本發(fā)明涉及一株具有廣譜抗菌活性的海洋放線菌s-19-3，其屬于微生物學(xué)中放線菌領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

放線菌(actinomycetes)是一類高(g+c)含量(>55％)的革蘭氏陽性細(xì)菌，因其菌落邊緣菌絲常呈放線狀而得名[1]。放線菌作為一類有價值的微生物資源，擁有合成豐富的生物活性的次級代謝產(chǎn)物的能力。目前在已發(fā)現(xiàn)的33500種天然活性產(chǎn)物中，40％以上在放線菌中發(fā)現(xiàn)[2]；生活中普遍應(yīng)用的各類抗生素約70％也是由放線菌生產(chǎn)[3]。

海洋環(huán)境由于其特殊的極端性(高壓、低溫、高鹽、缺乏光照、營養(yǎng)匱乏等)，造就了海洋微生物獨特的生存方式、代謝途徑，從而具備合成新穎活性化合物的能力[4]，使得海洋微生物成為了活性天然產(chǎn)物的重要來源之一，也成為新藥研發(fā)的主力軍[5]。據(jù)統(tǒng)計，來源于放線菌的活性化合物約占微生物天然活性產(chǎn)物的45％，這些結(jié)構(gòu)新穎、功能多樣和具有特殊生理活性的海洋放線菌次級代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和其蘊含的應(yīng)用價值潛力，為海洋微生物來源的天然產(chǎn)物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，為海洋微生物資源的高效利用提供科學(xué)依據(jù)。

[1]周長林，微生物學(xué)，北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2009

[2]bérdyj.thoughtsandfactsaboutantibiotics:wherewearenowandwhereweareheading.journalofantibiotics,2012,65(8):385～395

[3]bérdyj.bioactivemicrobialmetabolites.journalofantibiotics,2005,58(1):1～26

[4]趙成英，朱統(tǒng)漢，朱偉明，2010～2013之海洋微生物新天然產(chǎn)物，有機化學(xué)2013，33(6)：1195-1234

[5]hugp,yuanj,sunl,etal.statisticalresearchonmarinenaturalproductsbasedondataobtainedbetween1985and2008.marinedrugs,2011,9(4):514～525

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于上述，本發(fā)明利用膠州灣海洋微生物資源，提供一株具有廣譜抗菌活性的海洋放線菌，具體技術(shù)如下：

一株具有廣譜抗菌活性的海洋放線菌s-19-3，其拉丁文分類名：micromonosporasp.保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，cgmcc號：12140，保藏日期：2016年2月18號。

所述的海洋放線菌s-19-3，對藤黃八疊微球菌(micrococcusluteus)、大腸桿菌(escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、白色假絲酵母(candidaalbicans)具有抑菌效果，并含有pksi基因。

海洋放線菌s-19-3的具有16srdna的seqidno.:1序列結(jié)構(gòu)；pksi具有seqidno.:2的氨基酸序列。

本發(fā)明的的海洋放線菌s-19-3的制備方法，取膠州灣海域觀測站位采集的表層沉積物，用干熱法進(jìn)行預(yù)處理，稀釋成不同濃度在重鉻酸鉀篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)14-21天后純化；進(jìn)行菌株發(fā)酵，其基內(nèi)菌絲呈棕黃色，氣生菌絲呈橘紅色。

具體說明如下：

取膠州灣海域觀測站位采集的表層沉積物，用干熱法進(jìn)行預(yù)處理，稀釋成不同濃度在重鉻酸鉀篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)14-21天后純化。進(jìn)行菌株發(fā)酵，采用牛津杯法和紙片擴散法檢測發(fā)酵液抗菌活性。觀察菌株形態(tài)特征，進(jìn)行生理生化試驗。提取菌株基因組，擴增16srdna和pksi基因，分別對兩段序列進(jìn)行比對分析。

s-19-3對供試m.luteus、e.coli、p.aeruginosa、和c.albicans均具有良好的抑菌效果。通過形態(tài)觀察，在生長最佳的isp4培養(yǎng)基上，s-19-3基內(nèi)菌絲呈棕黃色，氣生菌絲呈橘紅色。通過生理生化試驗，發(fā)現(xiàn)s-19-3不能液化明膠，不能凝固和胨化牛奶，可以水解淀粉，不產(chǎn)生硫化氫；碳源試驗中，只能利用葡萄糖和阿拉伯糖。通過對16srdna的鑒定，結(jié)合上述特征，鑒定放線菌s-19-3為小單孢菌。對其pksi基因的擴增揭示了其產(chǎn)聚酮化合物的潛力。

