本發(fā)明屬于基因分型技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測人類CYP1A2基因分型的引物及探針、試劑盒、方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞色素P450超家族中，與藥物代謝相關(guān)的代謝酶主要是CYP1、CYP2、CYP3家族。CYP1A2是CYP1A亞家族的重要成員，是人肝臟中最重要的CYP酶之一，占肝臟CYP酶總量的13～15％。CYP1A2在肝組織中有特異性表達(dá)，芳胺、雜環(huán)胺及一些含鹵烴化物均是其重要底物。具有遺傳多態(tài)性，存在個(gè)體、種族差異性，導(dǎo)致不同個(gè)體、種族的藥物代謝能力存在差異。CYP1A2*1F(-163C>A)位于1號內(nèi)含子，突變會(huì)增加CYP1A2的活性。CYP1A2的不同基因型直接影響藥物療效和毒副作用的強(qiáng)弱，因此根據(jù)CYP1A2的基因型來指導(dǎo)準(zhǔn)確、安全用藥具有重要的臨床意義。

用于檢測基因多態(tài)性的方法主要有測序法、PCR-RFLP(聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性)、基因芯片法、熒光定量PCR法。測序法結(jié)果準(zhǔn)確，但成本高、耗時(shí)長。PCR-RFLP通過酶切電泳的方法檢測基因多態(tài)性，成本低、結(jié)果直觀，但操作過程易受污染，導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。基因芯片法通過核酸雜交檢測基因型，優(yōu)點(diǎn)是通量高，缺點(diǎn)是成本較高，操作繁瑣，結(jié)果難判讀。傳統(tǒng)熒光定量PCR法依據(jù)其原理不同可分為熒光PCR探針法和熒光PCR熔解曲線法。前者針對目標(biāo)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩種探針，分別和野生型與突變型匹配，利用擴(kuò)增的Ct值差異來判讀基因型。后者針對目標(biāo)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一種探針，基于探針與目標(biāo)核酸之間雜交的準(zhǔn)確性(即SNP位點(diǎn)上不同堿基造成熔解溫度的差異)來判讀基因型。傳統(tǒng)的熒光定量PCR法檢測的準(zhǔn)確度依賴于探針與對應(yīng)的等位基因之間的親和程度的差別，即其溶解溫度(Tm)的差別，當(dāng)這種差別并不是很大時(shí)，往往導(dǎo)致最終的檢測結(jié)果存在偏差，準(zhǔn)確度不高。隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新，一種基于瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶及雙熒光標(biāo)記探針的新型SNP檢測技術(shù)被開發(fā)出來。該方法采用具有瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶活性的DNA聚合酶，并利用這種聚合酶在切除瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)中的5’端單鏈時(shí)的切割位置位于瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)的雙鏈部分的第一個(gè)堿基和第二個(gè)堿基之間這一特性，結(jié)合修飾有雙重?zé)晒鈽?biāo)記及淬滅基團(tuán)的DNA探針，實(shí)現(xiàn)了用一個(gè)熒光探針檢測目標(biāo)核酸SNP位點(diǎn)上的分型。

目前針對CYP1A2基因分型的檢測方法局限上述基因芯片法、傳統(tǒng)熒光定量PCR探針法，其缺點(diǎn)越來越難以滿足臨床檢驗(yàn)的要求。在利用雙熒光標(biāo)記探針的新型SNP檢測技術(shù)檢測CYP1A2基因分型的研究，還沒有人報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過自主設(shè)計(jì)引物和探針，并結(jié)合基于瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶及雙熒光標(biāo)記探針的新型SNP檢測技術(shù)，提供一種檢測人類CYP1A2基因分型的引物及探針、試劑盒、方法，以解決目前針對CYP1A2基因分型檢測的局限性問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

