本發(fā)明涉及一種快速檢測2-酮基-L-古龍酸的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

維生素C是一種重要的有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于藥物、食品、飲料、化妝品和飼料等領(lǐng)域，在工業(yè)上主要通過發(fā)酵法制取。2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)，是生產(chǎn)維生素C的重要前體物質(zhì)，由一種或多種微生物，以葡萄糖或者山梨醇為底物，經(jīng)過幾步生物催化反應(yīng)生成。目前，2-KLG的檢測方法有薄層層析法，碘量法和高效液相色譜法。其中，紙層析法和碘量法操作復(fù)雜，步驟繁多，高效液相色譜法儀器昂貴，成本高，檢測一個樣品通常需要至少20min(《HPLC法測定生物發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸含量的研究》，2008年公開)，耗時長，無法實現(xiàn)實時數(shù)據(jù)比較，以上方法均不適用于大批量2-KLG的快速檢測和定量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種快速檢測2-KLG的方法，所述方法是(1)向待測樣品中加入終濃度為0.5～1.2mmol/L的NADPH和10～30U/L的2-KLG還原酶，在20～35℃下反應(yīng)5～40min，在340nm下對反應(yīng)前后的待測樣品OD值進(jìn)行檢測，獲得△OD₃₄₀；(2)根據(jù)2-KLG還原酶可以催化2-KLG發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)過程需要NADPH的消耗的原理，建立△OD₃₄₀與NADPH含量的線性關(guān)系，通過NADPH的消耗量來計算2-KLG的含量。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法控制待測體系總體積為200μL。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述2-KLG還原酶包括商業(yè)化2-KLG還原酶和微生物生產(chǎn)的2-KLG還原酶。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述待測樣品中2-KLG的濃度為1～8g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述檢測包括采用紫外分光光度計、酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

本發(fā)明還提供所述方法在高通量技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應(yīng)用包括批量檢測，高通量篩選。

有益效果：本發(fā)明建立了一個2-KLG的快速檢測方法，運(yùn)用2-KLG還原酶的高度專一性和催化效率，通過檢測其反應(yīng)前后NADPH的消耗，相比于其他方法，該方法具有特異性好、反應(yīng)靈敏、操作簡單，可高通量檢測等優(yōu)點，與HPLC檢測結(jié)果相比，誤差小于5％，在篩選或改造產(chǎn)2-KLG的菌株中具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為NADPH濃度與OD₃₄₀的線性關(guān)系曲線

圖2為OD₃₄₀的變化量(△OD₃₄₀)與2-KLG濃度的線性關(guān)系曲線

具體實施方式

酶活定義：定義1min降解1μmol NADPH的2-KLG還原酶量為一個酶活力單位(U/L)。

高效液相色譜測定2-KLG的方法：采用Agilent 1260高效液相色譜儀(配示差檢測器和工作站)；色譜條件：色譜柱：Aminex HPX-87H ion exchange column；流動相：5mmol H₂SO₄；流速：0.5mL/min柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；示差檢測器(RID)檢測，示差溫度為35℃。

實施例1

根據(jù)2-KLG還原酶可以催化2-KLG生成L-艾杜糖酸(2-keto-L-gulonate+NADPH＝L-idonate+NADP⁺)，同時伴隨NADPH的消耗，根據(jù)NADPH在其最大可見光(340nm)時吸收值的變化量，實現(xiàn)2-KLG的快速檢測。為確定NADPH濃度與OD₃₄₀的線性關(guān)系，在20～35℃條件下,酶標(biāo)儀測定200μL體系不同NADPH的濃度(0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.5mmol/L)的吸光值OD₃₄₀，結(jié)果表明NADPH量與OD₃₄₀存在很好的線性關(guān)系，其線性方程為Y＝0.9141X+1.5575(R²＝0.9989)(附圖1)。

實施例2

以發(fā)酵培養(yǎng)基為溶解液，加入不同濃度的2-KLG(1～12g/L)，再加入終濃度1.0mmol/L的量NADPH和15U/L的2-KLG還原酶，總體積為200μL。酶標(biāo)儀檢測初始時間的吸光值OD₃₄₀，常溫反應(yīng)20min后，檢測吸光值OD₃₄₀。結(jié)果表明，在NADPH添加量為1.0mmol/L的量和2-KLG還原酶酶活為3U條件下，2-KLG初始濃度為1～8g/L時，OD₃₄₀的變化量(△OD₃₄₀)與2-KLG初始濃度存在線性關(guān)系，其線性方程為：Y＝0.0239X+0.2146(R²＝0.9838)。

