本申請(qǐng)是2011年4月12日提交的發(fā)明名稱為“5-位修飾的嘧啶和它們的用途”的中國專利申請(qǐng)201180028946.3的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2010年4月12日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/323,145的權(quán)益，將其通過援引全部加入本文。本公開內(nèi)容涉及核酸化學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及5-位修飾的尿苷及其亞磷酰胺和三磷酸酯衍生物。本公開內(nèi)容還涉及其制備和使用方法。本公開內(nèi)容包括修飾的核苷作為寡核苷酸或適體的一部分的用途。
背景技術(shù)：
：：下面的描述提供了與本公開內(nèi)容有關(guān)的信息的總結(jié)，且不是承認(rèn)：在本文中提供的任何信息或引用的任何出版物是本公開內(nèi)容的現(xiàn)有技術(shù)。已經(jīng)非常關(guān)注開發(fā)修飾的核苷作為治療劑、診斷劑和用于摻入寡核苷酸中。例如，修飾的核苷(諸如azt、ddi、d4t等)已經(jīng)被用于治療aids。5-三氟甲基-2'-脫氧尿苷對(duì)皰疹性角膜炎是有效的，5-碘-1-(2-脫氧-2-氟-b-d-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶具有抗cmv、vzv、hsv-1、hsv-2和ebv的活性(atextbookofdrugdesignanddevelopment,povlkrogsgaard-larsen和hansbundgaard編,harwoodacademicpublishers,1991,第15章)。修飾的核苷已經(jīng)在診斷用途中表現(xiàn)出實(shí)用性。在這些用途中，將所述核苷摻入dna中的可檢測(cè)的位置，并使用各種診斷方法來檢測(cè)修飾的核苷的位置。這些方法包括：放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生物素化和鏈裂解。鏈裂解的一個(gè)實(shí)例包括：使所述核苷與肼反應(yīng)，以產(chǎn)生脲核苷，然后使所述脲核苷與哌啶反應(yīng)，以造成鏈裂解(maxam-gilbert方法)。還已經(jīng)將修飾的核苷摻入寡核苷酸中。存在幾種可以將寡核苷酸用作治療劑的方法。反義寡核苷酸可以結(jié)合生物體中的某些遺傳編碼區(qū)，以阻止蛋白的表達(dá)，或阻斷各種細(xì)胞功能。此外，稱作selex方法或指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化的方法使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒別和制備選擇性地結(jié)合靶分子的寡核苷酸(稱作“適體”)。所述selex方法描述在美國專利5,270,163中，其內(nèi)容通過援引加入本文。所述selex方法包括：從候選物的混合物中選擇寡核苷酸，以實(shí)現(xiàn)基本上任意的希望的結(jié)合親和力和選擇性標(biāo)準(zhǔn)。從寡核苷酸的隨機(jī)混合物開始，所述方法包括：在有利于結(jié)合(或相互作用)的條件下使所述混合物接觸靶，將未結(jié)合的寡核苷酸和已經(jīng)與靶分子結(jié)合(或相互作用)的寡核苷酸分開，解離寡核苷酸-靶對(duì)，擴(kuò)增從所述寡核苷酸-靶對(duì)解離出的寡核苷酸，以產(chǎn)生配體富集的寡核苷酸混合物，然后通過如所希望的多個(gè)循環(huán)，重復(fù)所述結(jié)合、分開、解離和擴(kuò)增的步驟?？梢詫⑿揎椀暮塑論饺朐趕elex方法中使用的或由selex方法鑒別出的反義寡核苷酸、核酶和寡核苷酸中。這些核苷可以賦予所述寡核苷酸對(duì)內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶的體內(nèi)和體外穩(wěn)定性，改變所述分子的電荷、親水性或親脂性，和/或提供三維結(jié)構(gòu)的差異。以前已經(jīng)描述的核苷的修飾包括：2'-位糖修飾、5-位嘧啶修飾、8-位嘌呤修飾、在環(huán)外胺處的修飾、4-硫代尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、主鏈修飾和甲基化。修飾還包括3'和5'修飾諸如加帽。pctwo91/14696(通過援引加入本文)描述了化學(xué)修飾反義寡核苷酸以增強(qiáng)向細(xì)胞中的進(jìn)入的方法。美國專利5,428,149、5,591,843、5,633,361、5,719,273和5,945,527(它們通過援引整體加入本文)描述了通過鈀偶聯(lián)反應(yīng)來修飾嘧啶核苷。在有些實(shí)施方案中，使親核試劑和一氧化碳與嘧啶核苷偶聯(lián)(所述嘧啶核苷含有在嘧啶環(huán)的5-位上的離去基)，優(yōu)選地形成酯和酰胺衍生物。已經(jīng)使用多種方法來提供抗外切核酸酶降解的寡核苷酸。pctwo90/15065描述了制備外切核酸酶抗性的寡核苷酸的方法，其中將2個(gè)或更多個(gè)亞磷酰胺、單硫代磷酯和/或二硫代磷酯鍵摻入在寡核苷酸的5'和/或3'末端處。