本發(fā)明屬于疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種豬鏈球菌2型XD株及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype 2，S.suis 2)是一種重要的人畜共患病病原體，可以引起豬發(fā)生腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎等癥狀，病死率高達(dá)40％，如與豬呼吸與繁殖綜合征并發(fā)，死亡率更高，即使病后能夠存活的豬，其生長(zhǎng)緩慢，料肉比增加，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失，故該菌對(duì)全球的養(yǎng)豬生產(chǎn)是一個(gè)潛在的威脅。豬鏈球菌2型可以通過(guò)傷口、消化道感染人，1998年和2005年分別在我國(guó)江蘇和四川發(fā)生豬鏈球菌病的暴發(fā)，并且均發(fā)生人感染死亡的病例，引起人們的高度關(guān)注。目前針對(duì)豬鏈球菌病，尚無(wú)適用人群的疫苗，所以預(yù)防豬發(fā)生豬鏈球菌病，不僅僅是對(duì)豬的保護(hù)，更是對(duì)人的一種保障。

目前對(duì)于豬鏈球菌病的防控主要依賴于豬場(chǎng)的綜合管理、菌苗的免疫、藥物預(yù)防等。而現(xiàn)在由于大量耐藥菌株的出現(xiàn)，藥物治療及藥物預(yù)防的效果急劇下降。所以疫苗免疫是豬鏈球菌病防控的關(guān)鍵，目前市場(chǎng)上豬鏈球菌病疫苗包括滅活單苗和滅活多價(jià)苗，滅活疫苗是將細(xì)菌通過(guò)甲醛滅活處理獲得的全菌體死疫苗，滅活疫苗優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)方便、穩(wěn)定、易保存；但是滅活苗存在較多的缺陷：1)滅活疫苗接種后在動(dòng)物體內(nèi)不能繁殖，因此免疫劑量較大，而且一般要加入免疫佐劑來(lái)增強(qiáng)其免疫效果；2)滅活疫苗保護(hù)期也相對(duì)較短，往往1次免疫不能產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)效果，僅僅是“初始化”免疫系統(tǒng)，必須進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫才能產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)；3)滅活疫苗需要多次免疫、免疫劑量大并且免疫部位易出現(xiàn)損傷。然而，減毒活疫苗的優(yōu)點(diǎn)是成本低，接種劑量少，且免疫保護(hù)期長(zhǎng)，同時(shí)，活疫苗可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的體液免疫和細(xì)胞免疫，具有很廣闊的應(yīng)用前景。開(kāi)發(fā)弱毒疫苗是控制該疾病的有效策略之一，但目前弱毒疫苗研發(fā)方面暫無(wú)突破，因此開(kāi)發(fā)一種弱毒疫苗具有積極意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種豬鏈球菌2型XD株，該菌株具有致病性低、免疫原性好等特點(diǎn)，所述菌株已于2016年10月18日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype 2)XD株，保藏編號(hào)為：CCTCC NO：M2016573，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種適用于豬鏈球菌2型XD株的凍干保護(hù)劑。

本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供了一種適用于豬鏈球菌2型XD株疫苗稀釋液佐劑。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種豬鏈球菌2型XD株在制備疫苗中的應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一種豬鏈球菌2型XD株(本發(fā)明或稱為SS2-XD株)，是申請(qǐng)人從湖北、湖南、四川、浙江、江蘇、廣東等省市100多株臨床分離毒株中經(jīng)過(guò)篩選得到，所述菌株已于2016年10月18日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：豬鏈球菌2型(Streptococcus suis seroty pe 2)XD株，保藏編號(hào)：CCTCC NO：M2016573，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

豬鏈球菌2型XD株生物學(xué)特性鑒定如下：

豬鏈球菌2型XD株形態(tài)學(xué)特性：對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求較高，在基礎(chǔ)瓊脂平皿上生長(zhǎng)較差，37℃溫箱培養(yǎng)20小時(shí)以上可見(jiàn)針尖大小菌落。在TSA平皿(含5％新生牛血清)上生長(zhǎng)良好，37℃溫箱培養(yǎng)12小時(shí)即見(jiàn)針尖大小菌落。SS2-XD株形成的菌落呈灰色、半透明、濕潤(rùn)，透光45°可觀察菌落現(xiàn)淺藍(lán)色熒光。在綿羊鮮血瓊脂平板上形成的菌落周圍可見(jiàn)β溶血環(huán)。SS2-XD株接種緩沖肉湯培養(yǎng)基與TSB培養(yǎng)基(含5％新生牛血清)中培養(yǎng)6至8小時(shí)可見(jiàn)明顯一致混濁，偶見(jiàn)沉淀于瓶底。新鮮培養(yǎng)物玻片固定后進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性，個(gè)體呈圓球狀或卵圓形，多見(jiàn)短鏈或長(zhǎng)鏈排列，少見(jiàn)單個(gè)或雙個(gè)排列(圖1)。