實施例3

在經(jīng)HPLC檢測后確定了2-KLG濃度的3個發(fā)酵液樣品中(2-KLG濃度分別為2.10g/L，3.51g/L和5.24g/L)，加入終濃度1.0mmol/L的NADPH和15U/L的2-KLG還原酶，總體積為200μL，常溫反應(yīng)20min，分別檢測初始和反應(yīng)后的OD₃₄₀。結(jié)果表明△OD₃₄₀與發(fā)酵液中2-KLG濃度存在較好的線性關(guān)系，其線性方程為：Y＝0.0218X+0.2227，R²＝0.9942。與實施例2相比，說明此檢測方法對2-KLG具有較好的特異性。

實施例4

以發(fā)酵培養(yǎng)基為溶解液，加入不同梯度初始濃度的2-KLG(1～8g/L)和15U/L的2-KLG還原酶，再加入終濃度不同的NADPH(0～2.0mmol/L)，總體積為200μL，常溫反應(yīng)20min，分別檢測初始和反應(yīng)后的OD₃₄₀。結(jié)果表明加入不同濃度NADPH的△OD₃₄₀與2-KLG都存在較好的線性關(guān)系，當(dāng)NADPH加入量為0.5～1.2mmol/L時，△OD₃₄₀與發(fā)酵液中2-KLG濃度存在較好的線性關(guān)系(R²≥0.98)，且△OD₃₄₀的差異性更明顯。

實施例5

以發(fā)酵培養(yǎng)基為溶解液，加入不同梯度初始濃度的2-KLG(1～8g/L)和終濃度1.0mmol/L的NADPH，再加入不同酶活單位的酶(5～60U/L)，總體積為200μL，常溫反應(yīng)20min，分別檢測初始和反應(yīng)后的OD₃₄₀。結(jié)果表明加入不同酶活的△OD₃₄₀與2-KLG都存在較好的線性關(guān)系，當(dāng)酶活10～30U/L時，△OD₃₄₀與發(fā)酵液中2-KLG濃度存在較好的線性關(guān)系(R²≥0.98)，且△OD₃₄₀的差異性更明顯。

實施例6

以發(fā)酵培養(yǎng)基為溶解液，加入1～8g/L的2-KLG，終濃度0.7mmol/L的NADPH和酶活為10U/L的酶，總體積為200μL，在不同溫度下(5，10，20，25，30，35，40和45)反應(yīng)，每5min檢測OD₃₄₀。結(jié)果表明，在20～35℃條件下，反應(yīng)時間為5～40min時，△OD₃₄₀與發(fā)酵液中2-KLG都存在較好的線性關(guān)系(R²≥0.98)。

實施例7

預(yù)實驗獲得Gluconobacter oxydans菌株在48深孔板中發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG的產(chǎn)量為2.50±0.18g/L，將該菌株誘變處理后經(jīng)流式細(xì)胞分選儀篩分選至96孔板中，活化后轉(zhuǎn)移至48深孔板培養(yǎng)4天，離心，轉(zhuǎn)移發(fā)酵液至新的96孔板，向每個孔中加入終濃度1.2mmol/L的NADPH和酶活為30U/L的酶，總體積為200μL，常溫反應(yīng)20min，酶標(biāo)儀檢測初始和反應(yīng)20min后的OD₃₄₀。根據(jù)△OD₃₄₀與2-KLG之間的線性方程Y＝-0.0306X+0.214計算出各孔中2-KLG的含量，取待測樣品中3個相對較高的2-KLG的樣品(經(jīng)檢測，濃度分別2.93g/L、2.99g/L和3.12g/L)進(jìn)行HPLC檢測，HPLC檢測上述3個樣品中2-KLG含量分別為2.81g/L、3.08g/L和2.97g/L。與HPLC相比，測量誤差分別為4.10％、3.01％和4.81％，表明該方法具有可行性。且待測樣品數(shù)≥3個時，本方法比HPLC效率更高，能夠快速獲得結(jié)果，并適用于連續(xù)發(fā)酵中的實時檢測。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。