pctwo91/06629公開了在相鄰核苷之間具有一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵的寡核苷酸，所述磷酸二酯鍵通過形成能夠結(jié)合rna或dna的縮醛/縮酮型鍵而被替代。有利的是，提供用于治療和診斷用途并用于包含在寡核苷酸中的新核苷。當(dāng)摻入寡核苷酸中時(shí)，有利的是，提供這樣的新寡核苷酸：其表現(xiàn)出與靶分子結(jié)合的不同的高親和力，和/或表現(xiàn)出與從天然存在的核苷制備的寡核苷酸相比增加的對(duì)外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶的抗性。還有用的是，提供具有修飾的核苷酸，所述修飾會(huì)賦予不同于內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶抗性或除此之外額外的生物活性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本公開內(nèi)容提供具有以下通式的5-位修飾的尿苷：其中r選自-(ch2)n-rx1；rx1選自：h*ch3*表示所述rx1基團(tuán)與(ch2)n連接基的連接點(diǎn)其中rx4選自：支鏈或直鏈低級(jí)烷基(c1-c20)；鹵素(f、cl、br、i)；腈(cn)；硼酸(bo2h2)；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx2)；伯酰胺(conh2)；仲酰胺(conhrx2)；叔酰胺(conrx2rx3)；磺酰胺(so2nh2)；n-烷基磺酰胺(sonhrx2)；其中rx2、rx3獨(dú)立地選自：支鏈或直鏈低級(jí)烷基(c1-c20)；苯基(c6h5)；rx4取代的苯環(huán)(rx4c6h4)，其中rx4如上面所定義；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx5)，其中rx5是支鏈或直鏈低級(jí)烷基(c1-c20)；和環(huán)烷基，其中rx2＝rx3＝(ch2)n；其中n＝0-10；其中x選自包括、但不限于以下部分的組：-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3和-疊氮基；其中r'選自包括、但不限于以下部分的組：-oac、-obz和-osime2tbu；其中r″選自包括、但不限于以下部分的組：h、dmt和三磷酸酯(-p(o)(oh)-o-p(o)(oh)-o-p(o)(oh)2)或其鹽；并且其中可以被下述部分替代：碳環(huán)糖類似物、α-異頭糖、諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖的差向異構(gòu)糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環(huán)類似物和諸如甲基核苷的無堿基核苷類似物(abasicnucleosideanalog)。本公開內(nèi)容包括分別具有以下通式的所述化合物的3'-亞磷酰胺和5'-三磷酸酯衍生物或其鹽：其中所有部分如上所定義。使用制備這些化合物的標(biāo)準(zhǔn)的合成方法或酶促方法，可以將本公開內(nèi)容的化合物摻入寡核苷酸或適體中。本公開內(nèi)容也提供制備本公開內(nèi)容的化合物的方法和通過所述方法制備的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于制備c-5修飾的氨基羰基嘧啶的方法，所述方法包括：在堿的存在下，使在5-位被三氟乙氧基羰基修飾的嘧啶與胺反應(yīng)；和分離所述c-5修飾的氨基羰基嘧啶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于制備c-5修飾的氨基羰基嘧啶的3'-亞磷酰胺的方法，所述方法包括：在堿的存在下，使所述c-5修飾的氨基羰基嘧啶與氰基乙基二異丙基氯代亞磷酰胺反應(yīng)；和分離所述3'-亞磷酰胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于制備c-5修飾的氨基羰基嘧啶的5'-三磷酸酯的方法，所述方法包括：a)在堿的存在下，使具有下式的c-5修飾的氨基羰基嘧啶與乙酸酐反應(yīng)：其中r和x如上面所定義，隨后用酸裂解5’-dmt基團(tuán)，以形成具有以下結(jié)構(gòu)的3’-乙酸酯：b)對(duì)步驟a)的3’-乙酸酯進(jìn)行l(wèi)udwig-eckstein反應(yīng)，繼之以陰離子交換色譜；和c)分離具有以下結(jié)構(gòu)的c-5修飾的氨基羰基嘧啶的5’-三磷酸酯或其鹽：詳細(xì)描述現(xiàn)將詳細(xì)參考本發(fā)明的代表性實(shí)施方案。雖然將結(jié)合所列舉的實(shí)施方案描述本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，不旨在將本發(fā)明限制為那些實(shí)施方案。相反，本發(fā)明旨在涵蓋可包括在由所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明范圍內(nèi)的所有替代方案、修改和等同。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到許多與本文所述的那些類似或等效的方法和材料，它們可以用于本公開內(nèi)容的實(shí)踐中且在其范圍內(nèi)。