本發(fā)明涉及生物細(xì)胞研究領(lǐng)域，具體是一種羅格列酮抑制大鼠肝星狀細(xì)胞活化的研究方法。
背景技術(shù)：
最近研究發(fā)現(xiàn)PPARγ的表達(dá)參與HSC靜態(tài)表型的維持，在肝星狀細(xì)胞的活化調(diào)控中發(fā)揮重要作用，與肝纖維化的形成有非常密切的關(guān)系。采用慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法研究PPARγ對鼠肝纖維化模型的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，在體外實(shí)驗(yàn)中PPARγ能夠抑制活化的HSC表達(dá)α-SMA、Ⅰ型膠原，抑制HSC的增殖；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)PPARγ基因轉(zhuǎn)染組羥脯氨酸、PPARγ及α-SMA、I型膠原蛋白水平與肝纖維化組對比有顯著差異。Lee等在研究從狹葉柴胡中提取的一種木酚素(Kaerophyllin)對硫代乙酰胺引起的大鼠肝損傷和纖維化形成的阻斷作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，其抗炎、抑制HSC活化的作用與上調(diào)PPAR-γ表達(dá)有關(guān)。噻唑烷二酮類藥物(thiazolidinediones，TZDs)是臨床上抗糖尿病藥，常用包括羅格列酮、環(huán)格列酮、吡格列酮，該類藥物是體內(nèi)PPARγ高選擇性、強(qiáng)效激動劑，能夠激活PPARγ從而改善機(jī)體糖脂代謝。近期有研究提示PPARγ配體羅格列酮能夠通過抑制HSC增殖，使細(xì)胞周期靜止,促進(jìn)HSC凋亡從而逆轉(zhuǎn)甲硫氨酸膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的小鼠纖維性脂肪肝。Lee等報道PPARγ配體環(huán)格列酮對HSC增殖的抑制效應(yīng)與逆轉(zhuǎn)ERK活性有關(guān)，并且能夠抑制由瘦素或血小板衍生因子引起的HSC增殖。趙彩彥等研究提示環(huán)格列酮的抗肝纖維化的活性可能與它對TGFβ1-TGFβR1信號抑制和阻斷Smad3依賴性的PAI-1和膠原表達(dá)有關(guān)。Nan等通過研究羅格列酮對緩解營養(yǎng)性纖維性脂肪肝的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)依據(jù)中發(fā)現(xiàn)羅格列酮減輕肝纖維化通過激活PPAR-γ，而PPAR-γ能抑制HSC活化，抑制TGFβ、CTGF表達(dá)。Ramani K等在研究肝星狀細(xì)胞蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2A(MAT2A)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制中發(fā)現(xiàn)羅格列酮處理的HSC引起的MAT2A表達(dá)能降低PPARγ表達(dá)，PPARγ是靜止的HSCMAT2A的負(fù)調(diào)控因子。
肝纖維化是肝臟對各種急慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，而肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化過程的核心環(huán)節(jié)，羅格列酮作為核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的激動劑，對于肝星狀細(xì)胞的抑制已得到證實(shí)。HSC細(xì)胞的激活和表型變化并非單獨(dú)孤立由某個細(xì)胞因子引起，而是涉及到眾多細(xì)胞因子、不同信號通路的協(xié)同作用，其中研究熱點(diǎn)的是MAPK途徑，而研究表明其中ERK1/2在HSC增殖和膠原蛋白的異常表達(dá)中發(fā)揮著重要作用。
本發(fā)明選取研究最廣泛的PDGF作為肝星狀細(xì)胞的刺激因素，選取最經(jīng)典的ERK1/2通路為研究對象，用Westemblot檢測羅格列酮處理后肝星狀細(xì)胞ERK1/2蛋白磷酸化的表達(dá)情況，進(jìn)一步揭示其抑制肝星狀細(xì)胞I、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的信號通路調(diào)節(jié)機(jī)制。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種羅格列酮抑制大鼠肝星狀細(xì)胞活化的研究方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種羅格列酮抑制大鼠肝星狀細(xì)胞活化的研究方法，步驟如下：
(1)采用RT-PCR法檢測PDGF mRNA的表達(dá)
11)樣品處理：收獲HSC-T6細(xì)胞，移入離心管中，加入Trizol，混勻，室溫靜置4～6min；加入氯仿，振蕩12～18s，靜置23min，4℃下離心，12000g×15min，取上清，加入異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置8～12min；4℃下離心，12000g×10min，棄上清；加入體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇，輕輕洗滌沉淀；4℃下離心，7500g×5min，棄上清；晾干，加入55℃的DEPC水溶解10～15min；
12)擴(kuò)增PCR：反應(yīng)體系為50μL，5×buffer10μL，0.5μL的20μmol/L的α-SMA引物，TAKARA Ex Taq HS酶0.25μL，用水補(bǔ)至40μL加入第一步反應(yīng)后液體10μL；用PCR儀擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：PPARγ及β-actin為：94℃5min，94℃預(yù)變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35個循環(huán)；72℃延伸5min；Adiponectin為：94℃5min，94℃預(yù)變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32個循環(huán)；72℃延伸5min；
