本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及PCR熒光探針技術(shù)，尤其涉及一種檢測人CYP3A4基因分型的試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450proteins,CYP)是一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白組成的結(jié)構(gòu)和功能相似，由超家族基因編碼的同工酶。CYP是一類位于人細(xì)胞微粒體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的單加氧酶，參與催化內(nèi)源物質(zhì)，如甾體、膽汁酸、脂肪酸、生物源性氨類等的代謝，也代謝外源物質(zhì)包括大多數(shù)藥物。細(xì)胞色素P450廣泛分布于人體的各器官，主要分布在人的肝臟和腸道中。其催化機(jī)理是原藥在肝臟內(nèi)經(jīng)氧化、還原、水解反應(yīng)脫去或增加一些功能基團(tuán)使其變?yōu)闃O性較高的代謝產(chǎn)物，隨尿液直接排出或進(jìn)一步與葡萄糖醛酸、氨基酸、硫酸乙酰基、肽或甲基等結(jié)合再隨尿液排出。

細(xì)胞色素P450超家族中，與藥物代謝相關(guān)的代謝酶主要是CYP1、CYP2、CYP3家族。其中，CYP3A4是CYP3A亞家族的重要成員，是細(xì)胞色素P450酶系中表達(dá)量最大的酶，占人體肝微粒體CYP酶總含量的30％左右，有50％的藥物通過其進(jìn)行代謝。CYP3A4是CYP3A具有遺傳多態(tài)性，存在個體、種族差異性，導(dǎo)致不同個體、種族的藥物代謝能力存在差異。其中，CYP3A4*1B是5＇側(cè)翼、轉(zhuǎn)錄起始位點-290bp的A→G的突變，CYP3A4*3引起編碼區(qū)M445T的改變，都使得CYP3A4酶活性降低。CYP3A4的不同基因型直接影響藥物療效和毒副作用的強(qiáng)弱，因此根據(jù)CYP3A4的基因型來指導(dǎo)準(zhǔn)確、安全用藥具有重要的臨床意義。

目前用于檢測基因多態(tài)性的方法主要有測序法、PCR-RFLP(聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性)、基因芯片法、熒光定量PCR法。測序法結(jié)果準(zhǔn)確，但成本高、耗時長。PCR-RFLP通過酶切電泳的方法檢測基因多態(tài)性，成本低、結(jié)果直觀，但操作過程易受污染，導(dǎo)致錯誤結(jié)果。基因芯片法通過核酸雜交檢測基因型，優(yōu)點是通量高，缺點是成本較高，操作繁瑣，結(jié)果難判讀。熒光定量PCR法具有操作簡單、耗時短、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點，目前熒光定量PCR正在臨床檢查中得到越來越廣泛的應(yīng)用。依據(jù)其原理不同可分為熒光PCR探針法和熒光PCR熔解曲線法。前者針對目標(biāo)SNP位點設(shè)計兩種探針，分別和野生型與突變型匹配，利用擴(kuò)增的Ct值差異來判讀基因型。后者針對目標(biāo)SNP位點設(shè)計一種探針，基于探針與目標(biāo)核酸之間雜交的準(zhǔn)確性(即SNP位點上不同堿基造成熔解溫度的差異)來判讀基因型。但是上述方法通常需要設(shè)計多個熒光探針才能實現(xiàn)目標(biāo)核酸SNP位點上的兩種分型。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測人CYP3A4基因分型的試劑盒及其檢測方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)難以實現(xiàn)CYP3A4基因分型的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種檢測人CYP3A4基因分型的試劑盒，所述試劑盒包括反應(yīng)液1和反應(yīng)液2，所述反應(yīng)液1包括針對CYP3A4基因CYP3A4*1B位點的引物、探針，所述反應(yīng)液2包括針對CYP3A4*3位點的引物、探針，其中，所述CYP3A4基因CYP3A4*1B位點、CYP3A4*3位點的引物序列如下：

