20天，6孔板出現(xiàn)細胞克隆團，挑取細胞克隆團，采用有限稀釋法在96孔培養(yǎng)板中進行單克隆化。96孔板中單細胞增殖過程中，用胰酶消化吹散使其重新貼壁生長，待長至80％以上，進行傳代培養(yǎng)，并通過RT-PCR進行鑒定。對于RT-PCR鑒定陽性克隆，擴大培養(yǎng)，提取基因組，PCR鑒定，最終獲得五種細胞穩(wěn)定株HMEN1-WT、HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3和HMEN1-M4，并凍存于液氮中保藏。

5、人MEN1小基因及其無義突變體在穩(wěn)定細胞株中的表達

(1)人MEN1小基因的PCR

根據(jù)人MEN1小基因序列兩端分別帶c-myc、HA標(biāo)簽，設(shè)計一對特異標(biāo)簽引物，擴增片段大小應(yīng)為5708bp。pCMV-MEN1質(zhì)粒作為陽性對照，未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞作為陰性對照，以穩(wěn)定細胞株HMEN1-WT、HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3和HMEN1-M4的基因組DNA為模板擴增，經(jīng)30個循環(huán)，PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳分析。可見兩樣品分別在近6000bp處有一特異條帶，與陽性對照條帶大小相同，而未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞基因組DNA中無擴增條帶。說明MEN1小基因及其無義突變體已分別成功導(dǎo)入細胞內(nèi)。

(2)人MEN1小基因的RT-PCR

根據(jù)人MEN1小基因序列兩端分別帶c-myc、HA標(biāo)簽，設(shè)計一對特異標(biāo)簽引物，擴增片段大小應(yīng)為1830bp。未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞作為陰性對照，以穩(wěn)定細胞株HMEN1-WT、HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3和HMEN1-M4的mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，經(jīng)30個循環(huán)，PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳分析。可見兩樣品分別在近2000bp處有一特異條帶，而未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞中無擴增條帶。說明穩(wěn)定細胞株HMEN1-WT、HMEN1-M1、HMEN1-M2、HMEN1-M3和HMEN1-M4分別存在MEN1小基因和其無義突變體在轉(zhuǎn)錄水平的表達。

6、通讀藥物的篩選

用不同濃度的通讀藥物PTC124(0、2、10、20μM)分別處理四種無義突變體穩(wěn)定細胞株48hr，用Western Blot檢測全長MEN1蛋白表達情況，以β-actin為內(nèi)參照。當(dāng)PTC124的處理濃度為20μM時，四種無義突變體穩(wěn)定細胞株中全長MEN1蛋白表達量恢復(fù)最多。

SEQUENCE LISTING

<110> 山西大學(xué)

<120> 重組人MEN1小基因及其無義突變體穩(wěn)定細胞株

<130> 無案卷參考號

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5708

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ggatccgggc tgaaggccgc ccagaagacg ctgttcccgc tgcgctccat cgacgacgtg 60

gtgcgcctgt ttgctgccga gctgggccga gaggagccgg acctggtgct cctttccttg 120

gtgctgggct tcgtggagca ttttctggct gtcaaccgcg tcatccctac caacgttccc 180

gagctcacct tccagcccag ccccgccccc gacccgcctg gcggcctcac ctactttccc 240

gtggccgacc tgtctatcat cgccgccctc tatgcccgct tcaccgccca gatccgaggc 300

gccgtcgacc tgtccctcta tcctcgagaa gggggtgtct ccagccgtga gctggtgaag 360

aaggtctccg atgtcatatg gaacagcctc agccgctcct acttcaagga tcgggcccac 420

atccagtccc tcttcagctt catcacaggt tggagcccag taggtgggaa tcttatccat 480

gacccacttc ttcaaaaccc tccatggttt acagaaccct tttaagaact gtaagccttg 540

tgaggttcgg caggtgttat tttcctcttt gcagttggga aactgaagcc cagagagggg 600

aaatgatatg ccaaagtcac acacggcatg gcagggctgg aagtgaagcc tgatcacttg 660

gctccaaatc atcaacctca cctctgcccc ctcagcaccc ccacccttgc cactgaacag 720

ctacaggagt tctaagcatg agacacagag ggcggcagca gatttagggg gcaagaagat 780

gaaattgggc tgcatttgag gcagttaaac aaaataatgg ctatgaagat tttttttttt 840

tttttttttg agacagggtc tcactctgtc ccccaggctg gagtgcagtg gtgtgatcat 900

ggctcactgc agcctcagtc tccctgggct cagagatcct ccaacctcag cctcctgagt 960

agctgagagt acaggcatgc accgtggtgc tggttaattt tttgtatttt ttttgtagag 1020

atggtgtctc actatgtggc ccagactggt cttgaactct tgggctcaag tgatctgccc 1080

gcctcagtct cccaaatgct gggattacag gtgtgagcca ccgcaactgg tggcctatga 1140

aaattttttt ttttttttca gacggcgtct cactctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg 1200