一種適用于豬鏈球菌2型XD株的凍干保護(hù)劑，每100ml凍干保護(hù)劑中包括：YEAST EXT RACT 0.2～2g，谷氨酸鈉0.1～1g、賴氨酸0.1～1g、山梨醇0.5～5g、蔗糖2～10g、TSB 0.1～2g、水解明膠1～5g，其余為去離子水。

以上所述方案中，優(yōu)選的：每100ml凍干保護(hù)劑中包括：YEAST EXTRACT 1g，谷氨酸鈉0.5g、賴氨酸0.5g、山梨醇0.5g、蔗糖4g、TSB 1g、水解明膠2g，其余為去離子水。

一種適用于豬鏈球菌2型XD株疫苗稀釋液佐劑，每1L疫苗稀釋液佐劑包括：左旋咪唑5～30g，β-葡聚糖0.01～0.1L，Summit-Poly Liquid 0.1～0.4L，其余為去離子水。

以上所述方案中，優(yōu)選的，每1L稀釋液佐劑中，包括β-葡聚糖0.05L，左旋咪唑含量為10g，Summit-Poly Liquid 0.15L，其余為去離子水。

一種豬鏈球菌2型XD株在制備疫苗中的應(yīng)用，包括利用該菌株作為主要成分制備成單苗；或該菌株作為有效成分之一與其他抗原制備成聯(lián)苗。

本發(fā)明涉及細(xì)菌活疫苗及其適用于該疫苗的專用稀釋液佐劑，尤其向豬提供寬泛、安全和有效保護(hù)免遭豬鏈球菌所感染。本發(fā)明涉及包含細(xì)菌(例如，減毒活細(xì)菌)的免疫原或疫苗組合物。這些細(xì)菌可以在組合物中是滅活的，但是可能更有利的是活菌。本發(fā)明還涉及用于制備和/或配制這類組合物的方法；例如，合適的可獸用或可藥用載體、賦形劑、稀釋劑或媒介物和/或佐劑和/或穩(wěn)定劑混合。

針對(duì)哺乳動(dòng)物作為目標(biāo)物種的組合物劑量體積，例如，基于細(xì)菌抗原的豬用組合物的劑量體積，通常在約0.4至約4.0ml之間。最佳免疫劑量為2.0ml/頭份(5.0×10⁸CFU/頭份)?？梢栽诮K末免疫后約4周通過(guò)用豬鏈球菌2型強(qiáng)毒菌株攻擊動(dòng)物如豬類動(dòng)物，來(lái)檢驗(yàn)疫苗的效力。可以通過(guò)IM或SC注射、噴霧、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、氣管內(nèi)和/或經(jīng)口方式攻擊動(dòng)物?？梢栽诠糁昂椭蟛杉瘉?lái)自血清、關(guān)節(jié)、肺/或腦的樣品對(duì)其豬鏈球菌特異性抗體和帶毒量的存在進(jìn)行分析。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本文的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)示例方式提供并且本發(fā)明不限于此。從本文中的公開(kāi)內(nèi)容和本領(lǐng)域知識(shí)，在不進(jìn)行任何過(guò)多實(shí)驗(yàn)的情況下，技術(shù)人員可以確定施用次數(shù)、施用途徑和用于每種注射方案的劑量。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.SS2-XD株是自然弱毒株，分離于健康豬的肺組織，對(duì)多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均無(wú)致病力，且對(duì)仔豬不造成病理?yè)p傷。

2.SS2-XD株活疫苗能快速有效持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，使機(jī)體應(yīng)答同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，通過(guò)大量臨床試驗(yàn)證據(jù)表明本發(fā)明的活疫苗對(duì)控制豬鏈球菌病起到積極作用，具有早期預(yù)防，誘導(dǎo)黏膜免疫、細(xì)胞免疫等特點(diǎn)。對(duì)臨床上經(jīng)常發(fā)生鏈球菌病的預(yù)防具有明顯優(yōu)勢(shì)。