CYP3A4基因CYP3A4*1B位點

上游引物CYP3A4*1BFP：5’-GAGTCTTCTAGGGGGCACAGGC-3’；

下游引物CYP3A4*1BRP：5’-GTTACTGGGGAGTCCAAGGGT-3’；

CYP3A4基因CYP3A4*3位點

上游引物CYP3A4*3FP：5’-TAACTTTTTAAAAATCTACC-3’；

下游引物CYP3A4*3RP：5’-TTTACAAGGTTTGAAGGAGA-3’，

所述探針的5’端、3’端均標(biāo)記有熒光基團(tuán)，且所述5’端和3’端的熒光基團(tuán)不同；

所述試劑盒還包括DNA聚合酶，且所述DNA聚合酶為具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶。

以及，一種檢測人CYP3A4基因分型的檢測方法，包括以下步驟：

提取人全血基因組DNA和上述試劑盒；

按人全血基因組DNA提取液加入所述試劑盒的反應(yīng)體系中，其中，所述人全血基因組DNA提取液和所述反應(yīng)體系的比例比為1：8；

PCR擴(kuò)增；

結(jié)果判定。

本發(fā)明提供的檢測人CYP3A4基因分型的試劑盒，采用具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶，并利用這種聚合酶在切除瓣狀結(jié)構(gòu)中的5’端單鏈時的切割位置位于瓣狀結(jié)構(gòu)的雙鏈部分的第一個堿基和第二個堿基之間這一特性，同時結(jié)合修飾有雙重?zé)晒鈽?biāo)記及淬滅基團(tuán)的雙標(biāo)記熒光DNA探針和特異性引物，通過實時PCR反應(yīng)在單管中進(jìn)行SNP檢測，確定CYP3A4基因CYP3A4*1B位點的基因多態(tài)性和/或CYP3A4*3位點的基因多態(tài)性，實現(xiàn)用一個熒光探針檢測目標(biāo)核酸SNP位點上的兩種分型，且檢測結(jié)果具有分辨率高、迅速、準(zhǔn)確的優(yōu)點。本發(fā)明提供的檢測人CYP3A4基因分型的檢測方法，檢測SNP的特異性來源于具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶切除瓣狀結(jié)構(gòu)時的切割位置的準(zhǔn)確性，相比之前的熒光PCR熔解曲線法更為準(zhǔn)確。因此該方法在進(jìn)行基因分型上相比傳統(tǒng)的熒光定量PCR顯示出了優(yōu)勢。此外，本發(fā)明方法具有操作簡單、迅速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例8中CYP3A4的CYP3A4*1B位點AA純合野生樣本檢測結(jié)果圖；

圖2是本發(fā)明實施例8中CYP3A4的CYP3A4*1B位點GG純合突變樣本檢測結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明實施例8中CYP3A4的CYP3A4*1B位點AG雜合樣本檢測結(jié)果圖；

圖4是本發(fā)明實施例8中CYP3A4的CYP3A4*3位點CC純合野生樣本檢測結(jié)果圖；

圖5是本發(fā)明實施例8中CYP3A4的CYP3A4*3位點TT純合突變樣本檢測結(jié)果圖；

圖6是本發(fā)明實施例8中CYP3A4的CYP3A4*3位點CT雜合樣本檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實施例所述檢測人CYP3A4基因分型的試劑盒，采用的技術(shù)原理是基于熒光PCR探針法，利用具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶，根據(jù)待檢測位點設(shè)計特異引物、特異性的雙標(biāo)記熒光探針。

本發(fā)明實施例提供了一種檢測人CYP3A4基因分型的試劑盒，所述試劑盒包括反應(yīng)液1和反應(yīng)液2，所述反應(yīng)液1包括針對CYP3A4基因CYP3A4*1B位點的引物、探針，所述反應(yīng)液2包括針對CYP3A4*3位點的引物、探針，其中，所述CYP3A4基因CYP3A4*1B位點、CYP3A4*3位點的引物序列如下：