本發(fā)明的優(yōu)點是：

海洋放線菌s-19-3具有廣譜抗菌活性，對供試革蘭氏陽性菌m.luteus、革蘭氏陰性菌e.coli和p.aeruginosa、真菌c.albicans均具有良好的抑菌效果。從海洋放線菌s-19-3中擴增出的pksi基因揭示了其產(chǎn)聚酮化合物的潛力。

具有廣譜抗菌活性的海洋放線菌s-19-3，分離自膠州灣海域觀測站位采集的表層沉積物；預(yù)處理方法為干熱法，分離抑制劑為重鉻酸鉀；其基內(nèi)菌絲呈棕黃色，氣生菌絲呈橘紅色。結(jié)合生理生化實驗與16srdna鑒定該菌為小單孢菌。

海洋放線菌s-19-3具有廣譜抗菌活性，對革蘭氏陽性菌藤黃八疊微球菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌和銅綠假單胞菌、真菌白色假絲酵母均具有良好的抑菌效果。

海洋放線菌s-19-3，從其基因組中擴增出i型聚酮合酶基因，揭示了其產(chǎn)聚酮化合物的潛力。

附圖說明

圖1：s-19-3在isp4培養(yǎng)基生長示意圖

菌株s-19-3在isp4培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)兩周的形態(tài)如圖1所示。培養(yǎng)6天時生出基內(nèi)菌絲，呈淺橘黃色，堅硬難挑起；培養(yǎng)10天時生出深橘紅色孢子，此后菌株表面為孢子包圍，呈黑色。

圖2：基于16srdna的菌株s-19-3與相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹

在系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹上，菌株s-19-3與西班牙學(xué)者分離的新菌micromonosporalupinistr.lupac08(dsm44870)親緣關(guān)系最近，其序列同源性高達(dá)98％。進(jìn)化樹節(jié)點上數(shù)字為53，低于變種或亞種的界定數(shù)字66，表明該菌可能是小單孢菌屬內(nèi)的新種。

具體實施方式

1.樣品的采集與預(yù)處理

樣品采集信息：在膠州灣海域9個不同觀測站位采集的表層沉積物，由中國海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室提供。將采集得到的樣品保存于4℃低溫冰箱中，用無菌塑料袋長期保存。使用時，將10ml海底沉積物樣品鋪于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，80℃或120℃干熱處理1-2h，磨細(xì)成粉末，稀釋后做分離待用。

2.海洋放線菌的分離

海洋放線菌的分離主要采取平板梯度稀釋法，具體步驟如下：

(1)均稱取干熱處理的樣品10g，加入90ml無菌海水中，150r/min震蕩20min后，靜置30min取上清液，逐級稀釋至10^-2、10^-3、10^-4，各取100微升涂布上述個選擇性平板，每個梯度設(shè)3個重復(fù)；

(2)培養(yǎng)基中含0.0075％的重鉻酸鉀，以抑制細(xì)菌和真菌的生長，放入28℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)14d～21d；

(3)挑取不同形態(tài)的菌落到放線菌篩選培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，然后將分離的菌落在平板上反復(fù)劃線純化，直至得到菌落形態(tài)單一的培養(yǎng)物，命名為s-19-3。

3.抗菌活性測定

采用牛津杯和紙片擴散法來檢測s-19-3發(fā)酵液抗菌活性，具體步驟如下：

(1)牛津杯法

1)以無菌操作在固體培養(yǎng)基(細(xì)菌為lb，真菌為ypd)表面直接垂直放上4～6支牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，

2)在杯中加入待檢測s-19-3發(fā)酵液(離心取上清)，一般可以裝200μl，勿使其外溢。

3)加滿后置37℃(細(xì)菌)或28℃(真菌)培養(yǎng)2～3d，觀察結(jié)果，用尺子量抑菌圈直徑。

(2)紙片擴散法

1)取較厚的平整濾紙，用打孔器制作直徑為6mm的濾紙片，將無菌濾紙片均勻放置于生物檢定平板中，每板4～8個均可。

2)取10μls-19-3發(fā)酵液(離心取上清)置于在生物檢定平板中的濾紙片上，將生物檢定平板先置于4℃冰箱中1～2h。培養(yǎng)并觀察測量抑菌圈直徑。

