本發(fā)明涉及一種細(xì)菌基因編輯方法，特別是涉及一種利用CRISPR/Cas9技術(shù)來(lái)增加大腸桿菌和藍(lán)綠菌的基因編輯效率以及基因重組成功率的細(xì)菌基因編輯方法。

背景技術(shù)：

利用傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)來(lái)改造細(xì)菌以進(jìn)行代謝工程時(shí)，需把所述細(xì)菌DNA的某些基因剔除或是同時(shí)放入好幾個(gè)基因，若將這些基因一次放入，片段會(huì)很大，因此須分好幾次把這些基因放進(jìn)去，于過(guò)程中會(huì)加入抗生素、再篩選、接著把抗生素移除，重復(fù)這些步驟直到基因放入完全為止，其步驟繁雜又耗時(shí)。

CRISPR/Cas9為近年來(lái)備受矚目的基因編輯技術(shù)，相較于傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9因可以同時(shí)剔除或放入多個(gè)基因，增加了基因編輯的便利性，技術(shù)也相對(duì)簡(jiǎn)單。然而，在過(guò)去的研究中，CRISPR/Cas9多用在哺乳動(dòng)物的基因編輯，顯少應(yīng)用在細(xì)菌中，即使有應(yīng)用在細(xì)菌的研究結(jié)果，可以放入的DNA片段也較小，到3kb以上就有效率降低的現(xiàn)象。

因此，如何利用CRISPR/Cas9來(lái)提升在細(xì)菌中的基因編輯效率，以克服上述的缺失，已成為本領(lǐng)域所欲解決的重要課題之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種細(xì)菌基因編輯方法，用以將大片段的DNA放入菌體中，以增加細(xì)菌的基因編輯的速度，并提升細(xì)菌進(jìn)行基因重組的成功率。

為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的一種技術(shù)方案是，提供一種細(xì)菌基因編輯方法，其步驟包括：提供一菌體；將一pCas9質(zhì)粒和一pKD46質(zhì)粒送入菌體中；將一pCRISPR::LacZ質(zhì)粒和一外源DNA共同送入含有pCas9及pKD46質(zhì)粒的菌體中，以得到一培養(yǎng)菌液；以及將培養(yǎng)菌液涂布在一培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

優(yōu)選地，將所述pCRISPR::LacZ質(zhì)粒和所述外源DNA共同送入含有所述pCas9及pKD46質(zhì)粒的所述菌體中的步驟后，還包括：利用Cas9蛋白及可辨視LacZ基因的向?qū)NA在所述菌體中的一LacZ基因位置進(jìn)行專(zhuān)一性地切割；以及將所述外源DNA插入所述菌體內(nèi)具有專(zhuān)一性切割位置的所述LacZ基因中，以得到所述培養(yǎng)菌液。

優(yōu)選地，所述菌體為大腸桿菌。

優(yōu)選地，所述大腸桿菌為MG1655菌株。

優(yōu)選地，所述pCRISPR::LacZ質(zhì)粒為一可辨視LacZ基因的向?qū)NA。

優(yōu)選地，將所述pCas9質(zhì)粒和所述pKD46質(zhì)粒送入所述菌體的方法為電穿孔轉(zhuǎn)型法。

優(yōu)選地，將所述pCRISPR::LacZ質(zhì)粒和所述外源DNA共同送入含有所述pCas9質(zhì)粒及所述pKD46質(zhì)粒的所述菌體中的方法為電穿孔轉(zhuǎn)型法。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、卡那霉素、以及四環(huán)霉素。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)菌液的培養(yǎng)條件為，以37℃培養(yǎng)16至24小時(shí)。

為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的另一種技術(shù)方案是，提供一種提供一菌體；將一pHR_trc模板質(zhì)粒和一pCas9-NSI質(zhì)粒共同送入所述菌體中，以得到一培養(yǎng)菌液；以及將所述培養(yǎng)菌液涂布在一培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

優(yōu)選地，所述菌體為藍(lán)綠菌。

優(yōu)選地，所述藍(lán)綠菌為細(xì)長(zhǎng)聚球藻的S.elongatus PCC 7942菌株。

優(yōu)選地，所述pHR_trc模板質(zhì)粒用以作為一同源互換的模板。

優(yōu)選地，所述pHR_trc模板質(zhì)粒上含有：一抵抗抗生素觀霉素的基因SpecR、一熒光蛋白EGFP、以及同源互換區(qū)域NSIa和NSIb。

