本發(fā)明屬于PCR技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒別豬肺炎支原體、雞滑液支原體、豬鼻支原體的PCR檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

支原體介于病毒和細(xì)菌之間，呈多形性，可通過0.22μm濾膜。動(dòng)物生物制品的生產(chǎn)和檢驗(yàn)中的生產(chǎn)檢驗(yàn)材料很容易被豬肺炎支原體、雞滑液支原體、豬鼻支原體污染，其原因有：(1)使用的生物材料可能攜帶支原體，如豬血清中可能攜帶豬鼻支原體、雞胚中可能攜帶雞滑液支原體；(2)檢驗(yàn)時(shí)使用的陽(yáng)性對(duì)照菌株，如豬肺炎支原體、雞滑液支原體為支原體檢驗(yàn)用的陽(yáng)性對(duì)照，檢驗(yàn)過程中的大量重復(fù)使用可能會(huì)污染實(shí)驗(yàn)室。

一旦生產(chǎn)用材料被上述支原體污染，可能造成嚴(yán)重后果。比如雞滑液支原體引起火雞呼吸道疾病，肺炎支原體和豬鼻支原體引起豬呼吸道疾病。污染的支原體可能會(huì)隨著疫苗的推廣使用大面積感染豬群或雞群，因此建立一種快速擴(kuò)增且準(zhǔn)確鑒定支原體的PCR檢測(cè)試劑盒是極其重要的。

《中國(guó)獸藥典》明確提出支原體培養(yǎng)法可以檢測(cè)支原體污染情況，通過顯微鏡觀察支原體在固體培養(yǎng)基以及支原體在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)指示劑的顏色變化來(lái)判斷，然而需28天周期培養(yǎng)，耗時(shí)費(fèi)力，檢測(cè)成本高，另外，通過固體培養(yǎng)法無(wú)法檢測(cè)污染細(xì)胞的一種最常見的支原體，即豬鼻支原體(M.Hyorhinis)。這是因?yàn)樨i鼻支原體無(wú)法在支原體固體培養(yǎng)基上形成可見的菌落。而豬鼻支原體約占所有支原體污染的20～50％。；另有使用熒光染色法檢測(cè)支原體，但是該方法靈敏度太低，當(dāng)檢測(cè)成陽(yáng)性時(shí)，細(xì)胞經(jīng)常已經(jīng)嚴(yán)重污染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，目的在于提供一種快速鑒別豬肺炎支原體、雞滑液支原體、豬鼻支原體的PCR檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種快速鑒別豬肺炎支原體、雞滑液支原體、豬鼻支原體的PCR檢測(cè)試劑盒，包括：PCR premix緩沖液、超純水、Marker DL2000、上游引物、下游引物、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

上述方案中，所述上游引物的序列為：5’-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3’；所述下游引物的序列為：5’-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3’。

上述方案中，所述陽(yáng)性對(duì)照包括含有雞滑液支原體的T載體質(zhì)粒、含有豬肺炎支原體的T載體質(zhì)粒和含有豬鼻支原體的T載體質(zhì)粒。

上述方案中，所述陰性對(duì)照為超純水。

上述方案中，所述PCR premix緩沖液是由3mmol/μL的MgCl₂，500pmol/μL的dNTP，25mmol/μL的Tris-HCl及0.2μLTaq酶組成，其pH值為8.3。

上述方案中，所述上游引物和下游引物的濃度均為10μmol/L。

上述PCR檢測(cè)試劑盒在快速鑒別豬肺炎支原體、雞滑液支原體和豬鼻支原體中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明中使用含有雞滑液支原體的T載體質(zhì)粒、含有豬肺炎支原體的T載體質(zhì)粒和含有豬鼻支原體的T載體質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，有效避免提取過程中陽(yáng)性菌株對(duì)試劑盒和環(huán)境的污染；并且直接使用有效的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)照相應(yīng)的片段可以快速判斷是哪種支原體污染，具有高效、準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點(diǎn)；(2)本發(fā)明所述PCR試劑盒具有檢測(cè)限低、靈敏度好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，采用本發(fā)明所述PCR試劑盒可以快速檢測(cè)并鑒別豬肺炎支原體、雞滑液支原體和豬鼻支原體，實(shí)際應(yīng)用中，只要通過是否擴(kuò)增出條帶這個(gè)現(xiàn)象就能有效反應(yīng)是否被豬肺炎支原體、雞滑液支原體和豬鼻支原體污染，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為T-Vector pMD20的結(jié)構(gòu)圖。