表1s-19-3對供試菌株的抑菌直徑

4.形態(tài)學(xué)特征觀察

s-19-3在葡萄糖-天門冬素培養(yǎng)基上28℃條件下培養(yǎng)2～3周后，通過光學(xué)顯微鏡觀察菌絲體形態(tài)。參照國際鏈霉菌規(guī)劃(internationalstreptomycesprojects，isp)的標(biāo)準(zhǔn)方法，采用的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基進(jìn)行，在isp2、isp3、isp4、isp5、營養(yǎng)瓊脂、察氏瓊脂、馬鈴薯瓊脂七種典型的放線菌培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)過程中菌落形態(tài)、菌絲的變化。

表2s-19-3形態(tài)特征

5.生理生化實驗

內(nèi)容包括：明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉水解、硫化氫產(chǎn)生和碳源利用實驗，其中碳源有葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、棉子糖和肌醇。

表3s-19-3生理生化特征

6.16srdna序列測定和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

提取海洋放線菌s-19-3基因組dna，采用細(xì)菌通用引物擴增16srdna并純化測序，測序結(jié)果通過ncbi的blastn程序進(jìn)行同源性比較，采用mega5.1軟件，用neighbor-joining法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。通過序列分析，發(fā)現(xiàn)s-19-3與西班牙學(xué)者分離的新菌micromonosporalupinistr.lupac08(dsm44870)同源性高達(dá)98％。結(jié)合其形態(tài)特征和生理生化特征，初步判定s-19-3為小單孢菌。

7.pksi基因的擴增

利用簡并引物對pksi基因進(jìn)行擴增，得到的片段純化后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗并測序，測序結(jié)果通過ncbi的blastp程序進(jìn)行氨基酸序列同源性比較，采用mega5.1軟件，用neighbor-joining法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。通過序列分析，發(fā)現(xiàn)s-19-3的pksi序列與micromonosporasubsp.carbonacealuedemannandbrodsky1965的pksi序列(ncbireferencesequence:wp_052503806.1)以及polyketidesynthase序列(ncbireferencesequence:wp_052503807.1)較為接近。

seqidno.:1

16srdna

cgtgacgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcagcgttgctgatctgcgattactagcgactccgacttcacggggtcgagttgcagaccccgatccgaactgagaccggctttttgggattcgctccacctcacggtatcgcagcccattgtaccggccattgtagcatgcgtgaagccctggacataaggggcatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccgagttgaccccggcagtcttcgatgagtccccgccataacgcgctggcaacatcgaacgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtgaccgcccccgaaggaccccccatctctgaaggttttgcggccatgtcaaacccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccgcatgctccgccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcggggcgcttaatgcgttagctgcggcacagagaaccggagaggccccccacacctagcgcccaacgtttacagcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtatcggcccagagacccgccttcgccaccggtgttcctcctgatatctgcgcatttcaccgctacaccaggaattccagtctcccctaccgaactctagcctgcccgtatcgaccgcaggcttggggttgagccccaagttttcacggtcgacgcgacaagccgcctacgagctctttacgcccaataaatccggacaacgctcgcgccctacgtcttaccgcggctgctggcacgtagttggccggcgcttcttctgcaggtaccgtcacttgcgcttcgtccctgctgaaagaggtttacaacccgaaggccgtcatccctcacgcggcgtcgctgcatcaggcttccgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccggtcgccctctcaggccggctacccgtcgtcgccttggtaggccatcaccccaccaacaagctgataggccgcgagcccatcccaggccgaaaaactttccacccccagtcatgcgaccaaaggttgtatccggtattagcccccgtttccgagggttatcccaaagcctagggcaggttgctcacgtgttactcac

seqidno.:2

pksi氨基酸

mettidtlcssslvalhtavrsirsvecdqaivagvhlametspqyfqlgsrlrsfsptgasrafdaaadgfvpgegvvgvvvkplahavhdedqihgvipvtavnhggrtsgltvpsssaqqdvilaalrdagvgpegigmetvdthgtstngtslnhpnathnahnhraapprgikispistop