用于檢測人類CYP1A2基因分型的引物及探針，包含以下核苷酸序列：

上游引物SEQ ID NO:1：5’-AAACTGAGATGATGTGTGGAGG-3’；

下游引物SEQ ID NO:2：5’-CACGCATCAGTGTTTATCAAA-3’；

探針SEQ ID NO:3：5’-GTGGGCCCAGGACGCATGGTAGATGGA-3’。

本發(fā)明提供的引物和探針能準(zhǔn)確檢測到CYP1A2基因突變位點(diǎn)區(qū)域。

本發(fā)明還提出一種檢測人類CYP1A2基因分型的試劑盒，所述試劑盒包含PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括上述引物及探針。

本發(fā)明提供的試劑盒成本低，使用簡單，能準(zhǔn)確檢測CYP1A2基因分型。

本發(fā)明還提供一種利用上述試劑盒檢測人類CYP1A2基因分型的方法，其包括如下步驟：

提取人基因組DNA；

將所述DNA與所述試劑盒配成反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；

根據(jù)所述擴(kuò)增結(jié)果分析所述CYP1A2基因分型。

本發(fā)明提供的檢測CYP1A2基因分型的方法，用一條熒光探針即可檢測目標(biāo)核酸SNP位點(diǎn)上的多種分型，簡化了操作過程，節(jié)約了成本，檢測結(jié)果分辨率高、迅速準(zhǔn)確。

另外，本發(fā)明還提供利用上述試劑盒在檢測CYP1A2基因分型中的用途。該用途可破除現(xiàn)有CYP1A2基因分型檢測的局限性，相對現(xiàn)有技術(shù)，更易滿足臨床檢驗(yàn)的要求。

附圖說明

圖1是CYP1A2基因-163位點(diǎn)野生型檢測結(jié)果圖；

圖2是CYP1A2基因-163位點(diǎn)純合突變型檢測結(jié)果圖；

圖3是CYP1A2基因-163位點(diǎn)雜合型檢測結(jié)果圖；

圖4是CYP1A2基因-163位點(diǎn)純合突變型對比試驗(yàn)檢測結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于檢測人類CYP1A2基因分型的引物及探針，包含以下核苷酸序列：

上游引物SEQ ID NO:1：5’-AAACTGAGATGATGTGTGGAGG-3’；

下游引物SEQ ID NO:2：5’-CACGCATCAGTGTTTATCAAA-3’；

探針SEQ ID NO:3：5’-GTGGGCCCAGGACGCATGGTAGATGGA-3’。

該探針第7個(gè)核苷酸到3’端之間的序列與目標(biāo)核酸上相應(yīng)序列互補(bǔ)，該CYP1A2基因的突變?yōu)閏.-163C>A。本實(shí)施例的引物和探針能準(zhǔn)確檢測CYP1A2基因突變位點(diǎn)區(qū)域。

具體地，在探針5’端和3’端分別用兩種不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記，優(yōu)選地，熒光報(bào)告基團(tuán)選自：FAM、HEX、TET、VIC、ROX、CY5、CY3、JOE、ALEX、CAL；在探針的第8位核苷酸位點(diǎn)用熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記。在本實(shí)施例中，DNA探針的5’端及3’端分別有一個(gè)發(fā)出綠色熒光(FAM)及紅色熒光(VIC)的基團(tuán)雙重標(biāo)記，而在SNP位點(diǎn)的下一個(gè)堿基(沿5’端到3’端的方向地8個(gè)堿基)上修飾有一個(gè)淬滅基團(tuán)(IDT公司的ZEN^TM Internal Quencher)，該淬滅基團(tuán)能夠同時(shí)淬滅綠色熒光基團(tuán)及紅色熒光基團(tuán)的熒光。雙重?zé)晒鈽?biāo)記DNA探針上由SNP位點(diǎn)到其3’端之間的序列與目標(biāo)核酸上相應(yīng)序列互補(bǔ)，而由SNP位點(diǎn)到其5’端之間的序列與目標(biāo)核酸上相應(yīng)序列不互補(bǔ)，因此形成瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)。