本公開內(nèi)容絕不限于所描述的方法和材料。除非另外定義，在本文中使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管與本文所述的那些類似的或等效的任意的方法、裝置和材料可以用于實(shí)踐或試驗(yàn)本發(fā)明，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。在本公開內(nèi)容中引用的所有出版物、公開的專利文獻(xiàn)和專利申請(qǐng)指明了本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域的技術(shù)水平。在本文中引用的所有出版物、公開的專利文獻(xiàn)和專利申請(qǐng)都通過援引加入本文，其程度如同明確地且單個(gè)地指示每篇單獨(dú)的出版物、公開的專利文獻(xiàn)或?qū)＠暾?qǐng)通過援引加入。如在本公開內(nèi)容(包括所附權(quán)利要求書)中使用的，除非內(nèi)容清楚地另有指示，單數(shù)形式的英文詞“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指代，且與“至少一個(gè)(種)”和“一個(gè)(種)或多個(gè)(種)”互換地使用。因此，對(duì)“適體”的提及也包括適體的混合物等。本文使用的術(shù)語“約”代表輕微的數(shù)值修飾或變異，使得這些數(shù)值相關(guān)的項(xiàng)目的基本功能不變。當(dāng)用于指代多個(gè)項(xiàng)目時(shí)，術(shù)語“每個(gè)”意圖表示所述項(xiàng)目中的至少2個(gè)。不一定要求形成所述多個(gè)的所有項(xiàng)目滿足有關(guān)的額外限制。本文使用的術(shù)語“包含”、“包括”、“含有”及其任意變體意圖涵蓋非排他性的包含，使得包含、包括或含有一種元件或一系列元件的過程、方法、方法限定的產(chǎn)品或物質(zhì)組合物不僅包括這些元件，還可能包括沒有明確列出的其它元件或這些過程、方法、方法限定的產(chǎn)品或物質(zhì)組合物固有的其它元件。本文使用的術(shù)語“核苷酸”表示，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或它們的修飾形式以及它們的類似物。核苷酸包括含有嘌呤(例如，腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤和它們的衍生物和類似物)以及嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶和它們的衍生物和類似物)的物質(zhì)?；衔镌谝粋€(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供下式的化合物：其中r選自-(ch2)n-rx1；rx1選自：h*ch3*表示所述rx1基團(tuán)與(ch2)n連接基的連接點(diǎn)其中rx4選自包括、但不限于以下部分的組：支鏈或直鏈低級(jí)烷基(c1-c20)；鹵素(f、cl、br、i)；腈(cn)；硼酸(bo2h2)；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx2)；伯酰胺(conh2)；仲酰胺(conhrx2)；叔酰胺(conrx2rx3)；磺酰胺(so2nh2)；和n-烷基磺酰胺(sonhrx2)；其中rx2、rx3獨(dú)立地選自包括、但不限于以下部分的組：支鏈或直鏈低級(jí)烷基(c1-c20)；苯基(c6h5)；rx4取代的苯環(huán)(rx4c6h4)，其中rx4如上面所定義；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx5)，其中rx5是支鏈或直鏈低級(jí)烷基(c1-c20)；和環(huán)烷基，其中rx2＝rx3＝(ch2)n；其中n＝0-10；其中x選自包括、但不限于以下部分的組：-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3和-疊氮基；其中r'選自包括、但不限于以下部分的組：-oh、-oac、-obz、-c(o)ch2och3和-osime2tbu；其中r″選自包括、但不限于以下部分的組：-h、4,4'-二甲氧基三苯甲基(dmt)和三磷酸酯(-p(o)(oh)-o-p(o)(oh)-o-p(o)(oh)2)或其鹽；并且其中可以被下述部分替代：碳環(huán)糖類似物、α-異頭糖、諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖的差向異構(gòu)糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環(huán)類似物和諸如甲基核苷的無堿基核苷類似物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供下式的化合物或其鹽：其中r、r″和x如上面所定義。該通式的化合物可用于通過化學(xué)合成將修飾的核苷摻入寡核苷酸中。在其它實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供下式的化合物或其鹽：其中r、r'和x如上面所定義。該通式的化合物可用于通過酶促合成將修飾的核苷摻入寡核苷酸中。