13)PDGF表達(dá)半定量分析：將PCR反應(yīng)產(chǎn)物分別在1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，得到PPARγmRNA及Adiponectin mRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行光密度掃描，以PDGF/β-actin的比值為PDGFmRNA的相對表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次；
其中，設(shè)置β-actin為參照；
(2)采用Western blot方法檢測MEK1/2、ERK1/2的蛋白表達(dá)情況
21)細(xì)胞中總蛋白的提取
a)溶解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻，在使用前加入PMSF，使PMSF的最終濃度為0.9～1.1mM；
b)對于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍，按照6孔板每孔加入100～200μL裂解液的比例加入裂解液，用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸，裂解液接觸細(xì)胞1～2s后，細(xì)胞就會被裂解；
c)充分裂解后，以10000～14000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速離心3～5min，取上清；
22)Western blot方法操作
a)聚丙烯酰胺凝膠的配制，根據(jù)MEK1/2、ERK1/2蛋白分子的大小，配置相應(yīng)濃度的分離膠和積層膠；
b)樣品處理：將樣品加入等量的4×SDS上樣緩沖液，100℃加熱3～5min，離心12000g×1min，每組取等量的總蛋白上樣，10％SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)；
c)加樣：依次加入待分析樣品，每孔15～25μL；
d)電泳：加樣完畢，選擇50～70V的電壓進(jìn)行電泳3.5～4.5h，直至溴酚藍(lán)染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳；
e)轉(zhuǎn)膜：蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上PVDF膜，電泳槽加滿預(yù)冷電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，4℃，100V，200mA，2h；
f)膜的封閉：漂洗轉(zhuǎn)印膜，室溫，3次×15min，以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％脫脂奶封閉液內(nèi)，搖床震動，室溫封閉1h；
g)抗體雜交：(1)封閉后pvdf膜放入雜交袋中，加入適當(dāng)稀釋的一抗，4℃孵育過夜1xTBS-T，pH7.6洗液洗膜3次×10min；(2)過氧化物酶標(biāo)記山羊大鼠二抗孵育4h，1xTBS-T洗膜3次×15min；
h)顯色、顯影、定影：ECM顯色劑后曝光，將曝光后的X感光膠片放入顯影液中沖洗至膠片上出現(xiàn)條帶或者膠片透明為止，再放入定影液中定影，膠片長期保存；用Umax2100XL掃描儀以及凝膠分析軟件Bandscan5.0分析目標(biāo)帶的分子量和灰度值，以MEK1/2、ERK1/2與對應(yīng)的內(nèi)參β-actin蛋白灰度值相比，計算二者灰度比值。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟(1)中，HSC-T6細(xì)胞的培養(yǎng)，
(a)細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮中取出凍存管，迅速放入36-37℃水中，不時搖動，使其急速融化，30～60s內(nèi)完成，凍存管用70％酒精擦拭消毒，打開蓋子，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中，緩慢滴加等量培養(yǎng)液，以500～1000r/min的轉(zhuǎn)速離心4～6min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次，用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃，5％CO2濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后換液；
(b)細(xì)胞培養(yǎng)：采取含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃，5％CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞生長至80～90％密度時，開始傳代；
(c)細(xì)胞傳代：倒去長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液，加入0.25％胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中，在還未漂起時將胰酶棄去，加入10培養(yǎng)液終止消化，用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，按1：3傳代，置37℃，5％CO2及飽和濕度下培養(yǎng)；
(d)細(xì)胞凍存：用0.25％胰酶溶液消化細(xì)胞，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，1000r/min，離心4～6min，棄去上清，凍存液重懸沉淀，加入凍存管中，標(biāo)明細(xì)胞系的名稱和凍存日期，4℃1h，-20℃30min，-80℃過夜，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