3.與滅活疫苗相比，接種劑量少、免疫后吸收更完全，在接種部位幾乎不會(huì)引起炎癥反應(yīng)，不會(huì)對(duì)機(jī)體造成影響。

4.與滅活疫苗相比，生產(chǎn)成本更低。

附圖說(shuō)明

圖1為SS2-XD株革蘭氏染色鏡檢圖片。

400×鏡檢，SS2-XD株新鮮培養(yǎng)菌液革蘭氏染色結(jié)果呈陽(yáng)性；個(gè)體呈圓球狀或卵圓形，多見(jiàn)短鏈或長(zhǎng)鏈排列，少見(jiàn)單個(gè)或雙個(gè)排列。

圖2為SS2-XD株gdh與cps2J基因PCR鑒定圖；

其中M：為DL2000plus marker；2和4：為SS2-XD株；3和5為：參考菌株A7；1與6：陰性對(duì)照H₂O。

圖3為培養(yǎng)基的pH值隨時(shí)間變化的規(guī)律示意圖。

圖4為生長(zhǎng)曲線(OD600nm值)。

圖5為生長(zhǎng)曲線(活菌數(shù)CFU)。

圖6為免疫后仔豬平均抗體消長(zhǎng)規(guī)律。

具體實(shí)施方式

結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述和論證，但本發(fā)明內(nèi)容并不局限于此。本發(fā)明實(shí)施例所用保護(hù)劑如下，如未特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案或試劑，均購(gòu)自于商業(yè)渠道。

凍干機(jī)：德國(guó)，型號(hào)：CHRIST公司2-6D LSC型號(hào)。

在本申請(qǐng)中，每頭份免疫的疫苗如無(wú)特別說(shuō)明，均按稀釋后2ml/頭份(活菌含量5.0×10⁸CFU)使用。

實(shí)施例1：

豬鏈球菌2型XD株的獲得：

申請(qǐng)人從湖北、湖南、四川、浙江、江蘇、廣東等省市100多株臨床分離毒株中經(jīng)過(guò)PCR鑒定和毒力篩選，其中有60株三大毒力基因sly+mrp+epf+均為陽(yáng)性。這與我國(guó)目前豬鏈球菌2型所流行毒力基因一致。將篩選到的60株豬鏈球菌2型分別用小鼠進(jìn)行致病力初步評(píng)估，篩選到3株低致病力菌株，進(jìn)一步比較三株菌株毒力，進(jìn)行安全試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明：豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)安全性最高。腹腔接種對(duì)小鼠的LD50約為9.0×10⁸CFU，皮下接種最高劑量為9.0×10⁹CFU還是安全；SS2-XD株耳靜脈接種仔豬3.0×10⁹CFU無(wú)明顯癥狀，耳靜脈接種最高劑量6.0×10⁹CFU對(duì)仔豬也沒(méi)用造成異常影響。為進(jìn)一步確定疫苗用SS2-XD株，又展開(kāi)相關(guān)分子生物學(xué)鑒定。通過(guò)對(duì)豬鏈球菌2型XD株gdh與cps2J基因分別進(jìn)行PCR，擴(kuò)增結(jié)果(圖2)說(shuō)明，SS2-XD株能夠擴(kuò)增到特異性的gdf條帶(689pb)，與特異性的cps2J條帶(557pb)，此結(jié)果，與豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增一致，表明SS2-XD株是豬鏈球菌2型或(1/2型)，結(jié)合凝集試驗(yàn)結(jié)果，SS2-XD株與豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)血清發(fā)生凝集，而與1型標(biāo)準(zhǔn)血清不發(fā)生凝集。同時(shí)，對(duì)豬鏈球菌2型XD株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性、生化特性、血清型特性、安全性和免疫原性展開(kāi)初步研究。結(jié)果表明SS2-XD株符合豬鏈球菌2型全部特征，至此，申請(qǐng)人獲得了一株豬鏈球菌2型菌株，該菌株已于2016年10月18日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：豬鏈球菌2型(Strep tococcus suis serotype 2)XD株，保藏編號(hào)：CCTCC NO：M2016573，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

實(shí)施例2：

豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype 2)XD株生理生化特性：

豬鏈球菌2型XD株生化試驗(yàn)：豬鏈球菌2型SS2-XD株在低溫(10℃)與高溫(45℃)下無(wú)法生長(zhǎng)，在高鹽環(huán)境下(6.5％NaCl)無(wú)法生長(zhǎng)，在堿性環(huán)境中不生長(zhǎng)，在富含膽酸鹽環(huán)境中(麥康凱培養(yǎng)基)無(wú)法生長(zhǎng)(表1)。唯一碳源利用的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2與表3)說(shuō)明豬鏈球菌2型SS2-XD株符合豬鏈球菌屬的生化特性。