tgcaatctcg gctcactgca agctctgcct cctgctttca tgccattctc ctgcctcctg 1260

cctcagcctc ctgagtagct gggactacag gagcctgcca ccatgcctgg ctaatttttt 1320

tttggatttt tagtagagac gaggtttcac catgttagcc aggatggtct cgatctcctg 1380

acctcgtgat ccgcccgcct tggcctccca aagtgctggg attacaggcg tgagccaccg 1440

cacctggtca aaaatgtttg agacagagaa ggggcttgac ctcaaaaggc ttaagagtca 1500

gggcttgcaa agagctttgc accaagcccg gttgactggc aatcccatcc tggtgtgcca 1560

tattgagaag gaatcagagg ctgcttctca gcttagcagg aaaagagtgc agagataaat 1620

gagggttatt tgttggtggg tgtatagcca gagagtgttg gccagcgtcc tgtttttgcc 1680

attcctgttt taacctagta agtgcagtaa aatggaatcc ctaaatccat agaatatata 1740

atagagttgc agagaaagac gaggtagggc caaaggctgg gtcagctaca ggatatccag 1800

aaaggtatct tgttggacat agagggtgta aacagggaga gagtctttga acacgtggga 1860

gggaagggat ggagggatag tgggcaggag aatctgaggt tgggtcacag gcttggaaag 1920

ggagtgggag ggagtgtggc ccatcactac ctggccccct ttccccatgt taaagcacag 1980

aggaccctct ttcattacct cccccttcca caggcaccaa attggacagc tccggtgtgg 2040

cctttgctgt ggttggggcc tgccaggccc tgggtctccg ggatgtccac ctcgccctgt 2100

ctgaggatca tgcctgggta gtgtttgggc ccaatgggga gcagacagct gaggtcacct 2160

ggcacggcaa gggcaacgag gaccgcaggg gccagacagt caatgccggt gtggctgagc 2220

gggtattgtt ccctcccccc agccttgtcc ccttcatact gtagtagccc aagccaccca 2280

agggactcca ttttcttggg ccacacccct ttcttcccat caccacccac ataggaaggg 2340

aagacagaag agcccctttt cctggctgtc attccctgaa gcaggcacag ggtgggccat 2400

catgagacat aatgatctca tcccccccta agagctggct gtacctgaaa ggatcataca 2460

tgcgctgtga ccgcaagatg gaggtggcgt tcatggtgtg tgccatcaac ccttccattg 2520

acctgcacac cgactcgctg gagcttctgc agctgcagca ggtgagggct gagccaatgg 2580

ggcaggactg ggctaggcca gacttgactt gctgtgggac cctgggcagg ggcactttcc 2640

cttcctgagc ttcagcttcc cctcctggaa aaatgggtta gtaattcctg gcctggcctt 2700

tcccagggct cttgggagag tagaattgag atgtgaaatt gctttgactc cattaaaggg 2760

ctggtcccag aattttggcc cttccacatg gtgggtggtc cctgttggtt ctgaccccca 2820

cctctgcccg ataggctaag gacccgttct cctccctgtt ccgtggctca taactctctc 2880

cttcggctcc tagaagctgc tctggctgct ctatgacctg ggacatctgg aaaggaattc 2940

gtaccccatg gccttaggga acctggcaga tctagaggag ctggagccca cccctggccg 3000

gccagaccca ctcaccctct accacaaggt gggggcatct aaggagggtg cagaagggag 3060

accctaacag tggctgaggc aggggccctc atctgggcag atgagaagag aactttgtgt 3120

gttggggggt atcgcccatc cagtctcact ttgtgtcaac tgtgtgcaga atcagttcag 3180

tcagggctgt ctgaggggtg tccagggttc cccagcctgg gagtggcagg ggctgcattt 3240

gtcccctcag ccctgccttt tctgccactg cttactgtcc ttcctggagt ataacagagg 3300

tcaaatgtgg caggagcact gatgaagagg gggtgttcac ttggtgggtg taggtgggga 3360

ggagggccat tgggctgggc ttgaaagtct ttggtgatgt gtagaagagt gtctgagaaa 3420

gagaagggcc ctgagctcgg agggcaggcc ccacccctgc agtctgcccc aggcctcagc 3480