圖2為豬鼻支原體、雞滑液支原體和豬肺炎支原體的PCR電泳結(jié)果圖，其中M為DL2000 Marker，1為豬鼻支原體，2為豬肺炎支原體，3為雞滑液支原體。

圖3為PCR檢測(cè)試劑盒的敏感性驗(yàn)證的PCR電泳結(jié)果圖，其中M為DL2000 Marker，1～8：豬鼻支原體DNA，模板稀釋度依次為10^-1～10^-8；9-16：豬肺炎支原體DNA，模板稀釋度依次為10^-1～10^-8；17～24：雞滑液支原體DNA，模板稀釋度依次為10^-1～10^-8。

圖4為PCR檢測(cè)試劑盒的特異性驗(yàn)證的PCR電泳結(jié)果圖，其中M為DL2000 Marker，1為豬鼻支原體，2為豬肺炎支原體，3為雞滑液支原體，4為偽狂犬病毒，5為圓環(huán)病毒，6為大腸桿菌，7為健康細(xì)胞IBR，8為陰性對(duì)照。

圖5為PCR檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用驗(yàn)證的PCR電泳結(jié)果圖，其中M為DL2000 Marker，1為豬鼻支原體，2為IBR細(xì)胞，3為BHK細(xì)胞，4為Vero細(xì)胞，5為ST細(xì)胞，6為DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，7為改良Frey支原體培養(yǎng)基，8為陰性對(duì)照，9為可疑支原體培養(yǎng)基。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank中基因序列，挑選實(shí)驗(yàn)室?guī)追N常容易被污染的代表性的支原體陽(yáng)性菌株的序列，通過核酸序列的比對(duì)，選擇部分片段相似度的保守區(qū)段，而不是大量相似度的保守區(qū)段，這樣可以保證遵循不同菌株之間存在有效的差異，同時(shí)部分的相似度可以設(shè)計(jì)出共通的引物，因此通過此區(qū)段的差異性可以有效區(qū)分出不同種屬的支原體片段，并且BLAST比對(duì)中有趣地發(fā)現(xiàn)這對(duì)序列針對(duì)除代表性的支原體外大多數(shù)種屬的支原體均有同源性，設(shè)計(jì)中應(yīng)用DNAStar軟件，遵循引物設(shè)計(jì)的基本原則，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物的序列為：5’-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3’；下游引物的序列為：5’-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3’。

針對(duì)不同的陽(yáng)性對(duì)照分別能區(qū)分?jǐn)U出不同大小的支原體片段，其中擴(kuò)增片段分別為豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)447bp，雞滑液支原體(Mycoplasma synoviae)477bp，豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae))689bp；具體堿基如下：

豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)堿基片段：447bp

雞滑液支原體(Mycoplasma synoviae)堿基片段：477bp

豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae))堿基片段：688bp

實(shí)施例2陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的構(gòu)建

(1)核酸的提?。喝￡?yáng)性菌株的樣品即豬鼻支原體、雞滑液支原體、豬肺炎支原體各200μL，基因組的提取參照TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0提取試劑盒說明書進(jìn)行，將提取的DNA分別于-20℃保存，用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

(2)將豬鼻支原體DNA、雞滑液支原體DNA、豬肺炎支原體DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)在25μL體系中進(jìn)行：Primer1/2各1μL、PCR premix緩沖液12.5μL、基因組模板1μL、ddH₂O加至25μL；PCR反應(yīng)程序如下：94℃5min；94℃30s，57℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。分別取5μL豬鼻支原體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、5μL雞滑液支原體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、5μL豬肺炎支原體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。電泳結(jié)果如圖2所示，從圖中可以清晰地看到豬鼻支原體擴(kuò)增條帶、雞滑液支原體擴(kuò)增條帶、豬肺炎支原體擴(kuò)增條帶。

(3)切取上述PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳中的目的片段用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR片段純化，得到豬鼻支原體PCR純化產(chǎn)物、雞滑液支原體PCR純化產(chǎn)物、豬肺炎支原體PCR純化產(chǎn)物。

(4)將上述豬鼻支原體PCR純化產(chǎn)物、雞滑液支原體PCR純化產(chǎn)物、豬肺炎支原體PCR純化產(chǎn)物分別與T-載體連接，具體方法為，取PCR純化產(chǎn)物5μL，加入T-Vector pMD20 1μL，加入T4連接酶1μL及2×緩沖液10μL，ddH₂O 3μL，16℃連接4小時(shí)；得到豬鼻支原體與T-載體連接的產(chǎn)物、雞滑液支原體與T-載體連接的產(chǎn)物、豬肺炎支原體與T-載體連接的產(chǎn)物。