優(yōu)選地，所述pCas9-NSI質(zhì)粒用以正確地結(jié)合到一預(yù)定位置并進(jìn)行基因重組作用。

優(yōu)選地，所述預(yù)定位置為一雙股斷裂位置。

優(yōu)選地，將所述pHR_trc模板質(zhì)粒和所述pCas9-NSI質(zhì)粒送入所述菌體的方法為細(xì)菌自然吞噬法。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為含有觀霉素的BG-11培養(yǎng)基。

本發(fā)明至少具有以下有益效果：本發(fā)明實(shí)施例所提供的細(xì)菌基因編輯方法，可將大片段的DNA放入菌體中，并成功地進(jìn)行細(xì)菌的基因重組。因此，借由本發(fā)明的細(xì)菌基因編輯系統(tǒng)和方法，可用來(lái)增加在細(xì)菌進(jìn)行基因編輯過(guò)程中的便利性，更可以加快細(xì)菌基因編輯運(yùn)作的速度，以改造細(xì)菌的DNA。未來(lái)更可借由應(yīng)用在調(diào)控細(xì)菌的代謝路徑，達(dá)到生產(chǎn)生質(zhì)化學(xué)品的目標(biāo)，來(lái)取代傳統(tǒng)石油裂解的重污染制程。

為使能更進(jìn)一步了解本發(fā)明的特征及技術(shù)內(nèi)容，請(qǐng)參閱以下有關(guān)本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明與附圖，然而所提供的附圖僅用于提供參考與說(shuō)明，并非用來(lái)對(duì)本發(fā)明加以限制。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明第一實(shí)施例的細(xì)菌基因編輯方法的流程圖。

圖2為本發(fā)明第一實(shí)施例中，不同長(zhǎng)度的外源DNA示意圖。

圖3為本發(fā)明第一實(shí)施例的細(xì)菌基因編輯方法的示意圖。

圖4為本發(fā)明第一實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)一的藍(lán)/白篩選測(cè)試法的菌落數(shù)結(jié)果。

圖5為本發(fā)明第一實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)一的藍(lán)/白篩選測(cè)試法的菌落數(shù)直方圖。

圖6為本發(fā)明第一實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)一的菌落快速檢驗(yàn)聚合酶連鎖反應(yīng)的結(jié)果。

圖7為本發(fā)明第一實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)一的外源DNA插入染色體的分析結(jié)果。

圖8為本發(fā)明第二實(shí)施例的細(xì)菌基因編輯方法的流程圖。

圖9為本發(fā)明第二實(shí)施例的細(xì)菌基因編輯方法的示意圖。

圖10為本發(fā)明第二實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)二所使用的模板質(zhì)粒示意圖。

圖11為本發(fā)明第二實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)二的藍(lán)綠菌同源重組效率結(jié)果。

圖12為本發(fā)明第二實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)二的基因重組效率直方圖。

具體實(shí)施方式

以下是通過(guò)特定的具體實(shí)例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明所揭露有關(guān)“細(xì)菌基因編輯方法”的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū)所揭示的內(nèi)容了解本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明可通過(guò)其他不同的具體實(shí)施例加以施行或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)亦可基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在不悖離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾與變更。另外，本發(fā)明的圖式僅為簡(jiǎn)單示意說(shuō)明，并非依實(shí)際尺寸的描繪，先予敘明。以下的實(shí)施方式將進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的相關(guān)技術(shù)內(nèi)容，但所揭示的內(nèi)容并非用以限制本發(fā)明的技術(shù)范疇。

〔第一實(shí)施例〕

請(qǐng)參閱圖1所示，圖1為本發(fā)明第一實(shí)施例的細(xì)菌基因編輯方法的流程圖，其步驟以S101、S103、和S105表示。本發(fā)明第一實(shí)施例提供了一種細(xì)菌基因編輯方法，值得注意的是，本發(fā)明第一實(shí)施例所使用的菌體是大腸桿菌(Escherichia coli；E.coli)以下以大腸桿菌來(lái)作說(shuō)明。