cagcagtcct gtagacccag ggaggagacc aggtagaagg gctggcagcg agtggaggtg 3540

ggagtggaga tggagaggac tccctgggat cttcctgtgg ccccttctgg gtgtgccctg 3600

gtggggcatt tgtgccagca gggcagctgg ggctgcctcc ctgaggatcc tctgcctcac 3660

ctccatccag ggcattgcct cagccaagac ctactatcgg gatgaacaca tctaccccta 3720

catgtacctg gctggctacc actgtcgcaa ccgcaatgtg cgggaagccc tgcaggcctg 3780

ggcggacacg gccactgtca tccaggagtg aggatccccc tactagggcc tgcagcctgt 3840

cctttcttcc cctccatcag tttccaacca ccctcgtcca ggactgaggc ctggctccca 3900

cgccccatcc cctttccatc cagtccctag gcagcaaggc caccattacc caggaggtag 3960

ggaccctgat taaggtgtca catctttccc tccctcccct ctcctcctaa tttttttttt 4020

ctcagaacag tctcaaatct ccaatgttta accaccatca tccagcagtg ggacttccac 4080

cctcggcccc atgcccccct cctcattctt gctttcttcc tctgggctga cccagacagc 4140

atcattttgc agtgaggacc ccacctactc ccccagcccc tgggggctcc atcccccgcc 4200

aggtccctgg ggctaccccc gatggtgaga ccccttcaga ccctacagag accccactgc 4260

tctcacagct acaactactg ccgggaagac gaggagatct acaaggagtt ctttgaagta 4320

gccaatgatg tcatccccaa cctgctgaag gaggcagcca gcttgctgga ggcgggcgag 4380

gagcggccgg gggagcaaag ccaggtgaaa ggctggagct ccagcctgtg tccagcctcc 4440

cacctggaca gggctccctt ccacaggcca tgggggctgc atgtacggga ttagggatgg 4500

caggaggaag gtggccctga gcagacagct atgttccctt ttgctataac tgaggtcctg 4560

ggcccacgtt ggacgggact gaaggtattt tagaggtttc taccctgtgc cttcagtttc 4620

atggccagac tccctccctc agctgagggg tggaggtagg gatggtacgt cctggctatg 4680

gattggcttt ataaaaggaa agaggttcta agaatgttcc caacctatgc ttaccttttc 4740

tggagccagg ggtctttgcc taggtggggg gcctggcctg tgccctctgc taaggggtga 4800

gtaagagact gatctgtgcc ctcccttccc cctcgtccag ggcacccaga gccaaggttc 4860

cgccctccag gaccctgagt gcttcgccca cctgctgcga ttctacgacg gcatctgcaa 4920

atgggaggag ggcagtccca cgcctgtgct gcacgtgggc tgggccacct ttcttgtgca 4980

gtccctaggc cgttttgagg gacaggtgag ggacagctgc acagaggtct gggcactaca 5040

ggtggtgaca gcagccacgg gcttgtcaga cttttctggc ccaggggcag catctgccca 5100

tccccttggg tgccgatggg actgagaccc cctgggtggg atgggatggc cagagcaggg 5160

tcctggagtt ccagccactg gccggcaacc ttgctctcac cttgctctcc ccactggccc 5220

aggtgcggca gaaggtgcgc atagtgagcc gagaggccga ggcggccgag gccgaggagc 5280

cgtggggcga ggaagcccgg gaaggccggc ggcggggccc acggcgggag tccaagccag 5340

aggagccccc gccgcccaag aagccagcac tggacaaggg cctgggcacc ggccagggtg 5400

cagtgtcagg acccccccgg aagcctcctg ggactgtcgc tggcacagcc cgaggccctg 5460

aaggtggcag cacggctcag gtgccagcac ccgcagcatc accaccgccg gagggtccag 5520

tgctcacttt ccagagtgag aagatgaagg gcatgaagga gctgctggtg gccaccaaga 5580

tcaactcgag cgccatcaag ctgcaactca cggcacagtc gcaagtgcag atgaagaagc 5640

agaaagtgtc cacccctagt gactacactc tgtctttcct caagcggcag cgcaaaggcc 5700

tcaagctt 5708