CYP3A4基因CYP3A4*1B位點

上游引物CYP3A4*1BFP：5’-GAGTCTTCTAGGGGGCACAGGC-3’；

下游引物CYP3A4*1BRP：5’-GTTACTGGGGAGTCCAAGGGT-3’；

CYP3A4基因CYP3A4*3位點

上游引物CYP3A4*3FP：5’-TAACTTTTTAAAAATCTACC-3’；

下游引物CYP3A4*3RP：5’-TTTACAAGGTTTGAAGGAGA-3’，

所述探針的5’端、3’端均標(biāo)記有熒光基團(tuán)，且所述5’端和3’端的熒光基團(tuán)不同；

所述試劑盒還包括DNA聚合酶，且所述DNA聚合酶為具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶。

本發(fā)明實施例所述探針的5’端、3’端均標(biāo)記有熒光基團(tuán)，且5’端、3’端的熒光基團(tuán)不同。如當(dāng)雙重?zé)晒鈽?biāo)記DNA探針的5’端及3’端分別修飾有一個發(fā)出綠色熒光(如熒光素FAM)及紅色熒光(如VIC)的基團(tuán)，而在SNP位點的下一個堿基(沿5’端到3’端的方向)上修飾有一個淬滅基團(tuán)(如IDT公司的ZENTM Internal Quencher)，該淬滅基團(tuán)能夠同時淬滅綠色熒光基團(tuán)及紅色熒光基團(tuán)的熒光，因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)之前，該DNA探針是不發(fā)出任何熒光的。雙重?zé)晒鈽?biāo)記DNA探針上由SNP位點到其3’端之間的序列與目標(biāo)核酸上相應(yīng)序列互補(bǔ)，而由SNP位點到其5’端之間的序列與目標(biāo)核酸上相應(yīng)序列不互補(bǔ)，因此形成瓣狀結(jié)構(gòu)，即部分為雙鏈、部分為單鏈的“Y”形結(jié)構(gòu)。由于所述DNA聚合酶具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性，當(dāng)正向引物被延伸至熒光探針處時，熒光探針上不與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列會被聚合酶切除，即具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的所述DNA聚合酶能夠?qū)隊罱Y(jié)構(gòu)中的5’端單鏈部分切除，切割位置在瓣狀結(jié)構(gòu)的雙鏈部分的第一個堿基和第二個堿基之間。當(dāng)目標(biāo)核酸上SNP位點的堿基與熒光探針上的對應(yīng)堿基互補(bǔ)時，則在SNP位點和下一個堿基之間切除。因此，綠色熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生綠色熒光。隨著聚合酶繼續(xù)切割熒光探針上與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列，淬滅基團(tuán)也與另一端的紅色熒光基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生紅色熒光。因此，在綠色熒光基團(tuán)與紅色熒光基團(tuán)的發(fā)光效率大致上相同的情況下，若目標(biāo)核酸上的SNP位點的堿基與熒光探針上的對應(yīng)堿基互補(bǔ)，測得的綠色熒光的強(qiáng)度與紅色熒光的強(qiáng)度大致上相等。當(dāng)目標(biāo)核酸的SNP位點上的堿基熒光探針上相應(yīng)位置的堿基不互補(bǔ)時，聚合酶在熒光探針上進(jìn)行切割的位置在修飾有淬滅基團(tuán)的堿基之后。因此，在熒光探針上不與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列被切除下來之后，綠色熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)仍保留在該被切除下來的序列上，因此綠色熒光基團(tuán)的熒光仍舊被淬滅基團(tuán)淬滅，從而不產(chǎn)生綠色熒光。但淬滅基團(tuán)與紅色熒光基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生紅色熒光。因此，若目標(biāo)核酸上的SNP位點的堿基與熒光探針上的對應(yīng)堿基不互補(bǔ)，測得的綠色熒光的強(qiáng)度與紅色熒光的強(qiáng)度相比可忽略不計。當(dāng)核酸樣本中同時含有一半的SNP位點的堿基與熒光探針上的對應(yīng)堿基互補(bǔ)的目標(biāo)核酸和一半的SNP位點的堿基不與熒光探針上的對應(yīng)堿基互補(bǔ)的目標(biāo)核酸。在這種情況下，SNP位點的堿基與熒光探針上的對應(yīng)堿基互補(bǔ)的目標(biāo)核酸同時產(chǎn)生綠色熒光和紅色熒光，而SNP位點的堿基不與熒光探針上的對應(yīng)堿基互補(bǔ)的目標(biāo)核酸只產(chǎn)生紅色熒光。由于兩種目標(biāo)核酸的含量相等，在綠色熒光基團(tuán)與紅色熒光基團(tuán)的發(fā)光效率大致上相同的情況下，測得的所述綠色熒光的強(qiáng)度約為紅色熒光的強(qiáng)度的一半。