本發(fā)明第一實(shí)施例提供的細(xì)菌基因編輯方法，其步驟包括：提供一大腸桿菌；將一pCas9質(zhì)粒和一pKD46質(zhì)粒利用電穿孔轉(zhuǎn)型法(Electroporation)送入大腸桿菌中；再將一pCRISPR::LacZ質(zhì)粒和一外源DNA以電穿孔轉(zhuǎn)型法共同送入含有pCas9及pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌中，再利用Cas9蛋白(由pCas9質(zhì)粒所表現(xiàn))及可辨視LacZ基因的向?qū)NA(由pCRISPR::LacZ質(zhì)粒所表現(xiàn))對(duì)大腸桿菌中的一LacZ基因位置進(jìn)行專(zhuān)一性地切割，此時(shí)，外源DNA會(huì)插入大腸桿菌內(nèi)具有專(zhuān)一性切割位置的LacZ基因中，進(jìn)行基因重組作用，以得到一培養(yǎng)菌液；以及將培養(yǎng)菌液涂布在一含有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside；IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside；X-gal，也簡(jiǎn)稱(chēng)為BCIG)、卡那霉素(Kanamycin；Km)、以及四環(huán)霉素(Tetracycline；Tc)的培養(yǎng)基上，以37℃培養(yǎng)16至24小時(shí)，再以藍(lán)/白篩選測(cè)試確認(rèn)基因重組的狀況。

其中，pCas9質(zhì)粒可為Addgene的pCas9#42876；而pKD46質(zhì)粒之序列可見(jiàn)于2013年公開(kāi)于EcoliWiki網(wǎng)頁(yè)(http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/pKD46)；而pCRISPR::LacZ于本發(fā)明實(shí)施例中的向?qū)NA序列為5’-agatgtgcggcgagttgcgtgactacctac-3’。

于本發(fā)明實(shí)施例中，pCRISPR::LacZ質(zhì)粒為可辨視LacZ基因的向?qū)NA(guide RNA；gRNA)。另外，本發(fā)明實(shí)施例利用電穿孔轉(zhuǎn)型法，將pCas9質(zhì)粒、pKD46質(zhì)粒、pCRISPR::LacZ質(zhì)粒、和外源DNA送入大腸桿菌中，其原理為，將一電場(chǎng)施加在菌體上，在極短的時(shí)間內(nèi)(微秒至毫秒)給予脈沖電擊，使菌體處于高電壓且低電容的環(huán)境下，當(dāng)細(xì)菌的細(xì)胞膜受到電場(chǎng)刺激時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)產(chǎn)生電位差(electrical potential)而造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變，此時(shí)，所會(huì)產(chǎn)生機(jī)械的壓擠力量使細(xì)胞膜被壓縮而變薄，并導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)產(chǎn)生局部的融裂且細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而產(chǎn)生無(wú)數(shù)微小的孔洞，使得外來(lái)的大分子或DNA片段便可以經(jīng)由這些短暫產(chǎn)生的孔洞進(jìn)入菌體中。

本發(fā)明第一實(shí)施例所使用的培養(yǎng)基為含有IPTG、X-gal、Km、以及Tc的培養(yǎng)基。其中，由于IPTG不會(huì)被大腸桿菌所代謝，所以在實(shí)驗(yàn)中不會(huì)成為變量，因此被用來(lái)作為本實(shí)驗(yàn)第一實(shí)施例的乳糖操縱子的誘導(dǎo)物。X-gal是一種由半乳糖連接取代吲哚所組成的有機(jī)化合物，為一種模擬的乳糖，被用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌的各種酶的活性。借由β-半乳糖苷酶來(lái)水解D-乳糖中的β-糖苷鍵，當(dāng)X-gal被β-半乳糖苷酶水解，則會(huì)產(chǎn)生半乳糖和5-溴-4-氯-3-羥基吲哚，而5-溴-4-氯-3-羥基吲哚會(huì)自發(fā)性地二聚化且氧化成5,5'-二溴-4,4'-二氯靛藍(lán)，此化合物為一種不溶性的深藍(lán)色產(chǎn)物。X-gal的本身是無(wú)色，但產(chǎn)生的產(chǎn)物為明顯的藍(lán)色，因此可被用來(lái)測(cè)定是否有β-半乳糖苷酶的存在或是β-半乳糖苷酶是否具有活性。因此，X-gal在本發(fā)明實(shí)施例中，被用作藍(lán)/白篩選的測(cè)試，其所產(chǎn)生的藍(lán)色菌落，表示外源DNA沒(méi)有插入菌體中，也就是說(shuō)，基因重組沒(méi)有成功；反的，所產(chǎn)生的白色菌落，表示外源DNA有插入菌體中，也就是說(shuō)，基因重組有成功。本發(fā)明第一實(shí)施例中的培養(yǎng)基中所含有的Km，是一種氨基糖酐類(lèi)的抗生素，借由抑制核醣體中的70S合成起始復(fù)合體的形成，以及引起起始fMet-tRNA在復(fù)合物上的脫落，而阻礙蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而抑制其他病菌生長(zhǎng)。本發(fā)明第一實(shí)施例中的培養(yǎng)基中所含有的Tc，是一種聚酮抗生素類(lèi)藥物，四環(huán)霉素借由能夠與核醣體中的30S次單元結(jié)合，阻斷t-RNA與核醣體中的A位置結(jié)合，而阻止蛋白質(zhì)合成，可用于對(duì)抗多種細(xì)菌感染。本發(fā)明將Km和Tc等抗生素加入培養(yǎng)基中，用以使大腸桿菌能免于受到其他細(xì)菌的污染。同時(shí)可篩選出含有pCRISPR::LacZ質(zhì)粒(帶有KmR抗生素基因)及外源DNA的插入(帶有TcR抗生素基因)。