(5)將上述所得連接產(chǎn)物分別熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10，然后將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有IPTG、X-GAL、氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平皿上，37℃培養(yǎng)12小時(shí)以上，當(dāng)平皿上形成肉眼清晰可見的藍(lán)白斑菌落時(shí)，挑取其中的單個(gè)白斑菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒，用PCR鑒定其中是否插入目的PCR片段；將所得包含豬鼻支原體堿基片段的質(zhì)粒、包含雞滑液支原體堿基片段的質(zhì)粒、包含豬肺炎支原體堿基片段的質(zhì)粒分別擴(kuò)增后分裝作為陽(yáng)性對(duì)照使用。

實(shí)施例3 PCR檢測(cè)試劑盒的敏感性驗(yàn)證

本實(shí)施例所用PCR檢測(cè)試劑盒包括：500μL PCR premix緩沖液、1mL超純水、50μL Marker DL2000、50μL濃度為10μmol/L的上游引物和50μL濃度為10μmol/L的下游引物、20μL陰性對(duì)照、以及20μL陽(yáng)性對(duì)照；所述上游引物的序列為：5’-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3’；所述下游引物的序列為：5’-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3’；所述陽(yáng)性對(duì)照包括含有雞滑液支原體的T載體質(zhì)粒、含有豬肺炎支原體的T載體質(zhì)粒和含有豬鼻支原體的T載體質(zhì)粒；所述陰性對(duì)照為超純水；所述PCR premix緩沖液是由3mmol/μL的MgCl₂，500pmol/μL的dNTP，25mmol/μL的Tris-HCl及0.2μLTaq酶組成，其pH值為8.3。

PCR檢測(cè)試劑盒的敏感性驗(yàn)證的操作步驟如下：

(1)核酸的提?。喝∝i鼻支原體、雞滑液支原體、豬肺炎支原體分別進(jìn)行DNA提取，基因組的提取參照TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0提取試劑盒說明書進(jìn)行；

(2)取提取所得50μL DNA基因組分別做10倍稀釋后作為模板、利用本發(fā)明所述PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，電泳結(jié)果如圖3所示。

PCR檢測(cè)試劑盒的敏感性驗(yàn)證結(jié)果如下表1所述，從表1的結(jié)果可以看出：50μL基因組DNA中每1μL相當(dāng)于4×10⁵CCU，稀釋10⁵后仍然可以擴(kuò)增出目的片段，說明該P(yáng)CR試劑盒的檢測(cè)限度可以達(dá)到4CCU，靈敏性極好。

表1 PCR檢測(cè)試劑盒的敏感性驗(yàn)證結(jié)果

實(shí)施例4 PCR檢測(cè)試劑盒的特異性驗(yàn)證

本實(shí)施例所用PCR檢測(cè)試劑盒同實(shí)施例3。

直接使用實(shí)驗(yàn)室已有的新鮮的豬偽狂犬病毒液，圓環(huán)病毒液作為提取樣；另外選取IBR細(xì)胞作為健康細(xì)胞對(duì)照，直接使用貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好的IBR細(xì)胞在﹣20℃的冰箱里反復(fù)凍融三次，通過高速離心機(jī)10000rpm高速離心獲取上清為健康細(xì)胞提取樣，具體操作參照TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0提取試劑盒說明書，分別獲得有效的豬偽狂犬病毒基因組、圓環(huán)病毒基因組、IBR健康細(xì)胞基因組；另外大腸桿菌基因組的獲得直接使用基因組快速獲得法獲取，將已復(fù)蘇的大腸桿菌菌液直接沸水煮沸10分鐘，迅速放入冰上五分鐘，通過高速離心獲取上清得到有效的大腸桿菌基因組；利用本實(shí)施例所述PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)以上獲取的四種基因組連同三種支原體的基因組分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳跑膠如圖4所示，具體結(jié)果如下表2，從表2展示的結(jié)果可看出：常見病毒、細(xì)菌、健康細(xì)胞的基因組并不會(huì)干擾對(duì)三種支原體的鑒別，該P(yáng)CR試劑盒顯示出很好的特異性。

