本發(fā)明涉及一種新型菌株，具體涉及一種降解纖維素的不動桿菌。

背景技術(shù)：

我國是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，每年依靠農(nóng)業(yè)生產(chǎn)能夠為國民經(jīng)濟(jì)提供巨大支持。但是隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動的迅猛發(fā)展，產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)廢棄物(如作物殘體、畜禽糞便等)的數(shù)量也越來越多。

作物秸稈中含有大量的纖維素資源，纖維素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分，也是自然界中儲量豐富，分布廣泛的一種多糖物質(zhì)。傳統(tǒng)的焚燒或理化處理方式不但污染環(huán)境還存在著成本高，處理工藝復(fù)雜，降解率低等問題。

利用微生物處理秸稈資源，能夠?qū)⒔斩捴须y降解的纖維素類物質(zhì)分解成可以被植物利用的有機(jī)質(zhì)，變廢為寶，還能減輕農(nóng)業(yè)廢棄物對環(huán)境造成的負(fù)擔(dān)。

目前針對纖維素降解菌的報導(dǎo)中多為好氧菌。好氧型的纖維素降解菌，較容易分離得到，其纖維素酶活力也較高，但在堆肥生產(chǎn)時，好氧菌在通氧量減少的情況下生長受到限制，因此在高溫期后仍需保持高通氧量，增加生產(chǎn)成本，且由于氧含量不均勻?qū)е聼o法保證均勻發(fā)酵，其應(yīng)用于規(guī)?；亩逊蕰r受到限制。

國內(nèi)外學(xué)者利用厭氧培養(yǎng)技術(shù)展開的厭氧纖維素降解菌的分離篩選工作也取得了一些進(jìn)展。從反芻動物瘤胃中分離出的一些專性厭氧菌雖具有較強(qiáng)的纖維素分解能力，但由于空氣中的氧氣對專性厭氧菌的毒害作用，其培養(yǎng)應(yīng)用于生產(chǎn)也比較困難，同樣受到限制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一株具有纖維素降解能力的兼性厭氧的不動桿菌Acinetobacter sdwt001，保藏編號為CGMCC No.13120，保存日期為2016年10月18日，分類名為不動桿菌(Acinetobacter sp.)保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

本發(fā)明還提供上述具有纖維素降解能力的兼性厭氧的不動桿菌的應(yīng)用，所述應(yīng)用為其在纖維素降解中的應(yīng)用如秸稈堆肥。

本發(fā)明提供的具有纖維素降解能力的兼性厭氧的不動桿菌，其在好氧和厭氧的條件下均有較高的纖維素降解酶活力，克服了傳統(tǒng)好氧菌或厭氧菌對發(fā)酵環(huán)境要求嚴(yán)格的問題；其應(yīng)用于多種環(huán)境下的纖維素降解，包括應(yīng)用于規(guī)?；慕斩挾逊噬a(chǎn)等含氧量情況復(fù)雜的環(huán)境中，可避免人工保持高通氧量，降低工藝成本，保證均勻發(fā)酵，提高堆肥或其他應(yīng)用環(huán)境的纖維素分解效率。

附圖說明

圖1為16s rDNA序列PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中1泳道為菌株sdwt001,2泳道為Marker DL2000；

圖2為好氧條件下不動桿菌sdwt001的酶活隨培養(yǎng)時間的變化情況；

圖3為微溶氧條件下不動桿菌sdwt001的酶活隨培養(yǎng)時間的變化情況。

具體實施方式

實施例1

菌株的分離、純化

堆肥樣品采集自山東省青州市堆肥廠的蔬菜秸稈堆肥。

取10g腐熟期的堆肥樣品，加入裝有100ml無菌水(帶玻璃珠)的三角瓶中，振蕩20min。取5ml樣品懸液接入裝有100ml液體LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃，180r/min振蕩培養(yǎng)8h：分別取培養(yǎng)后的菌液1ml，加入到9ml無菌水中，用無菌水以梯度稀釋法制成稀釋度為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的樣液，各取100μl分別涂布于以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基，每個稀釋度做三個平行樣。37℃條件下先后于好氧和厭氧培養(yǎng)箱分別恒溫培養(yǎng)48h，挑取各平板上的單菌落在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化。挑取純化后的單菌落接于纖維素分解菌鑒別培養(yǎng)基平板，先后于好氧和厭氧培養(yǎng)箱中分別37℃恒溫培養(yǎng)，記錄各菌株的透明圈直徑D與菌落直徑d變化，篩選出D/d值較大的菌株。

上述羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基配方為：CMC-Na 5g,KH₂PO₄ 1g,瓊脂17g,NaN0₃ 3g,KCl 0.5g,MgSO₄ 0.5g,FeSO₄ 0.01g,蒸餾水1000ml(調(diào)節(jié)pH在5.5-6.0)。

上述纖維素分解菌鑒別培養(yǎng)基配方為：(NH4)2SO4 0.2g，MgSO4 0.05g,KH2PO4 0.1g,NaCl0.05g,CMC-Na 2.0g,剛果紅0.02g，瓊脂2.0g，蒸餾水1000ml，pH自然。

實施例2

菌種鑒定

選擇好氧和厭氧培養(yǎng)下D/d值較大的菌株分別進(jìn)行基因組DNA提取。DNA使用TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。取5μl點(diǎn)樣，以λEcoT14為Marker，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測,電泳圖如圖1所示，其余-20℃保存。