本發(fā)明第一實(shí)施例利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行大腸桿菌的基因編輯，其實(shí)驗(yàn)步驟、條件、及結(jié)果在<實(shí)驗(yàn)一>詳述。

<實(shí)驗(yàn)一>

請(qǐng)參閱圖2和圖3，圖2為本發(fā)明第一實(shí)施例中，不同長(zhǎng)度的外源DNA示意圖、而圖3為本發(fā)明第一實(shí)施例的細(xì)菌基因編輯方法的示意圖。本發(fā)明選用MG1655菌株的大腸桿菌，將其應(yīng)用在本發(fā)明的基因編輯方法中，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組為，將帶有Cas9蛋白的質(zhì)粒(pCas9)以及帶有λ-red系統(tǒng)的質(zhì)粒(pKD46)送入大腸桿菌中。接著，再將帶有可辨視LacZ基因的gRNA的質(zhì)粒(pCRISPR::LacZ)，分別與長(zhǎng)度為1.4、2.4、3.9、5.4與7.0kb的外源DNA(donorDNA)，共同以電穿孔轉(zhuǎn)型法送入含有送入含有pCas9及pKD46的大腸桿菌中，并將其培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)菌液涂布在含有IPTG、X-gal、Km、和Tc的培養(yǎng)基上。而對(duì)照組則使用只含有pKD46的大腸桿菌，并同樣以電穿孔轉(zhuǎn)型法導(dǎo)入不同大小的外源DNA至含有pKD46的大腸桿菌中，最后將所得到的培養(yǎng)菌液涂布在含有IPTG、X-gal、和Tc的培養(yǎng)基上。將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組共同于37℃下培養(yǎng)16至24小時(shí)后，以藍(lán)/白篩選測(cè)試法定量計(jì)算白色菌落與藍(lán)色菌落的數(shù)目。其中，白色菌落表示基因重組成功，而藍(lán)色菌落則表示基因重組沒(méi)有成功。

請(qǐng)參閱圖4、圖5及表1，圖4為本發(fā)明第一實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)一的藍(lán)/白篩選測(cè)試法的菌落數(shù)結(jié)果、圖5為本發(fā)明第一實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)一的藍(lán)/白篩選測(cè)試法的菌落數(shù)直方圖、而表1為藍(lán)/白篩選測(cè)試法的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，平均白色菌落數(shù)依實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1.4、2.4、3.9、5.4、與7.0kb的組別分為223、37、3、2、與0個(gè)。在實(shí)驗(yàn)組中，平均白色菌落數(shù)依1.4、2.4、3.9、5.4、與7.0kb的組別分別為781、480、105、68、與8個(gè)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，不論是何種長(zhǎng)度，利用本發(fā)明第一實(shí)施例提供的細(xì)菌基因編輯方法，白色菌落的數(shù)目都有顯著增加的情況(p<0.05)，說(shuō)明利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在LacZ位置的專(zhuān)一性地切割，確實(shí)能促進(jìn)大腸桿菌的同源重組，也就是基因重組的成功機(jī)率。特別是在對(duì)照中，當(dāng)外源DNA大于3.9kb時(shí)，白色菌落數(shù)即大幅減少至3個(gè)以下。這也顯示了，使用傳統(tǒng)的λ-Red同源重組技術(shù)，一旦外源DNA的長(zhǎng)度超過(guò)3.9kb以上時(shí)，外源DNA插入的大腸桿菌的效率就會(huì)降低，進(jìn)而減少了基因重組的成功機(jī)率。