表1豬鏈球菌的生長(zhǎng)特性結(jié)果

表2豬鏈球菌生化反應(yīng)結(jié)果

表3豬鏈球菌生化反應(yīng)結(jié)果

豬鏈球菌2型XD株血清學(xué)特性：將豬鏈球菌2型分離株SS2-XD株與豬鏈球菌1型和2型參考分型血清(購(gòu)于丹麥皇家血清研究所)進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)以A7株(2型參考菌株)與ST1株(1型參考菌株)作參考對(duì)照。結(jié)果顯示(表4)對(duì)照成立，SS2-XD株可與豬鏈球菌2型參考血清發(fā)生凝集反應(yīng)，與1型參考血清沒(méi)有發(fā)生凝集反應(yīng)，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，SS2-XD株符合豬鏈球菌2型血清學(xué)特性。

表4玻片凝集試驗(yàn)結(jié)果

豬鏈球菌2型XD株培養(yǎng)特性：將凍干菌種經(jīng)TSA瓊脂培養(yǎng)皿劃線復(fù)壯純化(F1代)，挑取單菌落接種液體培養(yǎng)基，連續(xù)傳代3次(F2至F4代)以適應(yīng)。以F4代新鮮菌液為種子液1:100體積比接種TSB培養(yǎng)基，于37℃搖床150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。其間每隔兩小時(shí)取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。每小時(shí)取樣測(cè)定培養(yǎng)液pH值，同時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD_600nm值。結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4、圖5所示。

從圖3可以看出，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)豬鏈球菌2型，溶液的pH值下降非?？?，培養(yǎng)時(shí)間為10小時(shí)左右，其pH值達(dá)到最低，此時(shí)pH值僅為5.13，由此說(shuō)明，豬鏈球菌2型在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)酸能力強(qiáng)。維持發(fā)酵液pH值(7.0～7.5)可能有助于細(xì)菌生長(zhǎng)。

從圖4可以看出，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)SS2-XD株，在接種種子菌后8小時(shí)內(nèi)，溶液的OD值成對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，培養(yǎng)10小時(shí)后進(jìn)入平穩(wěn)期。

從圖5可以看出，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)鏈球菌，種子液接種后4個(gè)小時(shí)左右開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)8～10h活菌數(shù)達(dá)到最高峰，但從12個(gè)小時(shí)開(kāi)始活菌數(shù)一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

實(shí)施例3：

豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)的制備方法，包括：

1、取豬鏈球菌2型XD株凍存菌種接種于5％新生牛血清TSA培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)20-24h后，經(jīng)檢驗(yàn)合格后作為一級(jí)種子。選取5個(gè)以上典型菌落接種于5％新生牛血清TSB培養(yǎng)基中。在37℃150r/min培養(yǎng)8-10h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后作為二級(jí)種子。將二級(jí)種子液在無(wú)菌條件下按照2％(v/v)接種裝有30L的TSB液體培養(yǎng)基(含5％v/v新生牛血清)的50L發(fā)酵罐中。然后通過(guò)電腦自動(dòng)控制系統(tǒng)，控制和維持發(fā)酵罐通氣量1.5VVM、溶解氧濃度40％-60％、攪拌速率100r/min、pH值7.2±0.2。在發(fā)酵過(guò)程中通入無(wú)菌空氣，以保證正壓和溶氧，在37℃培養(yǎng)10-12h后收獲菌液，收獲的菌液濃度≥6×10⁹CFU/ml，置于2-8℃保存。

2、豬鏈球菌2型XD株凍干保護(hù)劑的制備：

將水解明膠、蔗糖、YEAST EXTRACT、TSB加入到70-80℃去離子水中，攪拌直至完全溶解，高壓滅菌條件為116℃，20min。即為A組儲(chǔ)備液。

將谷氨酸鈉、賴氨酸、山梨醇溶解在去離子水中，然后，利用0.22微米濾器濾過(guò)除菌，即為B組儲(chǔ)備液。然后，將A組儲(chǔ)備液和B組儲(chǔ)備液按照體積比1:1混合后，即為凍干保護(hù)劑，每100ml凍干保護(hù)劑中包括：YEAST EXTRACT 1g，谷氨酸鈉0.5g、賴氨酸0.5g、山梨醇0.5g、蔗糖4g、TSB 1g、水解明膠2g，其余為去離子水。

3、凍干過(guò)程

將凍干保護(hù)劑和菌液按照1：3(v/v)體積比混合均勻。分裝于10ml管制瓶中，3ml/瓶，進(jìn)行凍干，在凍干結(jié)束后觀察凍干試驗(yàn)樣品形態(tài)，測(cè)定凍干后活菌數(shù)。凍干前半成品的活菌數(shù)應(yīng)≥5×10⁹CFU/ml。