可見，本發(fā)明實施例利用具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的所述DNA聚合酶結(jié)合雙重?zé)晒鈽?biāo)記DNA探針進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，實現(xiàn)了用一條熒光探針檢測目標(biāo)核酸SNP位點上的兩種分型，簡化了操作、節(jié)約了成本。另外由于該方法檢測SNP的特異性來源于具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶切除瓣狀結(jié)構(gòu)時的切割位置的準(zhǔn)確性，而不是基于DNA探針與目標(biāo)核酸之間的雜交的準(zhǔn)確性(即SNP位點上不同堿基造成熔解溫度的差異)，因此，該方法檢測SNP的準(zhǔn)確性和可靠性顯著地高于現(xiàn)有技術(shù)。

進(jìn)一步的，經(jīng)過發(fā)明人仔細(xì)研究，優(yōu)選下述具有特異性的探針系列，具體的，所述CYP3A4基因CYP3A4*1B位點和CYP3A4*3位點的探針序列如下：

CYP3A4基因CYP3A4*1B位點

探針CYP3A4*1BA：5’-CAAGGGCAAGAGAGAGGCGATTTAATA-3’；

CYP3A4基因CYP3A4*3位點

探針CYP3A4*3C：5’-TTGGCACGAGGTTTGCTCTCATGAAC-3’；

所述探針的5’端、3’端分別采用FAM、HEX、TET、VIC、ROX、CY5、CY3、JOE、ALEX、CAL、Fluor熒光基團(tuán)中的一種進(jìn)行標(biāo)記；

所述探針CYP3A4*1BA的第10位G位點標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，所述探針CYP3A4*3C的第8位G位點標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。

本發(fā)明實施例所用的雙重?zé)晒鈽?biāo)記DNA探針CYP3A4*1BA、CYP3A4*3C與其目標(biāo)序列SNP位點對應(yīng)位置的堿基(設(shè)置為A和C，即純合型和野生型)相同，SNP位點的下一個堿基標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)。例如探針CYP3A4*1BA的5’端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記VIC，第10位G位點標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)ZEN^TM Internal Quencher。當(dāng)目標(biāo)核酸是野生型時，即為AA型，則可在FAM通道和VIC通道同時檢測到強(qiáng)度大致相等的熒光信號。當(dāng)目標(biāo)核酸是突變型時，即為GG型，則可在VIC通道檢測到熒光信號，F(xiàn)AM通道的綠色熒光的強(qiáng)度很微弱，與紅色熒光的強(qiáng)度相比可忽略不計。當(dāng)目標(biāo)核酸為雜合型，即為AG型，則FAM通道的綠色熒光強(qiáng)度為VIC通道的紅色熒光強(qiáng)度的一半。即實現(xiàn)了一條探針檢測CYP3A4基因CYP3A4*1B位點的兩種基因型，相比傳統(tǒng)的熒光PCR探針法(利用兩種探針分別對應(yīng)兩種基因型)，簡化了操作、節(jié)約了成本。相應(yīng)的，另一條探針，即CYP3A4*3C，在其兩端分別標(biāo)記上不同的熒光基團(tuán)后(例如5’端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記VIC，第8位G位點標(biāo)記ZEN^TM Internal Quencher)后，即可檢測CYP3A4基因CYP3A4*3位點的兩種基因型。另外，基于具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶切除瓣狀結(jié)構(gòu)時的切割位置的準(zhǔn)確性，使得本方法的檢測準(zhǔn)確性高于傳統(tǒng)熒光PCR探針法。

