本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體內(nèi)容涉及一株高產(chǎn)真菌淀粉酶的米曲霉突變菌株。
技術(shù)背景
淀粉酶是能催化淀粉水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其它低聚糖的一群酶的總稱，它廣泛存在于動植物和微生物中。淀粉是綠色植物通過光合作用獲得的最大量的碳水化合物之一，在自然界中儲量豐富。淀粉作為農(nóng)業(yè)第一大產(chǎn)品，其原料深加工是糧食與食品加工中的重要組成部分。淀粉是發(fā)酵工業(yè)的主要原料,通過發(fā)酵可以生產(chǎn)出眾多產(chǎn)品,如乙醇、甘油、有機酸、氨基酸、酶等,也可以生產(chǎn)高附加值的生物制劑和藥品。通過對淀粉的生化處理可以提高淀粉產(chǎn)品的附加值,這些都需要淀粉酶的參與。淀粉酶是最早用于工業(yè)化生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一，早在數(shù)前年前，人類就已利用高溫與中溫淀粉酶的作用從事釀酒、制飴糖等。
淀粉酶依作用機理分主要為三種：1）α-淀粉酶，從淀粉分子內(nèi)部水解α-1，4-糖苷鍵，而對淀粉分子的α-1，6-糖苷鍵不能水解，但它可跨越α-1，6-糖苷鍵，對分子內(nèi)的α-1，4-糖苷鍵起作用，且水解α-1，4-糖苷鍵的先后次序是無規(guī)律的。2）β-淀粉酶，從淀粉分子的非還原性末端開始，水解相間隔的α-1，4糖苷鍵，依次切下一個麥芽糖分子。β-淀粉酶也只能水解α-1，4-糖苷鍵，而不能水解α-1，6-糖苷鍵，且不能跨越α-1，6-糖苷鍵，遇此鍵水解作用就停止。3）葡萄糖淀粉酶，從淀粉分子的非還原性末端開始，逐次切下一個個葡萄糖。它不僅能水解α-1，4-糖苷鍵,而且能水解α-1，6-糖苷鍵和α-1，3-糖苷鍵，只是水解后兩者的速度較前者要慢得多，因此，葡萄糖淀粉酶作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉時，能將它們?nèi)克鉃槠咸烟恰?/p>
淀粉酶是重要的酶制劑，廣泛應(yīng)用于麥芽糖、糖漿、糊精等的生產(chǎn)，在紡織工業(yè)中，淀粉酶可催化織物上的淀粉漿料，由于淀粉酶的高效性及專一性，酶退漿的退漿率高，退漿快，污染少，產(chǎn)品比酸法、堿法更柔軟，且不損傷纖維。在酒精生產(chǎn)和釀酒工業(yè)中使用霉菌淀粉酶能有效提高糖化率，酒精出率和酶母的生長。淀粉酶還可應(yīng)用于出來淀粉生產(chǎn)過程中的廢水，減輕對環(huán)境的污染。因此現(xiàn)在對淀粉酶的研究成為熱點。目前，淀粉酶的生產(chǎn)主要利用微生物發(fā)酵。淀粉酶產(chǎn)生菌主要有細菌（如枯草桿菌、地衣芽孢桿菌等）和真菌（如黑曲霉、米曲霉和根霉等等），篩選出高產(chǎn)、遺傳穩(wěn)定性好、生活力旺盛的淀粉酶生產(chǎn)菌株，是拓寬淀粉酶工業(yè)生產(chǎn)的重要途徑。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一株高產(chǎn)真菌淀粉酶的米曲霉突變菌株及其應(yīng)用。申請人通過紫外誘變的方法篩選獲得一株突變菌株，真菌淀粉酶的表達量得到大幅提高。
本發(fā)明一方面涉及一種突變菌株米曲霉TA20（Aspergillus oryzae TA20），已于2016年10月31日保藏于中國武漢 武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2016602。
本發(fā)明還涉及上述米曲霉TA20在真菌淀粉酶生產(chǎn)中的應(yīng)用。
一種生產(chǎn)真菌淀粉酶的發(fā)酵方法，是以上述米曲霉TA20為發(fā)酵菌株。