凍干過(guò)程如下：

在產(chǎn)品預(yù)凍階段：4℃進(jìn)箱，然后1h內(nèi)將板層溫度下降到-42℃并維持2h。在主干燥階段：2h內(nèi)將板層溫度由-42℃上升到0℃并維持8h，然后再1h內(nèi)將板層溫度由0℃上升到15℃并維持2h。終干燥階段：在2h內(nèi)將板層溫度由15℃上升到28℃并維持8h。凍干結(jié)束，出箱、壓蓋，并于4℃保存，即制得豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)，用于以下實(shí)施例。

4、成品苗檢驗(yàn)

活菌數(shù)檢測(cè)按照《中國(guó)獸藥典》附錄活菌計(jì)數(shù)方法進(jìn)行檢測(cè)。使得凍干后成品苗活菌數(shù)應(yīng)≥5.0×10⁸CFU/頭份。

物理性狀性狀為淡黃色或灰白色海綿狀疏松團(tuán)塊，餅塊疏松多孔，形態(tài)完整，易于脫瓶，加凍干稀釋液迅速溶解。

純粹性 按照《中國(guó)獸藥典》附錄方法進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)符合規(guī)定。

剩余水分 按照《中國(guó)獸藥典》附錄方法進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)符合規(guī)定。

真空度 按照《中國(guó)獸藥典》附錄方法進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)符合規(guī)定。

5、疫苗保存期試驗(yàn)

將試制3批疫苗分別在2～8℃放置3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月，-15℃放置6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月后各抽取3瓶，測(cè)定活菌數(shù)。同時(shí)對(duì)樣品按照《中國(guó)獸藥典》附錄方法進(jìn)行物理性狀、溶解性、真空度、剩余水分測(cè)定。經(jīng)過(guò)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2～8℃條件下保存9個(gè)月時(shí)與凍干后活菌數(shù)相比在80％以上，在-15℃條件下保存18個(gè)月時(shí)與凍干后活菌數(shù)相比在80％以上，因此在確定-15℃以下保存有效期為18個(gè)月。具體結(jié)果見(jiàn)表5、表6、表7。

表5：3批疫苗在2～8℃條件下保存期試驗(yàn)

表6：3批疫苗在-15℃條件下保存期試驗(yàn)

表7：3批苗在2～8℃和-15℃條件下物理性狀、溶解性、真空度、剩余水分檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例4：

適用于豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)的稀釋液佐劑：

稀釋液佐劑的制備方法，包括：

適用于豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)稀釋液佐劑，包括：左旋咪唑、β—葡聚糖和Su mmit-Poly Liquid。

其豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)凍干稀釋液佐劑具體制備方法如下：

將無(wú)菌級(jí)β-葡聚糖溶液(湖北安琪酵母股份有限公司)作為A儲(chǔ)備溶液

將左旋咪唑(Sigma公司)溶解在去離子水中，制備成50mg/ml的儲(chǔ)備溶液。然后，利用0.22微米濾器過(guò)濾除菌作為B儲(chǔ)備溶液。

將Summit-Poly Liquid佐劑(臺(tái)灣國(guó)盛生物科技有限公司)溶液116℃高壓滅菌20min作為C貯備液佐劑。

最后將A液、B液、C液分別依次緩慢加入無(wú)菌去離子水中，邊加邊攪拌，攪拌的轉(zhuǎn)速為500r/min。攪拌時(shí)間為30min?；旌暇鶆虻闹苿┘礊樨i鏈球菌2型XD株凍干稀釋劑。

以1L稀釋劑為例進(jìn)行配制時(shí)，取無(wú)菌級(jí)β-葡聚糖A儲(chǔ)備溶液0.05L，取左旋咪唑B儲(chǔ)備溶液0.2L，取Summit-Poly Liquid佐劑C儲(chǔ)備液0.15L分別依次緩慢加入無(wú)菌去離子水中，最后定容到1L。邊加邊攪拌，攪拌的轉(zhuǎn)速為500r/min。攪拌時(shí)間為30min?；旌暇鶆虻闹苿┘礊樨i鏈球菌2型XD株稀釋液佐劑，每1L稀釋液佐劑中，包括β-葡聚糖0.05L，左旋咪唑含量為10g，Summit-Poly Liquid 0.15L，其余為去離子水。

豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)稀釋液佐劑與生理鹽水的效果比較：

用上述制備的豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)稀釋液佐劑和生理鹽水分別稀釋豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，5.0×10⁸CFU/頭份，免疫28～35日齡斷奶仔豬(購(gòu)自湖北某豬場(chǎng))。經(jīng)豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(武漢科前生物股份有限公司)檢測(cè)，抗體為陰性方可用于本試驗(yàn)。試驗(yàn)共分3組，5頭/組，免疫劑量為：1頭份/頭。組1為：豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)稀釋液佐劑稀釋的豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)；組2為：生理鹽水稀釋的豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)；組3為：空白對(duì)照。在免疫28天后，采血分離血清檢測(cè)豬鏈球菌2型抗體水平。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表(8)。

表8：比較SS2-XD株稀釋液佐劑和生理鹽水免疫28天后抗體水平

由表8可以看出，用制備的豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)稀釋液佐劑稀釋的疫苗免疫28天后抗體在同等條件下明顯高于生理鹽水。說(shuō)明使用本發(fā)明的豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)稀釋液佐劑可顯著提高活疫苗的免疫刺激能力。

實(shí)施例5：

豬鏈球菌病活疫苗(SS2-XD株)最佳免疫劑量測(cè)定及抗體水平與攻毒保護(hù)率之間平行關(guān)系

1材料與方法

1.1試驗(yàn)用疫苗豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，5.0×10⁸CFU/頭份，由實(shí)施例3所制備的凍干粉和實(shí)施例4所制備稀釋劑稀釋制得。

1.2攻毒用菌株選取豬鏈球菌血清2型LT株，來(lái)源于武漢科前生物股份有限公司，僅用于攻毒試驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取28～35日齡斷奶仔豬，購(gòu)自湖北某豬場(chǎng)。經(jīng)豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(武漢科前生物股份有限公司)檢測(cè)，抗體為陰性方可用于本試驗(yàn)。

1.4疫苗中活菌數(shù)的測(cè)定豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，用生理鹽水稀釋恢復(fù)原裝量，按照《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)測(cè)定。

1.5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

用豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗免疫21～28日齡斷奶仔豬。試驗(yàn)共分7組，每組5頭。按劑量2.5×10⁷CFU、1.0×10⁸CFU、5.0×10⁸CFU，分一次免疫和兩次免疫(首免間隔21天)進(jìn)行免疫接種，兩次免疫組提前7天免疫。另外設(shè)立非免疫空白對(duì)照組5頭。

在一次免疫28天和兩次免疫35天后，前腔靜脈采血分離血清檢測(cè)豬鏈球菌2型抗體水平，并進(jìn)行一個(gè)致死劑量(1.2×10⁶CFU)豬鏈球菌血清2型LT株攻毒試驗(yàn)。在攻毒后觀察14天，分析攻毒保護(hù)率與免疫劑量、免疫次數(shù)之間相關(guān)性，分析攻毒保護(hù)率與抗體水平之間相關(guān)性。

2結(jié)果與分析

2.1疫苗最佳免疫劑量測(cè)定與攻毒保護(hù)結(jié)果

在一次免疫28天和兩次免疫的首免35天后，前腔靜脈采血分離血清檢測(cè)豬鏈球菌2型抗體水平，并進(jìn)行一個(gè)致死劑量(1.2×10⁶CFU)豬鏈球菌血清2型強(qiáng)毒LT株攻毒試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)每組免疫后抗體水平及攻毒保護(hù)率。

結(jié)果表明：在使用豬鏈球菌2型XD株2.5×10⁷CFU劑量免疫仔豬，無(wú)論是一次免疫還是兩次免疫，豬群產(chǎn)生的抗體水平都較低，且不能提供有效的攻毒保護(hù)；在使用1.0×10⁸CFU、5.0×10⁸CFU劑量免疫仔豬，都可以產(chǎn)生較高抗體水平，但5.0×10⁸CFU劑量提供的攻毒保護(hù)最好。另外以相同劑量進(jìn)行兩次免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平明顯高于一次免疫，非免疫空白對(duì)照組抗體均為陰性，經(jīng)攻毒后全部發(fā)病或死亡，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表9。

表9：不同免疫劑量與免疫次數(shù)接種仔豬抗體及攻毒結(jié)果

2.2抗體水平與攻毒保護(hù)相關(guān)性分析結(jié)果

對(duì)比分析一次免疫28天和兩次免疫35天后抗體檢測(cè)結(jié)果和攻毒保護(hù)結(jié)果(表9)，抗體水平在低于0.5(OD630nm值)時(shí)，攻毒保護(hù)率在20％以下，抗體水平在0.5～0.9(OD630nm值)時(shí)，攻毒保護(hù)率在80％以上，抗體水平高于0.9(OD630nm值)時(shí)，可以提供100％攻毒保護(hù)。對(duì)以上結(jié)果表明，豬鏈球菌活疫苗XD株(SS2-XD株)免疫抗體水平與攻毒保護(hù)有正相關(guān)。鑒于試驗(yàn)結(jié)果，我們將5.0×10⁸CFU作為SS2-XD株最佳免疫參考劑量。