本發(fā)明實(shí)施例還提供一種檢測人類CYP1A2基因分型的試劑盒，該試劑盒包含由上述引物及探針組成的PCR反應(yīng)液，其中：上游引物濃度為：0.1-0.5μM；下游引物濃度為：0.1-0.5μM；探針濃度為：0.1-0.5μM。具體在本實(shí)施例中，上游引物0.5μM；下游引物0.5μM；探針0.5μM。該試劑盒成本低，使用簡單，能準(zhǔn)確檢測CYP1A2基因分型。

具體地，該試劑盒還含有dNTPs，MgCl₂。其中dNTPs濃度為：0.2-0.5mM；MgCl₂濃度為：0.5-2.5mM；本實(shí)施例中，優(yōu)選dNTPs 0.5mM；MgCl₂ 2.5mM。具體地，該試劑盒還包含UNG酶和DNA聚合酶，該DNA聚合酶具有瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶活性。

由于DNA聚合酶具有瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶活性，當(dāng)正向引物被延伸至熒光探針處時(shí)，熒光探針上不與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列會(huì)被聚合酶切除。切割位置在瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)的雙鏈部分的第一個(gè)堿基和第二個(gè)堿基之間。當(dāng)目標(biāo)核酸上SNP位點(diǎn)的堿基與熒光探針上的對應(yīng)堿基互補(bǔ)時(shí)，則在SNP位點(diǎn)和下一個(gè)堿基之間切除。因此，綠色熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生綠色熒光。隨著聚合酶繼續(xù)切割熒光探針上與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列，淬滅基團(tuán)也與另一端的紅色熒光基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生紅色熒光。因此，在綠色熒光基團(tuán)與紅色熒光基團(tuán)的發(fā)光效率大致上相同的情況下，若目標(biāo)核酸上的SNP位點(diǎn)的堿基與熒光探針上的對應(yīng)堿基互補(bǔ)，測得的綠色熒光的強(qiáng)度與紅色熒光的強(qiáng)度大致上相等。當(dāng)目標(biāo)核酸的SNP位點(diǎn)上的堿基與熒光探針上相應(yīng)位置的堿基不互補(bǔ)時(shí)，聚合酶在熒光探針上進(jìn)行切割的位置在修飾有淬滅基團(tuán)的堿基之后。因此，在熒光探針上不與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列被切除下來之后，綠色熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)仍保留在該被切除下來的序列上，因此綠色熒光基團(tuán)的熒光仍舊被淬滅基團(tuán)淬滅，從而不產(chǎn)生綠色熒光，但淬滅基團(tuán)與紅色熒光基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生紅色熒光，此時(shí)測得的綠色熒光的強(qiáng)度與紅色熒光的強(qiáng)度相比可忽略不計(jì)。當(dāng)核酸樣本中同時(shí)含有一半的SNP位點(diǎn)的堿基與熒光探針上的對應(yīng)堿基互補(bǔ)的目標(biāo)核酸和另一半的SNP位點(diǎn)的堿基不與熒光探針上的對應(yīng)堿基互補(bǔ)的目標(biāo)核酸，在這種情況下，SNP位點(diǎn)的堿基與熒光探針上的對應(yīng)堿基互補(bǔ)的目標(biāo)核酸同時(shí)產(chǎn)生綠色熒光和紅色熒光，而SNP位點(diǎn)的堿基不與熒光探針上的對應(yīng)堿基互補(bǔ)的目標(biāo)核酸只產(chǎn)生紅色熒光。由于兩種目標(biāo)核酸的含量相等，在綠色熒光基團(tuán)與紅色熒光基團(tuán)的發(fā)光效率大致上相同的情況下，測得的所述綠色熒光的強(qiáng)度約為紅色熒光的強(qiáng)度的一半。