表2 PCR檢測(cè)試劑盒的特異性驗(yàn)證結(jié)果

實(shí)施例5 PCR檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用驗(yàn)證

本實(shí)施例所用PCR檢測(cè)試劑盒同實(shí)施例3。

將實(shí)驗(yàn)室正在培養(yǎng)的各種檢驗(yàn)細(xì)胞：IBR細(xì)胞、BHK細(xì)胞、Vero細(xì)胞、ST細(xì)胞，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、改良Frey支原體培養(yǎng)基、一瓶多次使用的可疑支原體培養(yǎng)基分別取樣(其中細(xì)胞取樣的方式如實(shí)施例3中描述的一樣，放置于﹣20℃的冰箱里反復(fù)凍融三次，高速離心取上清；培養(yǎng)基液體類直接取樣作為樣品)，提取基因組的具體操作參照TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0提取試劑盒說明書，分別得到有效的基因組，利用本實(shí)施所述PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)這些有效的基因組、連同豬鼻支原體的基因組進(jìn)行PCR檢測(cè)，電泳跑膠如圖5所示，具體結(jié)果如下表3，表3的結(jié)果顯示：一瓶使用過多次的支原體培養(yǎng)基已經(jīng)被豬鼻支原體污染，而檢驗(yàn)用細(xì)胞及培養(yǎng)基都未受到污染。這個(gè)結(jié)果幫助實(shí)驗(yàn)室及時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的污染問題，避免檢測(cè)出現(xiàn)重大偏差。這也說明了所述PCR檢測(cè)試劑盒在實(shí)際應(yīng)用中具有非常高的檢測(cè)靈敏性。

表3 PCR檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用驗(yàn)證結(jié)果

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的實(shí)例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限制。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 武漢科前生物股份有限公司

<120>一種快速鑒別豬肺炎支原體、雞滑液支原體、豬鼻支原體的PCR檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用

<160> 5

<210> 1

<211> 447 bp

<212> DNA

<213>豬鼻支原體基因片段

<400> 1

acaccatggg agttggtaat gcccaaagtc ggtgagttaa cttcggagac cattgcctaa 60

ggcaggactg atgactgggg tgaagtcgta acaaggtatc cctacgagaa cgtggggatg 120

gaacacctcc tttctacgga gtacattagt cttaattgac ttattacata atcgattcgt 180

gtctagtttt gagagcttta agttctcaat tatagttctt tgaaaactga atagcaaata 240

acaatatgat taacttcata tttattattt caacgatctt ttttataacc gagtttaatt 300

tttaaattaa atttctaaaa tagattacca atattaaaat accttaagat atttatcttt 360

agcaataata ggcaatatta aagttgtatt aacttttaaa ttaagtaaga gtatttggtg 420

gatgccttgg gtctgaaagt cgatgaa 447

<210>2

<211> 477bp

<212> DNA

<213>雞滑液支原體基因片段

<400> 2

acccaaggca tccactacac actcttactt ttttaaaagt tagtatcaat atgtcctatt 60

gttatgttgt tatgatgtat tcaaagacat tttaataaat tattattcaa taatttaaac 120

tcggtatcaa aacaaattaa ccttaattaa tttatatttt tgatgtcgtt gtaatatctt 180

tattactatt tagttttcaa agaacaattt taagagaggt tgttctctca aaactaaata 240

caatagccca aggcaaaaaa agcgatacac aaccgctttt agaaaaatct aaaagctttc 300

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ggcagtcgtc tccgaagtta acaaaccgac ttcgggcatt accagctccc atggtgt 477

<210>3

<211> 688bp

<212> DNA

<213>豬肺炎支原體基因片段

<400> 3

atcacgtcct tcatcgactt tcagacccaa ggcatccacc aaatactctt atttatttaa 60

aaagttaaaa ctatttttga gtatagccta ttttgagata atatatctta aggtatttta 120

acaattttag cataatcttt ctttttaatt ttttaatttt caaaaattaa aaagcaaaaa 180

taaactcggt ttaattttta aagatcatta gaatattacc tgatttttca atcagaataa 240

aattgttact attcagtttt gaaagagctg ttttgccttt tggcaatttt ttttgttttg 300

agagctttag agccctcaaa actaggtata tagtccaatt taaaatttta caacaactag 360

attaataaat aatataaata aataaggagg aaatgaatta aaaaaataca aataaaatct 420

ataaaaatct tttaatttaa taaaaagaat aagaataaat aatgaaaatg atgttaaaaa 480

tgtaaaaatt tagaaaaaat ttaatctaat aaaaggtgtg aataaattta tgttttgttt 540

ttggtttttc cgtagaaagg aggtgttcca tccccacgtt ctcgtaggga taccttgtta 600

cgacttcacc ccagtcatcg gtcctgcctt aggcaatggt ctccgaagtt aactcaccga 660

ctttgggcat taccaactcc catggtgt 688

<210>4

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acaccatggg agctggtaat 20

<210>5

<211> 27bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttcatcgac tttcagaccc aaggcat 27