所述的發(fā)酵方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基各組分及其質(zhì)量百分比分別為：麥芽糖12%；玉米漿1%；硫酸銨0.5%；磷酸二氫鉀0.35%；磷酸氫二鉀0.75%；七水硫酸鎂0.03%。
所述的發(fā)酵方法中發(fā)酵溫度選用30℃。
本發(fā)明通過紫外誘變篩選獲得的突變菌株米曲霉TA20，其搖瓶發(fā)酵5d后，菌株發(fā)酵上清液中真菌淀粉酶酶活2184u/ml，比出發(fā)菌株提高了146%，取得了意料不到的技術(shù)效果。所述突變菌株有利于降低真菌淀粉酶的生產(chǎn)成本，促進真菌淀粉酶在食品行業(yè)中的推廣與應(yīng)用。
具體實施方式
本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明所記載的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，采用本領(lǐng)域其它常規(guī)的方法、實驗方案和試劑，而不限于本發(fā)明具體實施例的限定。
下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行詳細描述。
實施例1 真菌淀粉酶菌株搖瓶發(fā)酵及酶活檢測
將真菌淀粉酶產(chǎn)酶菌株米曲霉TA01（Aspergillus oryzae TA01）（該菌株由發(fā)明人徐曉東于2014年9月篩選自山東青島市嶗山區(qū)林場土壤中）接種到新鮮的PDA平板，30℃培養(yǎng)5-7d。
割取2cm×2cm大小的菌塊，接種至50ml液體搖瓶培養(yǎng)基（麥芽糖12%；玉米漿1%；硫酸銨0.5%；磷酸二氫鉀0.35%；磷酸氫二鉀0.75%；七水硫酸鎂0.03%）中發(fā)酵，30℃培養(yǎng)5d；離心菌體，獲得上清液即為粗酶液，將發(fā)酵上清液進行真菌淀粉酶酶活力測定，其真菌淀粉酶酶活為885 u/ml。
1.真菌淀粉酶酶活力檢測
（1）真菌淀粉酶酶活單位的定義
在40℃，pH為5.0條件下，反應(yīng)30min，反應(yīng)液中產(chǎn)生相當(dāng)于10mg葡萄糖的還原糖所需的酶量，定義為一個活力單位（IU）。
（2）酶活測定方法
（2.1） 試劑和溶液：
30%碘化鉀溶液：碘化鉀150g溶解于350ml水中，保存在褐色試劑瓶中；
25%硫酸溶液：硫酸125g溶于375ml水中；
0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液：將定量分析用的0.1mol/L硫代硫酸鈉母液500ml用煮沸過的冷卻水稀釋，所得溶液的總體積為1000ml。配制好后，應(yīng)進行標(biāo)定，求出濃度校正系數(shù)f值；
1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）：將1mol/L乙酸鈉溶液加入到1mol/L的乙酸溶液中，調(diào)pH到5.0；
可溶性淀粉溶液（pH 5.0）：將可溶性淀粉在105℃干燥4h后稱量計算含水量。然后根據(jù)可溶性淀粉的含水量秤取0.50g（折干）的可溶性淀粉，緩慢加入到沸水50ml中，煮沸5min，用自來水冷卻后，加入1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）5ml，用水定容至100ml；
費林試劑：
—銅溶液：硫酸銅34.66g溶解在水中，定容至500ml；
—酒石酸鉀鈉堿溶液：酒石酸鉀鈉173g和氫氧化鈉50g溶解在水中，定容至500ml；
—使用前，精確取等體積的銅溶液和酒石酸鉀鈉堿溶液充分混合。
（2.2）樣品溶液的制備：
用水稀釋酶樣品，使得到酶液的（T0-T30）×f ×1.62值為3mg~6mg葡萄糖量。
示例：真菌α-淀粉酶：[n=50000] 稀釋1ml—250ml，再稀釋1ml—200ml。
（2.3）酶活力測定：