本實(shí)施例的試劑盒檢測SNP的特異性來源于具有瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶活性的DNA聚合酶切除瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)時(shí)的切割位置的準(zhǔn)確性，而不是基于DNA探針與目標(biāo)核酸之間的雜交的準(zhǔn)確性(即SNP位點(diǎn)上不同堿基造成熔解溫度的差異)，因此，該試劑盒檢測SNP的準(zhǔn)確性和可靠性顯著地高于現(xiàn)有技術(shù)。

本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒反應(yīng)體系采用UNG-dUTP防污染系統(tǒng)，其中，所屬UNG酶可以選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失堿基的DNA鏈，在堿性介質(zhì)以及高溫下會(huì)進(jìn)一步水解斷裂，因此在反應(yīng)體系中加入適量dUTP，在PCR擴(kuò)增前，利用UNG酶作用能有效防止實(shí)驗(yàn)室內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)致的污染，從而對整個(gè)檢測體系包括樣品的濃度、干擾因素進(jìn)行質(zhì)量控制。且在95℃時(shí)UNG酶可被滅活，不影響后續(xù)PCR擴(kuò)增效果。

更具體地，本發(fā)明實(shí)施例試劑盒設(shè)置有陽性對照品和陰性對照品，陽性對照品包含兩種質(zhì)粒，陰性對照品為TE緩沖液。該兩種質(zhì)粒分別包含CYP1A2基因的-163C野生型核酸序列和-163A突變型核酸序列。兩種質(zhì)粒按摩爾濃度比1：1的比例組成。通過陽性、陰性對照，使本實(shí)施例技術(shù)方法更加準(zhǔn)確真實(shí)。

本發(fā)明實(shí)施例還提供一種檢測人類CYP1A2基因分型的方法，其包括如下步驟：

提取人基因組DNA；

將DNA與上述試劑盒配成反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果分析CYP1A2基因分型。

具體地，該反應(yīng)體系為40ul。其中，DNA質(zhì)量：10-500ng，優(yōu)選100ng；PCR反應(yīng)液34.5ul，混合酶0.5ul。熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃2min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s；62℃延伸45s；35個(gè)循環(huán)。

本方法利用瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶結(jié)合雙重?zé)晒鈽?biāo)記DNA探針進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了用一條熒光探針檢測目標(biāo)核酸SNP位點(diǎn)上的多種分型，簡化了操作、節(jié)約了成本?；谠摲椒?，準(zhǔn)確檢測CYP1A2基因分型。

最后，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明人能理所當(dāng)然想到上述試劑盒在檢測CYP1A2基因分型中的用途。該用途可破除現(xiàn)有CYP1A2基因分型檢測的局限性，相對現(xiàn)有技術(shù)，更易滿足臨床檢驗(yàn)的要求。

本發(fā)明先后進(jìn)行過多次試驗(yàn)，現(xiàn)舉一部分試驗(yàn)結(jié)果作為參考對發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1檢測人類CYP1A2基因分型的試劑盒

引物和探針設(shè)計(jì)

發(fā)明人根據(jù)NCBI人CYP1A2基因序列，設(shè)計(jì)能檢測-163位點(diǎn)基因多態(tài)性的引物和探針核苷酸序列如下：

上游引物SEQ ID NO:1：5’-AAACTGAGATGATGTGTGGAGG-3’；

下游引物SEQ ID NO:2：5’-CACGCATCAGTGTTTATCAAA-3’；

探針SEQ ID NO:3：5’-GTGGGCCCAGGACGCATGGTAGATGGA-3’。

其中，探針第7個(gè)核苷酸到3’端之間的序列與目標(biāo)核酸上相應(yīng)序列互補(bǔ)，探針用雙熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記，其5’端用FAM標(biāo)記，3’端用VIC標(biāo)記，探針第8位T標(biāo)記淬滅基團(tuán)ZEN^TMInternal Quencher。