實(shí)施例6：

豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)安全檢驗(yàn)與效力檢驗(yàn)

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物選取武漢某豬場(chǎng)28-35日齡健康仔豬，要求仔豬來(lái)源一致，個(gè)體均勻，使用武漢科前生物股份有限公司生產(chǎn)豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體為陰性，且符合豬鏈球菌健康易感仔豬要求。

1.1.2試驗(yàn)用疫苗

豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，5.0×10⁸CFU/頭份，由實(shí)施例3所制備的凍干粉和實(shí)施例4所制備稀釋劑稀釋制得。

上海海利生物藥品有限公司生產(chǎn)豬鏈球菌病滅活疫苗(馬鏈球菌獸疫亞種和豬鏈球菌2型)簡(jiǎn)稱海利苗、

武漢科前生物股份有限公司提供豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗(2型LT株+7型YZ株+C群XS株)簡(jiǎn)稱科前苗。

1.1.3攻毒用毒株選取豬鏈球菌血清2型LT株，來(lái)源于武漢科前生物股份有限公司，僅用于攻毒試驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1疫苗安全性比較試驗(yàn)將30頭健康仔豬隨機(jī)分為6組，每組5頭。其中第一組至第三組為豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，每頭仔豬頸部肌肉接種10頭份；第四組為海利苗，每頭仔豬頸部肌肉接種2頭份；第五組為科前苗，每頭仔豬頸部肌肉接種2頭份；第六組為空白對(duì)照。于各疫苗組接種后觀察14天，監(jiān)測(cè)豬群體溫和臨床癥狀，評(píng)價(jià)豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗和商品疫苗安全性之間差異。

1.2.2疫苗效力比較試驗(yàn)將40頭健康仔豬隨機(jī)分4組，每組10頭。其中，第一組為豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗；第二組為海利苗；第三組為科前苗；第四組為攻毒對(duì)照組。各試驗(yàn)組，每頭仔豬頸部肌肉接種1頭份。其中，第二組按照說(shuō)明書(shū)首免21天后以相同劑量進(jìn)行二免，在二免后14天進(jìn)行攻毒。由于海利苗需兩次免疫，所以其他疫苗免疫組較海利疫苗免疫組推遲一周免疫接種。

1.2.3疫苗攻毒保護(hù)性試驗(yàn)將豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗和科前苗免疫28天后，即海利苗免疫35天后(提前7天初次免疫)，對(duì)包括攻毒對(duì)照組的所有仔豬進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。攻毒用菌株為豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株LT株，攻毒方式為耳靜脈注射，攻毒劑量為一個(gè)致死劑量(1.2×10⁶CFU)，比較3種疫苗的免疫效力。

2結(jié)果與分析

2.1疫苗安全性比較豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗高劑量(10頭份/頭)接種仔豬，在接種部位不見(jiàn)紅腫、感染等異常?？魄懊绺邉┝?2頭份/頭)接種仔豬，接種部位眼觀可見(jiàn)紅腫，但在觀察期內(nèi)逐漸恢復(fù)，海利苗高劑量(2頭份/頭)接種仔豬，接種部位眼觀可見(jiàn)輕微紅腫。

疫苗接種前后對(duì)豬群體溫與臨床癥狀監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，在接種活疫苗后引起機(jī)體體溫波動(dòng)幅度較小，體溫升高較滅活疫苗低。科前苗由于佐劑為油包水疫苗在接種后12h內(nèi)，豬群平均體溫超過(guò)40.5℃，第二天恢復(fù)正常。海利苗在接種12h內(nèi)，豬群平均體溫超過(guò)40℃，第二天恢復(fù)正常。豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗在接種疫苗后12h內(nèi)，豬群平均體溫上升幅度較小，均不超過(guò)基礎(chǔ)體溫0.5℃(見(jiàn)表10)

表10：仔豬安全試驗(yàn)疫苗接種前后體溫檢測(cè)結(jié)果

2.2免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

采用豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗和科前苗在免疫28天后，海利滅活苗35天后(提前7天初次免疫)，對(duì)包括攻毒對(duì)照組在內(nèi)所有仔豬進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。攻毒后觀察發(fā)病和死亡情況，統(tǒng)計(jì)疫苗保護(hù)率，(結(jié)果見(jiàn)表11)。