通過本發(fā)明證實(shí)脂聯(lián)素具有抑制肝纖維化的作用，其機(jī)制與PPARγ的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控有關(guān)，通過提高PPARγ與脂聯(lián)素的表達(dá)，從而減少I型膠原、MMP2的表達(dá)，提高TIMP2的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的生成及正常內(nèi)皮下基質(zhì)的降解，達(dá)到阻斷肝纖維化進(jìn)展的目的。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
研究方案如下
1、細(xì)胞培養(yǎng)
1.1細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮中取出凍存管，迅速放入36-37℃水中，不時搖動，使其急速融化，30s至1min內(nèi)完成。凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中，緩慢滴加等量培養(yǎng)液，低速離心(500-1000r/min)5min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃，5％CO2濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后換液。
1.2細(xì)胞培養(yǎng)：采取含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃，5％CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞生長至80％-90％密度時，開始傳代。
1.3細(xì)胞傳代：倒去長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液，加入1ML0.25％胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中，在還未漂起時將胰酶棄去，加入10ML培養(yǎng)液終止消化，用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，按1：3傳代，置37℃，5％CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。
1.4細(xì)胞凍存：用0.25％胰酶溶液消化細(xì)胞，5ml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，1000r/min，離心5min，棄去上清，1ml凍存液重懸沉淀，加入凍存管中，標(biāo)明細(xì)胞系的名稱和凍存日期，4℃1h，-20℃30min，-80℃過夜，次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中。
1.5細(xì)胞計數(shù)：取細(xì)胞懸液0.1ml，加入PBS 0.9ml，混合后滴入細(xì)胞計數(shù)板內(nèi)。低倍鏡下計數(shù)四個大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，按照下列公式計算細(xì)胞密度：細(xì)胞密度(細(xì)胞數(shù)/ml)＝(細(xì)胞計數(shù)總和/4)×104×稀釋倍數(shù)。計數(shù)原則：壓線細(xì)胞應(yīng)數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，計數(shù)時兩次重復(fù)算誤差率不應(yīng)超過10％。
2、細(xì)胞分組及處理
采用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)，每日定時于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，隔天換液，待細(xì)胞生長至80％-90％密度時開始傳代。將對數(shù)生長期HSC-T6細(xì)胞，以0.25％胰蛋白酶消化，并接種至無菌6孔板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞接種密度為1×105/ml，待細(xì)胞生長至80％左右用低糖培養(yǎng)基使細(xì)胞同步化24h，細(xì)胞分4組：空白對照組，PDGF刺激組，羅格列酮干預(yù)組及羅格列酮對照組。
HSC-T6復(fù)蘇后以1×105/ml接種于96孔板培養(yǎng)，其中羅格列酮使用濃度為10μmol/L，PDGF使用濃度為30μmol/L，每組設(shè)立6個復(fù)孔。每組設(shè)5個復(fù)孔，干預(yù)24h后分別收集各組的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)。
3、四甲基偶氮唑鹽比色實(shí)驗(yàn)(MTT比色法)
3.1.HSC-T6細(xì)胞生長融合成單層后，取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別以0.25％胰蛋白酶消化，并接種至無菌96孔板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞接種密度為5×104/ml，每孔均加入細(xì)胞懸液200μL，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3.2.24h后，96孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)液，血清饑餓同步化處理24h后，吸棄培養(yǎng)液。板邊緣四周孔加PBS防止邊緣效應(yīng)，按照實(shí)驗(yàn)分組依次加入濃度為10μmol/L羅格列酮、1μmol/L GW9662、10μmol/L羅格列酮和1μmol/L GW9662的培養(yǎng)液，每孔200μL；對照組為0.4％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)24h。
3.3.到預(yù)定時間后，每孔加入無菌MTT溶液(5mg/ml)20μL，繼續(xù)在原條件下孵育4h，然后終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL的二甲基亞砜(DMSO)，微型振蕩器振蕩10min。選擇490nm波長，在酶標(biāo)儀上檢測各孔的吸光度(A值)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，綜合分析10μmol/L羅格列酮、1μmol/L GW9662、10μmol/L羅格列酮和1μmol/L GW9662對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響。