作為一個具體優(yōu)選實施例，所述試劑盒還包括UNG酶(尿嘧啶糖基化酶)，所述UNG酶和DNA聚合酶混合形成酶混合物。本發(fā)明實施例所述試劑盒反應(yīng)體系采用UNG-dUTP防污染系統(tǒng)，其中，所述UNG酶可以選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失堿基的DNA鏈，在堿性介質(zhì)以及高溫下會進(jìn)一步水解斷裂，因此在反應(yīng)體系中加入適量dUTP，在PCR擴(kuò)增前，利用UNG酶作用能有效防止實驗室內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)致的污染，從而對整個檢測體系包括樣品的濃度、干擾因素進(jìn)行質(zhì)量控制。且在95℃時UNG酶可被滅活，不影響后續(xù)PCR擴(kuò)增效果。其中，所述DNA聚合酶選用具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶，本發(fā)明實施例具體優(yōu)選New England Biolabs公司的Taq DNA聚合酶。該優(yōu)選的混合酶體系，不僅可以通過DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時，還可以通過所述UNG酶消除污染，從而更好地保證了實驗的成功率和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

此外，本發(fā)明實施例所述試劑盒中，所述反應(yīng)液1和/或所述反應(yīng)液2包括緩沖液、dNTPs(含dUTP)、MgCl₂。

為了進(jìn)行對比說明，本發(fā)明實施例所述試劑盒設(shè)置有陽性對照品和陰性對照品，所述陽性對照品包含4種質(zhì)粒，所述陰性對照品為TE緩沖液；其中，所述4種質(zhì)粒分別為CYP3A4基因CYP3A4*1B位點A和G檢測位點重組質(zhì)粒、CYP3A4基因CYP3A4*3位點C和T檢測位點重組質(zhì)粒。更具體的，所述CYP3A4陽性對照品包括CYP3A4陽性對照品1和CYP3A4陽性對照品2，其中，所述CYP3A4陽性對照品1由CYP3A4基因CYP3A4*1B位點A和G檢測位點重組質(zhì)粒按1：1的比例組成，所述CYP3A4陽性對照品2由CYP3A4基因CYP3A4*3位點C和T檢測位點重組質(zhì)粒按1：1的比例組成。

本發(fā)明實施例提供的檢測人CYP3A4基因分型的試劑盒，采用具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶，并利用這種聚合酶在切除瓣狀結(jié)構(gòu)中的5’端單鏈時的切割位置位于瓣狀結(jié)構(gòu)的雙鏈部分的第一個堿基和第二個堿基之間這一特性，同時結(jié)合修飾有雙重?zé)晒鈽?biāo)記及淬滅基團(tuán)的雙標(biāo)記熒光DNA探針和特異性引物，通過實時PCR反應(yīng)在單管中進(jìn)行SNP檢測，確定CYP3A4基因CYP3A4*1B位點的基因多態(tài)性和/或CYP3A4*3位點的基因多態(tài)性，實現(xiàn)用一個熒光探針檢測目標(biāo)核酸SNP位點上的兩種分型，且檢測結(jié)果具有分辨率高、迅速、準(zhǔn)確的優(yōu)點。

以及，一種檢測人CYP3A4基因分型的檢測方法，包括以下步驟：

S01.提取人全血基因組DNA和上述試劑盒；

S02.按人全血基因組DNA提取液加入所述試劑盒的反應(yīng)體系中，其中，所述人全血基因組DNA提取液和所述反應(yīng)體系的比例比為1：8；

S03.PCR擴(kuò)增；

S04.結(jié)果判定。

具體的，上述步驟S01中，所述試劑盒為上述試劑盒，所述人全血基因組DNA的提取方法可參照下述具體實施例進(jìn)行，當(dāng)然，能夠提取得到人全血基因組DNA的方法，都在本發(fā)明實施例范圍內(nèi)。