除了白色菌落數(shù)的生成數(shù)量外，能夠挑到成功重組的菌落的機(jī)率(白色菌落數(shù))才是關(guān)鍵。若是重組效率高，但雜訊(藍(lán)色菌落數(shù))也很高的情況下，會(huì)導(dǎo)致挑到正確重組菌落的難度提高。因此，將挑到成功重組菌落的機(jī)率為：白色菌落數(shù)/總菌落數(shù)。在對(duì)照組中，平均藍(lán)色菌落數(shù)依1.4、2.4、3.9、5.4、與7.0kb組別分為563、9、23、181、與68個(gè)(如表1)。在實(shí)驗(yàn)組中，平均藍(lán)色菌落數(shù)依1.4、2.4、3.9、5.4、與7.0kb組別分為156、52、9、82、與7個(gè)(如表1)。進(jìn)一步推算挑選成功的機(jī)率，在對(duì)照組中，1.4與2.4kb組別挑到成功重組菌落的機(jī)率為28.3％與80％，3.9kb組則為12％。然而，當(dāng)外源DNA長(zhǎng)度大于3.9kb時(shí)，挑到成功重組菌落的機(jī)率大幅降至1％以下(伴隨大量的藍(lán)色菌落數(shù))。在實(shí)驗(yàn)組中，1.4、2.4、與3.9kb組別挑到成功重組菌落的機(jī)率為90％，而5.4與7.0kb組別挑到成功重組菌落的機(jī)率則分別為45％與50％。

表1：藍(lán)/白篩選測(cè)試法的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的結(jié)果

請(qǐng)參閱圖6和圖7，圖6為本發(fā)明第一實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)一的菌落快速檢驗(yàn)聚合酶連鎖反應(yīng)的結(jié)果、而圖7為本發(fā)明第一實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)一的外源DNA插入染色體的分析結(jié)果。

為了進(jìn)一步確認(rèn)外源DNA有插入到染色體上的正確位置，設(shè)計(jì)了兩組引物(如圖6上方)，在實(shí)驗(yàn)組中各別隨機(jī)挑取3至5個(gè)白色菌落，對(duì)外源DNA插入染色體后的左右接縫處進(jìn)行colony PCR(菌落快速檢驗(yàn)聚合酶連鎖反應(yīng))，若外源DNA有插入至正確位置，則產(chǎn)生約1kb的PCR訊號(hào)。Colony PCR是直接將菌體熱解后，所暴露出來(lái)的DNA為模板，以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可不必提取基因組DNA，也不必經(jīng)由酶切鑒定。通常利用此方法進(jìn)行基因重組的篩選或者DNA序列分析。由PCR分析結(jié)果可以得到(圖6下方)，在1.4、2.4、與3.9kb組別中，所有菌落都有正確的PCR訊號(hào)出現(xiàn)。而在5.4kb組別中，在五個(gè)菌落組別中約有四個(gè)菌落是正確的，正確率為80％。在7.0kb組別中，五個(gè)菌落中約有三個(gè)菌落是正確的，正確率為60％。最后，還利用與接縫外側(cè)的染色體序列互補(bǔ)引物(圖7上方)，將PCR整段插入染色體的外源DNA，用以確認(rèn)外源DNA有完整插入染色體中(圖7下方)。借由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以確認(rèn)在實(shí)驗(yàn)組中，不同大小的外源DNA都能夠正確地插入大腸桿菌中染色體上的LacZ位置。

在本發(fā)明所提供的細(xì)菌基因編輯方法中，利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌基因編輯，將pCas9、pKD46、以及pCRISPR::LacZ等質(zhì)粒送入大腸桿菌內(nèi)，并借由pCas9、pKD46、以及pCRISPR::LacZ的共同作用，再配合含有IPTG、X-gal、Km、Tc培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件，可以將大片段的DNA(7kb)成功插入大腸桿菌中，同時(shí)也提升了基因重組的成功機(jī)率。