4、采用RT-PCR法檢測PDGFmRNA的表達(dá)
4.1.樣品處理：收獲細(xì)胞1-5×107，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。4℃離心，12000g×15min，取上清。加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃離心，12000g×10min，棄上清。加入1ml 75％乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清。晾干，加入適量的DEPC H2O溶解(55℃促溶10-15min)。
4.2.引物見表一：
設(shè)置β-actin為參照；
4.3擴(kuò)增PCR：反應(yīng)體系為50μL，5×buffer10μL，α-SMA引物(20μmol/L)0.5μL，TAKARA Ex Taq HS酶0.25μL，用水補(bǔ)至40μL加入第一步反應(yīng)后液體10μL。用PCR儀擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：PPARγ及β-actin為：94℃5min，94℃預(yù)變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。Adiponectin為：94℃5min，94℃預(yù)變性30s，，58℃退火30s，72℃延伸30s，32個循環(huán)；72℃延伸5min。
4.4.PDGF表達(dá)半定量分析：將PCR反應(yīng)產(chǎn)物分別在1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，PPARγmRNA及Adiponectin mRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表一。用凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司)對條帶進(jìn)行光密度掃描，以PDGF/β-actin的比值為PDGFmRNA的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。
5、Western blot方法檢測MEK1/2、ERK1/2的蛋白表達(dá)情況
5.1.細(xì)胞中總蛋白的提取
5.1.1.融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)min內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。
5.1.2.對于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2s后，細(xì)胞就會被裂解。
5.1.3.充分裂解后，10000-14000轉(zhuǎn)/min離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western等操作。裂解液用量說明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入100μL裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150μL或200μL。
5.2.Western blot方法操作步驟
5.2.1.聚丙烯酰胺凝膠的配制，根據(jù)MEK1/2、ERK1/2蛋白分子的大小，配置相應(yīng)濃度的分離膠和積層膠
5.2.2.樣品處理：將樣品加入等量的4×SDS上樣緩沖液，100℃加熱3-5min，離心12000g×1min，每組取等量的總蛋白上樣，10％SDS—PAGE分離蛋白質(zhì)。
5.2.3加樣：依次加入待分析樣品，每孔20μL。
5.2.4.電泳：加樣完畢，選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳可。一般采用60V，4h，也可電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳
5.2.5.轉(zhuǎn)膜：蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上PVDF膜。電泳槽加滿預(yù)冷電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，4℃，100v，200mA，2h。
5.2.6.膜的封閉：漂洗轉(zhuǎn)印膜，室溫，3次x15min，以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS(以免影響抗體的結(jié)合)，放入5％脫脂奶封閉液內(nèi)，搖床震動，室溫封閉1h
5.2.7.抗體雜交：(1)封閉后pvdf膜放入雜交袋中，加入適當(dāng)稀釋的一抗，4℃孵育過夜1xTBS-T，PH7.6洗液洗膜3次x10min。(2)過氧化物酶標(biāo)記山羊大鼠二抗孵育4h，1xTBS-T洗膜3X15min。
5.2.8.顯色(ECM)：ECM顯色劑后曝光
5.2.9.顯影、定影：將曝光后的X感光膠片放入顯影液中沖洗至膠片上出現(xiàn)條帶或者膠片透明為止，再放入定影液中定影，膠片可長期保存。用Umax2100XL掃描儀以及凝膠分析軟件Bandscan5.0分析目標(biāo)帶的分子量和灰度值，以MEK1/2、ERK1/2與對應(yīng)的內(nèi)參β-actin蛋白灰度值相比，計算二者灰度比值
研究結(jié)果：
1.MTT法檢測細(xì)胞增殖率：羅格列酮干預(yù)組細(xì)胞的增殖率較空白對照組，PDGF刺激組及羅格列酮對照組明顯下降(t值分別為21.975、16.331、19.5，P<0.01，見表1)。
表1 各組HSC增殖情況
2.ELISA檢測HSC-T6細(xì)胞脂聯(lián)素、I型膠原、MMP2、TIMP2含量的變化