表11：仔豬免疫后攻毒試驗(yàn)結(jié)果

由表11結(jié)果可以看出，未免疫攻毒對(duì)照仔豬9/10發(fā)病，死亡7/10，說(shuō)明攻毒試驗(yàn)成立。而免疫組中，豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，攻毒后2/10發(fā)病，1/10死亡；疫苗對(duì)照組中海利苗攻毒后3/10發(fā)病，1/10死亡；科前苗攻毒后1/10發(fā)病，0/10死亡。

3結(jié)論

從攻毒保護(hù)試驗(yàn)可以看出，豬鏈球菌2型XD株活疫苗與對(duì)照試驗(yàn)苗攻毒保護(hù)相當(dāng)，均在80％-100％，能對(duì)豬群起到有效保護(hù)。通過(guò)攻毒保護(hù)試驗(yàn)可以證明SS2-XD株活疫苗針對(duì)豬鏈球菌2型免疫效力和滅活疫苗一致。

實(shí)施例6：

豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗免疫持續(xù)期與抗體消長(zhǎng)規(guī)律檢驗(yàn)

1材料與方法

1.1疫苗

豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，5.0×10⁸CFU/頭份，由實(shí)施例3所制備的凍干粉和實(shí)施例4所制備稀釋劑稀釋制得。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)買于武漢某豬場(chǎng)28-35日齡健康仔豬，經(jīng)豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(武漢科前生物股份有限公司提供)檢測(cè)抗體為陰性。

1.3攻毒用毒株選取豬鏈球菌血清2型LT株，來(lái)源于武漢科前生物股份有限公司，僅用于攻毒試驗(yàn)。

1.4方法

1.4.1免疫程序豬鏈球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗進(jìn)行頸部肌肉接種28-35日齡仔豬，每頭仔豬免疫1頭份，一共接種免疫仔豬15頭。同時(shí)設(shè)立非免疫空白對(duì)照仔豬5頭。

1.4.2抗體檢測(cè)于免疫后14天、28天、60天、90天、120天、150天采血分離血清，使用豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體水平，了解抗體消長(zhǎng)規(guī)律和免疫持續(xù)期。

1.4.3攻毒試驗(yàn)將免疫120天后的15頭仔豬中隨機(jī)抽取5頭和空白對(duì)照5頭進(jìn)行耳靜脈攻毒試驗(yàn)。攻毒劑量為一個(gè)致死劑量(1.2×10⁶CFU)。攻毒后觀察14天，統(tǒng)計(jì)臨床發(fā)病與死亡情況。

2結(jié)果與分析

2.1抗體消長(zhǎng)規(guī)律檢測(cè)結(jié)果

從抗體檢測(cè)結(jié)果表明，仔豬在免疫后14天ELISA抗體即可以轉(zhuǎn)陽(yáng)，在免疫后28天～60天抗體達(dá)到最高水平，在60天后開(kāi)始下降，保護(hù)抗體水平(OD630值≥0.5)能持續(xù)至首免120天，(結(jié)果見(jiàn)表12和圖6)

表12：抗體消長(zhǎng)規(guī)律檢測(cè)結(jié)果

2.2攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)檢測(cè)抗體水平，疫苗免疫期至少可以持續(xù)120天(OD630nm≥0.6)，為進(jìn)一步驗(yàn)證該疫苗免疫期，將免疫120天后隨機(jī)挑選5頭和空白組5頭進(jìn)行一個(gè)致死量(1.2×10⁶CFU)耳靜脈攻毒試驗(yàn)。攻毒結(jié)果表明，在攻毒3天內(nèi)，非免疫空白組全部發(fā)病，死亡4頭，而免疫組在14天觀察期內(nèi)有一頭發(fā)病，保護(hù)率達(dá)到80％以上(見(jiàn)表13)。此攻毒結(jié)果和免疫抗體消長(zhǎng)規(guī)律分析結(jié)論一致。因此可以認(rèn)為該疫苗可以提供4個(gè)月保護(hù)。

表13：疫苗免疫120天后攻毒保護(hù)結(jié)果

從免疫抗體消長(zhǎng)規(guī)律和攻毒結(jié)果看，仔豬在免疫14天后抗體開(kāi)始轉(zhuǎn)陽(yáng)，在免疫60～90天時(shí)抗體水平最高，在90天后開(kāi)始下降。結(jié)合抗體水平與攻毒保護(hù)相關(guān)性分析，抗體保護(hù)期可以持續(xù)120天。于免疫120天后，隨機(jī)抽取免疫仔豬5頭，連同空白對(duì)照5頭，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，免疫組保護(hù)在80％以上，而空白組全部發(fā)病。因此可以說(shuō)明疫苗的保護(hù)期為4個(gè)月。