上述步驟S02中，所述人全血基因組DNA提取液和所述反應(yīng)體系的比例比為1：8添加，作為一個具體實施例，按比例將5μl人全血基因組DNA提取液加入40μl所述試劑盒的反應(yīng)體系中，其中，40μl所述試劑盒包括34.5μlPCR反應(yīng)液和0.5μl酶混合物，當(dāng)然，具體體積可根據(jù)該比例進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。進(jìn)行PCR反應(yīng)的管數(shù)沒有特別限定，通常為樣本數(shù)+2(陰性對照、陽性對照)。因此，該步驟至少包括向不同的所述試劑盒的反應(yīng)體系中分別加入樣本、陽性對照和陰性對照。

上述步驟S03中，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：

50℃2min；

95℃預(yù)變性2min；

95℃15s；62℃45s；35個循環(huán)，

在62℃45s時收集熒光。

上述步驟S04中，通過對結(jié)果進(jìn)行分析判斷，可獲悉所述CYP3A4基因CYP3A4*1B位點、CYP3A4*3位點的具體基因類型，所述分析判定方法，在下述具體實施例中進(jìn)行描述。

應(yīng)當(dāng)說明的是，檢測人CYP3A4基因分型的檢測方法，用于確定CYP3A4基因的分型，該分型可以但并非僅僅可以輔助臨床指導(dǎo)，還可用于分析遺傳學(xué)、基因多態(tài)性等等。而本發(fā)明實施例所述檢測人CYP3A4基因分型的檢測方法，僅僅用于非疾病的診斷和治療領(lǐng)域。

本發(fā)明實施例提供的檢測人CYP3A4基因分型的檢測方法，檢測SNP的特異性來源于具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶切除瓣狀結(jié)構(gòu)時的切割位置的準(zhǔn)確性，相比之前的熒光PCR熔解曲線法更為準(zhǔn)確。因此該方法在進(jìn)行基因分型上相比傳統(tǒng)的熒光定量PCR顯示出了優(yōu)勢。此外，本發(fā)明實施例方法具有操作簡單、迅速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點。

下面結(jié)合具體實施例進(jìn)行說明。

實施例1引物設(shè)計合成

本發(fā)明實施例CYP3A4基因CYP3A4*1B位點和CYP3A4*3位點基因多態(tài)性引物設(shè)計，根據(jù)NCBI人CYP3A4基因序列設(shè)計如下：

CYP3A4基因CYP3A4*1B位點

上游引物CYP3A4*1BFP：5’-GAGTCTTCTAGGGGGCACAGGC-3’；

下游引物CYP3A4*1BRP：5’-GTTACTGGGGAGTCCAAGGGT-3’；

CYP3A4基因CYP3A4*3位點

上游引物CYP3A4*3FP：5’-TAACTTTTTAAAAATCTACC-3’；

下游引物CYP3A4*3RP：5’-TTTACAAGGTTTGAAGGAGA-3’。

實施例2探針的設(shè)計合成

根據(jù)NCBI基因庫人CYP3A4基因CYP3A4*1B位點和CYP3A4*3位點基因多態(tài)性設(shè)計相應(yīng)的探針如下：

探針CYP3A4*1BA：5’-CAAGGGCAAGAGAGAGGCGATTTAATA-3’；

探針CYP3A4*3C：5’-TTGGCACGAGGTTTGCTCTCATGAAC-3’；

其中，探針CYP3A4*1BA的5’端和3’端分別采用FAM、VIC熒光基團(tuán)標(biāo)記，第10位G標(biāo)記ZEN^TM Internal Quencher；探針CYP3A4*3C的5’端和3’端分別采用FAM、VIC熒光基團(tuán)標(biāo)記，第8位G標(biāo)記淬滅基團(tuán)ZEN^TM Internal Quencher。

實施例3CYP3A4PCR反應(yīng)液的配制

CYP3A4PCR反應(yīng)液即CYP3A4PCR反應(yīng)液1和CYP3A4PCR反應(yīng)液2，兩種反應(yīng)液的成分均為緩沖液、dNTPs(含dUTP)、MgCl2、引物、探針，組分濃度如下所示：