ELISA結(jié)果顯示：①羅格列酮組脂聯(lián)素的表達(dá)較GW9662組、GW9662+羅格列酮組及空白對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為10.256、11.049、18.419，P<0.01)。②羅格列酮組I型膠原的表達(dá)較GW9662組、GW9662+羅格列酮組及空白對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為11.823、9.657、14.240，P<0.01)。③羅格列酮組MMP2含量較GW9662組、GW9662+羅格列酮組、空白對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為25.744、20.333、19.030，P<0.01)。④羅格列酮組TIMP2的表達(dá)量較GW9662組、GW9662+羅格列酮組、空白對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為15.500、18.166、18.802，P<0.01)。⑤GW9662組、GW9662+羅格列酮組及空白對照組脂聯(lián)素、I型膠原、MMP2、TIMP2的表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)。(見表2)
表2 ELISA檢測HSC-T6細(xì)胞脂聯(lián)素、Ⅰ型膠原、MMP2、TIMP2含量的變化(ng/ml)
3.RT-PCR檢測HSC-T6細(xì)胞脂聯(lián)素和PPARγ的mRNA表達(dá)的變化
RT-PCR結(jié)果顯示：①羅格列酮組脂聯(lián)素mRNA相對表達(dá)量為1.273±0.045，較GW9662組、GW9662加羅格列酮組、空白對照組(0.653±0.075、0.633±0.093、0.693±0.065)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為12.264、10.733、12.690，P<0.01)。②羅格列酮組PPARγmRNA相對表達(dá)量為1.633±0.015，較GW9662組、GW9662加羅格列酮組、空白對照組(0.403±0.015、0.450±0.026、0.457±0.015)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為8.619、7.089、4.343，P<0.01)。③其它各組脂聯(lián)素、PPARγmRNA相對表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)。④GW9662阻斷羅格列酮對PPARγmRNA表達(dá)同時，也阻斷了羅格列酮對脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)。⑤脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)存在顯著正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)指數(shù)為0.970，P＝0.000，P<0.01)。(見表3)
表3 RT-PCR檢測HSC-T6細(xì)胞脂聯(lián)素、PPARγmRNA表達(dá)的變化
4.Western blot檢測HSC-T6細(xì)胞脂聯(lián)素和PPARγ蛋白表達(dá)的變化
Western印跡結(jié)果顯示：①羅格列酮組脂聯(lián)素蛋白相對表達(dá)量為1.124±0.007，較GW9662組、GW9662加羅格列酮組、空白對照組(0.744±0.082、0.744±0.064、0.734±0.043)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為7.969、10.240、15.274，P<0.01)。②羅格列酮組PPARγ蛋白相對表達(dá)量為1.036±0.028，較GW9662組、GW9662加羅格列酮組、空白對照組(0.655±0.006、0.648±0.004、0.649±0.005)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為23.450、24.208、23.990，P<0.01)。③其它各組脂聯(lián)素、PPARγ蛋白相對表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)。④GW9662阻斷羅格列酮對PPARγ蛋白表達(dá)同時，也阻斷了羅格列酮對脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)。⑤脂聯(lián)素和PPARγ蛋白表達(dá)存在顯著正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)指數(shù)為0.966，P＝0.001，P<0.01)。(見表4)
表4Western blot檢測HSC-T6細(xì)胞脂聯(lián)素、PPARγ蛋白表達(dá)的變化
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，羅格列酮組脂聯(lián)素、PPARγmRNA及蛋白的表達(dá)量較其它組明顯升高(P<0.01)，其它各組脂聯(lián)素、PPARγmRNA及蛋白的表達(dá)量比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明羅格列酮激動PPARγ的表達(dá)，同時也上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)，且這種激動作用可被特異性阻斷劑GW9662阻斷，說明羅格列酮的激動作用是通過PPARγ起作用的。通過相關(guān)性分析提示脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)存在顯著相關(guān)關(guān)系(相關(guān)指數(shù)為0.970，P＝0.000，P<0.01)，脂聯(lián)素和PPARγ蛋白表達(dá)同樣存在顯著相關(guān)關(guān)系(相關(guān)指數(shù)為0.966，P＝0.001，P<0.01)。說明在HSC中脂聯(lián)素的表達(dá)調(diào)控與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ有一定相關(guān)，與以往報道脂聯(lián)素是PPARγ的靶基因相符。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。