將可溶性淀粉溶液10ml加到100ml Erlenmyer三角瓶中，置于40℃恒溫水浴中，預(yù)熱10~15min，加入稀釋好的酶液1ml。準(zhǔn)確反應(yīng)30min后，加入費林試劑4ml使酶失活。將三角瓶直接在電爐上加熱2min后，立即放在自來水中冷卻。隨后，加入30%碘化鉀溶液2ml和25%硫酸溶液2ml，用0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定游離出的碘，以藍色消失作為滴定終點T30（ml）。
空白對照實驗：以水取代酶液，在另一個三角瓶中用上述同樣的操作步驟測定空白對照值T0（ml），臨近終點時，加入1%可溶性淀粉溶液1滴~2滴，以藍色消失作為滴定終點。
酶活計算公式：
酶活力（U/ml或U/g）＝(T0-T30)×f×1.62×0.1×n
式中：T0 ――空白溶液滴定消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；
T30――酶反應(yīng)液滴定消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；
f ――0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液濃度的校正系數(shù)；
1.62——換算系數(shù)；
0.1——該分析方法的常數(shù)（相當(dāng)于10mg葡萄糖的還原糖）；
n ―― 酶樣的稀釋倍數(shù)；
實施例2 真菌淀粉酶菌株的誘變篩選
確定致死率：將上述米曲霉TA01接種于PDA平板，30℃培養(yǎng)5-7d。待菌落表面產(chǎn)生大量孢子時，吸取5ml無菌水洗脫，獲得孢子液，離心后用無菌水重懸，用血球計數(shù)板計數(shù)。取一個90mm培養(yǎng)皿，加入5ml稀釋好的孢子懸液（濃度約為1×107個/mL），加入轉(zhuǎn)子并在磁力攪拌器上攪拌使孢子液處于均勻狀態(tài)。在無菌超凈工作臺中，用功率為9w的紫外燈于垂直距離20cm的上方照射，分別照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀釋10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培養(yǎng)2-3d后計數(shù)，以未照射的孢子液為對照，計算致死率。其中照射120s時，致死率為95%，選取該照射時間進行后續(xù)誘變實驗。
誘變篩選：取一個90mm培養(yǎng)皿，加入5ml稀釋好的孢子懸液（濃度為1×107），加入轉(zhuǎn)子并在磁力攪拌器上攪拌使孢子液處于均勻狀態(tài)。在無菌超凈工作臺中，用功率為9w的紫外燈于垂直距離20cm的上方照射，照射120s后稀釋1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培養(yǎng)2-3d。
共涂布200塊PDA平板，30℃培養(yǎng)2-3d后，每個平板長出30-50個菌落，先通過菌落形態(tài)，篩選短分枝的突變體，挑取菌落形態(tài)較小、菌絲致密、菌落周圍絨毛較短的突變體126個接種到PDA平板，30℃培養(yǎng)5-7d。每個轉(zhuǎn)化子割取2cm×2cm大小的菌塊，分別接種于50ml液體搖瓶培養(yǎng)基（麥芽糖12%；玉米漿1%；硫酸銨0.5%；磷酸二氫鉀0.35%；磷酸氫二鉀0.75%；七水硫酸鎂0.03%）中發(fā)酵，30℃培養(yǎng)5d后，離心菌體獲得上清液即為粗酶液。通過對獲得的粗酶液進行真菌淀粉酶酶活力檢測，申請人最終篩選出一株真菌淀粉酶產(chǎn)量最高的突變菌株，命名為米曲霉TA20（Aspergillus oryzae TA20），該菌株發(fā)酵上清液真菌淀粉酶酶活2184u/ml，比出發(fā)菌株提高了146%，取得了意料不到的技術(shù)效果。
申請人已于2016年10月31日將米曲霉TA20（Aspergillus oryzae TA20）保藏于中國武漢 武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2016602。