CYP1A2熒光定量PCR反應(yīng)液的配制

本實(shí)施例PCR反應(yīng)液濃度配置如下：緩沖液，dNTPs(含dUTP)0.5mM；MgCl₂ 2.5mM；上游引物0.5μM；下游引物0.5μM；探針0.5μM。

混合酶

試劑盒中，所用混合酶由尿嘧啶糖基化酶(UNG酶)和DNA聚合酶混合而成，其中，DNA聚合酶為具有瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶活性的DNA聚合酶，選自New England Biolabs公司的Taq DNA聚合酶。該組成的混合酶活性濃度為2-4U。

對照品

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫CYP1A2基因-163位點(diǎn)基因多態(tài)性設(shè)計(jì)陽性對照品序列，合成序列，構(gòu)建DNA重組質(zhì)粒。CYP1A2陽性對照品包括2種質(zhì)粒分別為-163C野生型、-163A突變型。具體是由-163C野生型、-163A突變型重組質(zhì)粒按1:1混合而成。且陰性對照品為TE緩沖液。

根據(jù)上述的PCR反應(yīng)液、混合酶、對照品即組成本實(shí)施例提供的用于檢測人類CYP1A2基因分型的試劑盒。

需要說明的是：PCR反應(yīng)液中各組分的含量不限于上述濃度，只要滿足如下都可用于后續(xù)試驗(yàn)，即：dNTPs濃度0.2-0.5mM；MgCl₂濃度0.5-2.5mM；上游引物濃度0.1-0.5μM；下游引物濃度0.1-0.5μM；探針濃度0.1-0.5μM。

實(shí)施例2CYP1A2基因分型的熒光定量PCR檢測及分析

(一)人血液樣本基因組DNA的提取

本實(shí)施例利用深圳華因康基因科技有限公司寶安分公司生產(chǎn)的血液基因組提取純化試劑盒提取樣本DNA，具體操作如下：

(1)從提取試劑盒中取出1.5ml離心管若干個(gè)，每個(gè)管加入抗凝血200μl。

(2)加入500μl緩沖液CLG溶液到抗凝血中，蓋緊離心管蓋，漩渦震蕩20s以上，充分顛倒混勻，必須充分混勻或漩渦震蕩以確保釋放基因組DNA。

(3)加入100μl緩沖液PP溶液，漩渦震蕩或來回顛倒10s。

(4)12,000g離心5min。

(5)從提取試劑盒中取出DNA純化柱，將步驟(4)中的上清液轉(zhuǎn)移至純化柱，8000g離心1min。為提高DNA提取量，離心后，濾液可再回倒離心一次。

(6)倒棄過柱后濾液，將DNA純化柱放入同一收集管中，往純化柱中加入750μl緩沖液WⅠ，室溫放置2min后，8000g離心1min(確認(rèn)緩沖液WⅠ已加入無水乙醇)。

(7)倒棄過柱后濾液，往純化柱中加入750μl Buffer緩沖液WⅡ，8000g離心1min(確認(rèn)緩沖液WⅡ已加入無水乙醇)。

(8)倒棄過柱后濾液，將純化柱12,000g離心2min。

(9)將純化柱轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，室溫放置5min充分揮發(fā)乙醇。加70～100μl收集液EB(收集液EB預(yù)熱到65℃有利于提高DNA的洗脫效率)，室溫放置1min,12,000離心2min洗脫基因組DNA?？蓪⑦^柱后的洗脫液吸出再加到純化柱膜上，室溫放置1min,12,000g離心1min可以提高DNA的洗脫量。

最后，基因組DNA的濃度和質(zhì)量通過微量紫外分光光度計(jì)測定OD₂₆₀和OD₂₈₀吸光值(德國Implen的NanoPhotometerTMP-Clas微量分光光度計(jì)、北京凱奧科技發(fā)展有限公司的K2800核酸分析儀)，DNA濃度在2ng/μl～100ng/μl；OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.5～2.0之間，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