〔第二實(shí)施例〕

請(qǐng)參閱圖8和9所示，圖8為本發(fā)明第二實(shí)施例的細(xì)菌基因編輯方法的流程圖，其步驟以S801和S803表示、而圖9為本發(fā)明第二實(shí)施例的細(xì)菌基因編輯方法示意圖。

本發(fā)明第二實(shí)施例提供了一種細(xì)菌基因編輯方法，值得注意的是，本發(fā)明第二實(shí)施例所使用的藍(lán)綠菌是細(xì)長(zhǎng)聚球藻(S.elongatus PCC7942)，以下以細(xì)長(zhǎng)聚球藻來(lái)作說(shuō)明。

本發(fā)明第二實(shí)施例提供一種細(xì)菌基因編輯方法，其包括提供一細(xì)長(zhǎng)聚球藻；將一pHR_trc模板質(zhì)粒及pCas9-NSI質(zhì)粒共同讓細(xì)長(zhǎng)聚球藻以自然吞噬的方式轉(zhuǎn)送入細(xì)長(zhǎng)聚球藻的菌體中，用以正確地結(jié)合到一預(yù)定位置并進(jìn)行基因重組作用，并得到一培養(yǎng)菌液，其中預(yù)定位置為一雙股斷裂位置；以及將培養(yǎng)菌液涂布在一含有觀霉素(Spectinomycin)的BG-11培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)(30℃；光強(qiáng)度50μmol m-2s)。

其中，pCas9-NSI于本發(fā)明實(shí)施例中依據(jù)文獻(xiàn)Jiang 2013之制作方法，由pCas9嵌入可辨識(shí)細(xì)菌基因體上NSI位置之特定序列5’-gcctgaaagcgtgacgagca-3’。而pHR-trc質(zhì)粒修改自pSYN_1質(zhì)粒，pSYN_1質(zhì)體可為L(zhǎng)ife technologies的 Synechococcus Engineering Kit(#A14259)，本發(fā)明實(shí)施例中pHR-trc質(zhì)粒是將pSYN_1質(zhì)體中之持續(xù)表現(xiàn)sc啟動(dòng)子替換為誘導(dǎo)型trc啟動(dòng)子。

本發(fā)明第二實(shí)施利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行細(xì)長(zhǎng)聚球藻的基因編輯，其實(shí)驗(yàn)步驟、條件、及結(jié)果在<實(shí)驗(yàn)二>詳述。

<實(shí)驗(yàn)二>

請(qǐng)參閱圖10至圖12、以及表2，圖10為本發(fā)明第二實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)二所使用的模板質(zhì)粒示意圖、圖11為本發(fā)明第二實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)二的細(xì)長(zhǎng)聚球藻同源重組效率結(jié)果、圖12為本發(fā)明第二實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)二的基因重組效率直方圖，以及表2為BG-11培養(yǎng)基成分表。

在實(shí)驗(yàn)二中，選用了S.elongatus PCC 7942菌株的細(xì)長(zhǎng)聚球藻，并借由CRISPR/Cas9技術(shù)來(lái)進(jìn)行本發(fā)明第二實(shí)施例的細(xì)菌基因編輯方法，并利用細(xì)長(zhǎng)聚球藻來(lái)測(cè)試同源重組，也就是基因重組的效率。如圖10所示，pHR_trc用來(lái)作為同源互換的模板質(zhì)粒，質(zhì)粒上含有：抵抗抗生素觀霉素(Spectinomycin)的基因SpecR、熒光蛋白EGFP、以及同源互換區(qū)域(NSIa和NSIb)。