CYP3A4PCR反應(yīng)液1：

CYP3A4PCR反應(yīng)液2：

實例4酶混合物

本發(fā)明實施例所述酶混合物由尿嘧啶糖基化酶(UNG酶)和DNA聚合酶混合而成，其中，所述DNA聚合酶為具有瓣狀核酸內(nèi)切酶活性的DNA聚合酶，本發(fā)明實施例具體優(yōu)選New England Biolabs公司的Taq DNA聚合酶。

實施例5陽性對照品和空白對照的制備

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫CYP3A4基因CYP3A4*1B、CYP3A4*3位點基因多態(tài)性設(shè)計陽性對照品序列，合成序列，構(gòu)建DNA重組質(zhì)粒。CYP3A4陽性對照品包括4種質(zhì)粒分別為CYP3A4*1BA野生型、CYP3A4*1BG突變型、CYP3A4*3C野生型、CYP3A4*3T突變型。CYP3A4陽性對照品1是由CYP3A4*1BA野生型、CYP3A4*1BG突變型重組質(zhì)粒按1:1混合而成，CYP3A4陽性對照品2是由CYP3A4*3C野生型、CYP3A4*3T突變型重組質(zhì)粒按1:1混合而成。

實施例6反應(yīng)體系的配備

本發(fā)明中采用40μl的反應(yīng)體系，其具體反應(yīng)組分如下表1所示。

表1

實施例7反應(yīng)程序的設(shè)置

本發(fā)明實施例中優(yōu)選的反應(yīng)程序為50℃，2min；95℃，2min；95℃，15s，62℃，45s，35個循環(huán)。

實施例8本試劑盒檢測臨床樣本的檢測方法

本試劑盒檢測臨床樣本的檢測方法，包括以下步驟：

1.人血液樣本基因組DNA的提取，可采用深圳華因康基因科技有限公司寶安分公司生產(chǎn)的血液基因組提取純化試劑盒，具體操作如下：

(1)從提取試劑盒中取出1.5ml離心管若干個，每個管加入抗凝血200μl。

(2)加入500μl緩沖液CLG溶液到抗凝血中，蓋緊離心管蓋，漩渦震蕩20s以上，充分顛倒混勻，必須充分混勻或漩渦震蕩以確保釋放基因組DNA。

(3)加入100μl緩沖液PP溶液，漩渦震蕩或來回顛倒10s。

(4)12,000g離心5min。

(5)從提取試劑盒中取出DNA純化柱，將步驟4中的上清液轉(zhuǎn)移至純化柱，8000g離心1min。為提高DNA提取量，離心后，濾液可再回倒離心一次。

(6)倒棄過柱后濾液，將DNA純化柱放入同一收集管中，往純化柱中加入750μl緩沖液WⅠ，室溫放置2min后，8000g離心1min(確認(rèn)緩沖液WⅠ已加入無水乙醇)。

(7)倒棄過柱后濾液，往純化柱中加入750μl Buffer緩沖液WⅡ,8000g離心1min(確認(rèn)緩沖液WⅡ已加入無水乙醇)。

(8)倒棄過柱后濾液，將純化柱12,000g離心2min。

(9)將純化柱轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，室溫放置5min充分揮發(fā)乙醇。加70～100μl收集液EB(收集液EB預(yù)熱到65℃有利于提高DNA的洗脫效率)，室溫放置1min,12,000離心2min洗脫基因組DNA?？蓪⑦^柱后的洗脫液吸出再加到純化柱膜上，室溫放置1min,12,000g離心1min可以提高DNA的洗脫量。

(10)基因組DNA的濃度和質(zhì)量應(yīng)通過微量紫外分光光度計測定OD260和OD280吸光值(常用德國Implen的NanoPhotometerTMP-Clas微量分光光度計、北京凱奧科技發(fā)展有限公司的K2800核酸分析儀)，DNA濃度應(yīng)該在2ng/μl≤DNA濃度≤100ng/μl范圍OD260/OD280值在1.5～2.0之間。純化DNA樣本在4℃保存不超過7天；未能及時檢測的DNA樣本于-20℃保存，保存時間不超過3個月；純化DNA樣本反復(fù)凍融不超過5次。