純化的DNA樣本在4℃保存不超過7天；未能及時(shí)檢測的DNA樣本于-20℃保存，保存時(shí)間不超過3個(gè)月；純化DNA樣本反復(fù)凍融不超過5次。

(二)試劑準(zhǔn)備

從試劑盒中取出PCR反應(yīng)液，在冰上解凍，計(jì)算每個(gè)反應(yīng)體系所需要的PCR反應(yīng)管數(shù)，管數(shù)為N(N＝n樣本數(shù)+1陰性對照+1陽性對照，N≥3)。按下表1分別取計(jì)算量的PCR反應(yīng)液和混合酶到合適的離心管中，顛倒混勻10次，2000g離心10秒，標(biāo)記不同的反應(yīng)體系。

表1

(三)加樣

陽性對照和陰性對照取出，在冰上解凍，在渦旋振蕩器混勻，2000g離心10秒。向所設(shè)定的PCR反應(yīng)管中分別加入樣本、陽性對照、陰性對照各5ul，蓋緊管蓋，并做好記錄?；靹蚋鱌CR反應(yīng)管中的PCR反應(yīng)體系和所加的樣本。將PCR反應(yīng)管2000g離心10秒。轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)，置于PCR儀上，記錄樣本擺放順序。

需要說明的是，上述樣本、陽性對照DNA質(zhì)量濃度在2ng/μl～100ng/μl之間，即每個(gè)反應(yīng)體系為10-500ng都可以滿足試驗(yàn)要求。

(四)PCR擴(kuò)增

ABI7500熒光定量PCR儀，選擇FAM(Reporter:FAM；Quencher:none)檢測通道；VIC(Reporter:VIC；Quencher:none)檢測通道。參比熒光(Passive Reference)設(shè)置為None，閾值線設(shè)為50000。

PCR擴(kuò)增程序：50℃2min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s；62℃延長45s；35個(gè)循環(huán)，在62℃45s時(shí)收集熒光，即熒光收集設(shè)置在“步驟3：62℃，45s”。

(五)檢測結(jié)果分析

如反應(yīng)體系檢測結(jié)果在VIC檢測通道無Ct或Ct大于37.5，則判斷樣本的基因組DNA濃度低于檢測限。當(dāng)反應(yīng)體系檢測結(jié)果在VIC檢測通道Ct小于或等于37.5的情況下，按以下表2判斷(即比較樣本FAM通道和VIC通道的熒光強(qiáng)度)，CYP1A2基因分型如下表3所示。

表2

表3

在本實(shí)施例檢測結(jié)果中，CYP1A2基因-163位點(diǎn)的檢測結(jié)果有3種。如圖1所示：FAM熒光強(qiáng)度和VIC通道熒光強(qiáng)度相近，即-163位點(diǎn)為CC野生型；如圖2所示：FAM通道熒光強(qiáng)度相比VIC通道熒光強(qiáng)度可忽略不計(jì)，即-163位點(diǎn)為AA純合突變型；如圖3所示：FAM熒光強(qiáng)度為VIC通道熒光強(qiáng)度一半，即-163位點(diǎn)為CA雜合型。

本實(shí)施例設(shè)計(jì)了普通TaqMan探針進(jìn)行對比試驗(yàn)，針對野生(FAM標(biāo)記)及突變位點(diǎn)(VIC標(biāo)記)分別設(shè)計(jì)普通TaqMan探針。檢測純合突變型樣本的結(jié)果如圖4所示，F(xiàn)AM標(biāo)記的野生型匹配探針有明顯擴(kuò)增信號(理論上此時(shí)應(yīng)該沒有擴(kuò)增信號或可忽略不計(jì))，其結(jié)果相對本發(fā)明所設(shè)計(jì)的雙標(biāo)記探針準(zhǔn)確性明顯降低。

由此可知，該CYP1A2基因分型檢測方法，具有操作簡單、迅速、分辨率高、結(jié)果更準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。