首先，將pHR_trc模板質(zhì)粒作為同源互換的模板，對(duì)照組參考傳統(tǒng)作法，僅將1000ng的pHR_trc模板質(zhì)粒送入細(xì)長(zhǎng)聚球藻中。實(shí)驗(yàn)組則包含pCas9-NSI(1000)組和pCas9-NSI(2000)組。其中，pCas9-NSI(1000)組為除了加入1000ng的pHR_trc模板質(zhì)粒外，還另外加入了1000ng的pCas9-NSI質(zhì)粒；而pCas9-NSI(2000)組為除了加入1000ng的pHR_trc模板質(zhì)粒外，還另外加入了2000ng的pCas9-NSI質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)由細(xì)長(zhǎng)聚球藻以自然吞噬的方式將CRISPR/Cas9系統(tǒng)的pCas9-NSI質(zhì)粒與pHR_trc模板質(zhì)粒共同送入細(xì)長(zhǎng)聚球藻內(nèi)，培養(yǎng)后，將培養(yǎng)菌液涂布在含有抗生素Spectinomycin的BG-11培養(yǎng)基上，并觀察其菌落生長(zhǎng)結(jié)果。BG-11培養(yǎng)基是最廣泛地被用來(lái)培養(yǎng)細(xì)長(zhǎng)聚球藻的培養(yǎng)基，其成分由表2所示。經(jīng)由抗生素的篩選后，最后存活下來(lái)的細(xì)長(zhǎng)聚球藻的菌落數(shù)即表示，有成功地將外源DNA同源重組進(jìn)入細(xì)長(zhǎng)聚球藻的基因體中的細(xì)長(zhǎng)聚球藻數(shù)量，也就是有成功基因重組的細(xì)長(zhǎng)聚球藻數(shù)量。

表2：BG-11培養(yǎng)基成分表

如圖11所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)和對(duì)照組的菌落數(shù)比較，實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)較多，也就是說(shuō)，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)長(zhǎng)聚球藻因基因重組后而不受抗生素影響存活下來(lái)的數(shù)目較多。其中最高菌落數(shù)可達(dá)對(duì)照組的155％。

接著，借由調(diào)整不同劑量的pCas9-NSI質(zhì)粒及pHR_trc模板質(zhì)粒來(lái)找出最適條件的劑量。因此，設(shè)計(jì)了250ng、500ng、1000ng、以及2000ng的pCas9-NSI質(zhì)粒及pHR_trc模板質(zhì)粒，并觀察其交互作用后基因重組的效率。如圖12所示，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，當(dāng)pCas9-NSI質(zhì)粒僅加入250ng時(shí)，幾乎沒(méi)有促進(jìn)基因重組的作用。然而，當(dāng)劑量提升至500ng后，基因重組的效率逐步提升，最高可達(dá)到130±20％，但在1000ng及2000ng的劑量的間并無(wú)無(wú)顯著的差異。這表示，在劑量達(dá)到1000ng時(shí)，pCas9-NSI質(zhì)粒的效用便已逐步達(dá)到飽和。另外，在pHR_trc模板質(zhì)粒的用量中，則無(wú)顯著差異，表示借由本發(fā)明第二實(shí)施例所提供的細(xì)菌基因編輯系統(tǒng)，可以使用較少量的pHR_trc模板質(zhì)粒就能達(dá)到基因重組效率提升的目的。

因此，借由本發(fā)明第二實(shí)施例所提供的細(xì)菌基因編輯方法，確實(shí)可以促進(jìn)外源DNA進(jìn)行同源重組進(jìn)入細(xì)長(zhǎng)聚球藻的基因體中，以提升細(xì)長(zhǎng)聚球藻基因重組的效率。再者，也可以利用較少量的pHR_trc模板質(zhì)粒就能達(dá)到基因重組的效果，以節(jié)省材料的成本。

〔實(shí)施例的可行功效〕

綜上所述，本發(fā)明的有益效果可以在于，本發(fā)明實(shí)施例所提供的細(xì)菌基因編輯方法，可將大片段的DNA放入菌體中，并成功地進(jìn)行細(xì)菌的基因重組。因此，借由本發(fā)明的細(xì)菌基因編輯方法，可用來(lái)增加在細(xì)菌進(jìn)行基因編輯過(guò)程中的便利性，更可以加快細(xì)菌基因編輯運(yùn)作的速度，以改造細(xì)菌的DNA。未來(lái)更可借由應(yīng)用在調(diào)控細(xì)菌的代謝路徑，達(dá)到生產(chǎn)生質(zhì)化學(xué)品的目標(biāo)，來(lái)取代傳統(tǒng)石油裂解的重污染制程。

以上所公開(kāi)的內(nèi)容僅為本發(fā)明的優(yōu)選可行實(shí)施例，并非因此局限本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍，故凡運(yùn)用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及附圖內(nèi)容所做的等效技術(shù)變化，均包含于本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。