2.樣本的熒光定量PCR檢測

(1)試劑準(zhǔn)備

從試劑盒中取出CYP3A4PCR反應(yīng)液，在冰上解凍，計算每個反應(yīng)體系所需要的PCR反應(yīng)管數(shù)，管數(shù)為n(n＝樣本數(shù)+2(陰性對照、陽性對照))。按下表2分別取計算量的PCR反應(yīng)液和酶混合物到合適的離心管中，顛倒混勻10次，制備反應(yīng)體系，2000g離心10秒。

表2

分別取35μl反應(yīng)體系到PCR反應(yīng)管，標(biāo)記不同的反應(yīng)體系。

(2)加樣

陽性對照和陰性對照在收貨時取出，放到樣品處理室/加樣室。陽性對照和陰性對照在冰上解凍，在渦旋振蕩器混勻，2000g離心10秒。向所設(shè)定的n個PCR反應(yīng)管中分別加入樣本、陽性對照、陰性對照各5μl，蓋緊管蓋，并做好記錄?；靹蚋鱌CR反應(yīng)管中的PCR反應(yīng)體系和所加的樣本。將PCR反應(yīng)管2000g離心10秒。轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)，置于PCR儀上，記錄樣本擺放順序。

(3)PCR擴(kuò)增

ABI7500熒光定量PCR儀，選擇FAM(Reporter:FAM；Quencher:none)檢測通道；VIC(Reporter:VIC；Quencher:none)檢測通道；ROX(Reporter:ROX；Quencher:none)；CY5(Reporter:CY5；Quencher:none)檢測通道。參比熒光(Passive Reference)設(shè)置為None，閾值線設(shè)為50000。

PCR擴(kuò)增程序：

50℃2min；

95℃預(yù)變性2min；

95℃15s；62℃45s；35個循環(huán)，

在62℃45s時收集熒光，即熒光收集設(shè)置在“步驟3：62℃，45s”。

3.樣本的檢測結(jié)果分析

(1)如樣本CYP3A4PCR反應(yīng)液1在VIC檢測通道無Ct或Ct大于37.5，或CYP3A4PCR反應(yīng)液2在CY5檢測通道無Ct或Ct大于37.5，則判斷樣本的基因組DNA濃度低于檢測限。

(2)當(dāng)CYP3A4PCR反應(yīng)液1在VIC檢測通道Ct小于或等于37.5，CYP3A4PCR反應(yīng)液2在CY5檢測通道Ct小于或等于37.5的情況下，按以下判斷。

A.CYP3A4PCR反應(yīng)液1結(jié)果判定(CYP3A4*1B位點結(jié)果)

比較樣本FAM通道和VIC通道的熒光強(qiáng)度，按下表3判定結(jié)果：

表3

A.CYP3A4PCR反應(yīng)液2結(jié)果判定(CYP3A4*3位點結(jié)果)

比較樣本FAM通道和VIC通道的熒光強(qiáng)度，按下表3判定結(jié)果：

表4

CYP3A4基因分型如下表5所示：

表5

在本發(fā)明實施例試劑盒中，CYP3A4基因CYP3A4*1B位點的檢測結(jié)果有3種，圖1所示為CYP3A4*1B位點為AA野生型的檢測結(jié)果，圖2所示為CYP3A4*1B位點為GG突變型的檢測結(jié)果，圖3所示為CYP3A4*1B位點AG雜合型的檢測結(jié)果；CYP3A4基因CYP3A4*3位點的檢測結(jié)果也有3種，圖4所示為CYP3A4*3位點為CC野生型的檢測結(jié)果，圖5所示為CYP3A4*3位點為TT突變型的檢測結(jié)果，圖6所示為CYP3A4*3位點CT雜合型的檢測結(jié)果。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。