對提取到的基因組DNA進(jìn)行16s rDNA PCR擴(kuò)增。采用16s rDNA通用引物，以所提取到的菌株基因組DNA為模板，按照如下反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：上游引物P1(008F)AGAGTTTGATCMTGGCTCAG下游引物P2(1392R)CGGGCGGTGTGTRC反應(yīng)體系如下表所示。PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖電泳檢測。

表1 16s rDNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測純度后測序，將所有好氧菌和厭氧菌的測序結(jié)果進(jìn)行比對，選取菌落形態(tài)相同，同源性最高的菌落，確認(rèn)其為同一株菌，命名為不動桿菌(Acinetobacter sp.)sdwt001。該菌株在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h后，其菌落特征是：乳白色，不規(guī)則形，直徑約為2mm，表面濕潤，中央稍突起，不透明，邊緣完整。其菌體細(xì)胞特征為：短桿菌，長度約為2μm。革蘭氏染色呈陰性。將獲得的16s rDNA基因序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果顯示與Acinetobacter sp.C16的同源性最高，為不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)。將該菌株命名為Acinetobacter sdwt001，于2016年10月18日，交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號為CGMCC NO.13120。

實施例3

好氧條件下纖維素水解酶活性的測定

用接種環(huán)挑取不動桿菌Acinetobacter sdwt001單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、160r/min條件下培養(yǎng)24h。各取10ml種子液分別轉(zhuǎn)接于90ml以濾紙或羧甲基纖維素鈉為碳源的PCS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，160r/min，37℃培養(yǎng)。分別于發(fā)酵的第3,4,5天各取10ml發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心10min，取上清液即為相應(yīng)酶活的待測粗酶液。

取2ml 1％的羧甲基纖維素鈉(用0.1M pH＝4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制)作底物，取0.5ml相應(yīng)粗酶液，于具塞刻度試管中50℃保溫1h，以加熱滅活的粗酶液作對照，采用DNS法測定還原糖生成量。

取0.5ml相應(yīng)的粗酶液，加入2ml 0.1M pH＝4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，將1cm×6cm的新華濾紙條卷成小卷置于具塞刻度試管底部，50℃保溫1h，以加熱滅活的粗酶液作對照，采用DNS法測定還原糖生成量。

在每個具塞刻度試管中加1.5ml DNS試劑，沸水浴5min，立即用流動水冷卻。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白為對照，測定其OD₅₄₀值。

酶活定義：在一定的溫度及pH條件下，1min使底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量為一個酶活單位，以IU/ml表示。

如圖2所示，好氧條件下，在培養(yǎng)第4天不動桿菌Acinetobacter sdwt001的濾紙酶活和羧甲基纖維素鈉酶活均達(dá)到了最高，分別為2.81IU/ml和2.51IU/ml。

上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法：

準(zhǔn)確配制2mg/ml的葡萄糖溶液100ml。取7支具塞試管，編號為1、2、3、4、5、6、7，向各管中加入不同量的蒸餾水和葡萄糖溶液，制成最終濃度為0、200、400、600、800、1000、1200μg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。向每個試管中加入1.5mlDNS試劑，沸水浴5min，立即用流動水冷卻。搖勻后以1號試管為空白對照，測定各管在波長為540nm處的吸光值。以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實施例4

微溶氧條件下纖維素水解酶活性的測定

用接種環(huán)挑取不動桿菌(Acinetobacter sp.)sdwt001單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)24h。各取10ml種子液分別轉(zhuǎn)接于90ml以濾紙或羧甲基纖維素鈉為纖維素碳源的PCS培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)。分別于發(fā)酵的第3,4,5天各取10ml發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心10min，取上清液即為相應(yīng)酶活的待測粗酶液。

取2ml 1％的羧甲基纖維素鈉(用0.1M pH＝4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制)作底物，取0.5ml相應(yīng)粗酶液，于具塞刻度試管中50℃保溫1h，以加熱滅活的粗酶液作對照，采用DNS法測定還原糖生成量。

取0.5ml相應(yīng)的粗酶液，加入2ml 0.1M pH＝4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，將1cm×6cm的新華濾紙條卷成小卷置于具塞刻度試管底部，50℃保溫1h，以加熱滅活的粗酶液作對照，采用DNS法測定還原糖生成量。

在每個具塞刻度試管中加1.5ml DNS試劑，沸水浴5min，立即用流動水冷卻。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白為對照，測定其OD₅₄₀值。

酶活定義：在一定的溫度及pH條件下，1min使底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量為一個酶活單位，以IU/ml表示。

如圖3所示，經(jīng)測定，在微溶氧條件下FPA酶活在培養(yǎng)的第4天達(dá)到最高為2.98IU/ml,CMC酶在第5天時達(dá)到最高活性，為1.30IU/ml。

上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法：

準(zhǔn)確配制2mg/ml的葡萄糖溶液100ml。取7支具塞試管，編號為1、2、3、4、5、6、7，向各管中加入不同量的蒸餾水和葡萄糖溶液，制成最終濃度為0、200、400、600、800、1000、1200μg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。向每個試管中加入1.5mlDNS試劑，沸水浴5min，立即用流動水冷卻。搖勻后以1號試管為空白對照，測定各管在波長為540nm處的吸光值。以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

SEQUENCE LISTING

<110>山東沃泰生物科技有限公司

<120>一種具有纖維素降解能力的兼性厭氧的不動桿菌及其應(yīng)用

<160> 2

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

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