本文使用的術(shù)語“c-5修飾的羧基酰胺尿苷”或“c-5修飾的氨基羰基尿苷”表示這樣的尿苷：其具有在所述尿苷的c-5位處的羧基酰胺(-c(o)nh-)修飾，包括、但不限于上述的那些部分(r)。c-5修飾的羧基酰胺尿苷的實(shí)例包括在美國專利5,719,273和5,945,527以及2010年12月14日提交的標(biāo)題為“nucleaseresistantoligonucleotides”的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/422,957('957申請(qǐng))中描述的那些。代表性的c-5修飾的嘧啶包括：5-(n-芐基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷(bndu)、5-(n-芐基羧基酰胺)-2'-o-甲基尿苷、5-(n-芐基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(n-異丁基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷(ibudu)、5-(n-異丁基羧基酰胺)-2'-o-甲基尿苷、5-(n-異丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(n-色氨基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷(trpdu)、5-(n-色氨基羧基酰胺)-2'-o-甲基尿苷、5-(n-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(n-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷氯化物、5-(n-萘基甲基羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷(napdu)、5-(n-萘基甲基羧基酰胺)-2'-o-甲基尿苷、5-(n-萘基甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷或5-(n-[1-(2,3-二羥基丙基)]羧基酰胺)-2'-脫氧尿苷)。僅僅為了例證目的在本文中描述的c-5修飾的氨基羰基尿苷的具體實(shí)例包括以下化合物以及所述化合物的5'-三磷酸酯和3'-亞磷酰胺及其鹽，它們的合成描述在實(shí)施例1-5中。5-(4-氟芐基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷，5-((r)-2-糠基甲基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷，5-((s)-2-糠基甲基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷，5-(2-(4-嗎啉代)乙基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷；和5-(2-(1-(3-苯并咪唑酮基))乙基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷。本文所述的c-5修飾的尿苷的化學(xué)修飾也可以與單個(gè)的或任意組合的下述修飾相組合：2'-位糖修飾、在環(huán)外胺處的修飾和4-硫代尿苷的取代等等。鹽可以方便地或合乎需要地制備、純化和/或處理所述化合物的對(duì)應(yīng)鹽，例如，藥學(xué)上可接受的鹽。在berge等人“pharmaceuticallyacceptablesalts”(1977)j.pharm.sci.66：1-19中，討論了藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例。例如，如果所述化合物是陰離子的，或具有可以呈陰離子的官能團(tuán)(例如，-cooh可以是-coo-)，那么可以與合適的陽離子形成鹽。合適的無機(jī)陽離子的實(shí)例包括、但不限于：堿金屬離子諸如na+和k+，堿土金屬陽離子諸如ca2+和mg2+，和其它陽離子諸如al+3。合適的有機(jī)陽離子的實(shí)例包括、但不限于：銨離子(即，nh4+)和取代的銨離子(例如，nh3rx+、nh2rx2+、nhrx3+、nrx4+)。一些合適的取代的銨離子的實(shí)例是得自以下的那些：乙胺、二乙胺、二環(huán)己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、芐胺、苯基芐胺、膽堿、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，諸如賴氨酸和精氨酸。常見的季銨離子的一個(gè)實(shí)例是n(ch3)4+。如果所述化合物是陽離子的，或具有可以呈陽離子的官能團(tuán)(例如，-nh2可以是-nh3+)，那么可以與合適的陰離子形成鹽。合適的無機(jī)陰離子的實(shí)例包括、但不限于得自以下無機(jī)酸的那些：鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、亞硫酸、硝酸、亞硝酸、磷酸和亞磷酸。合適的有機(jī)陰離子的實(shí)例包括、但不限于得自以下有機(jī)酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗壞血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟腦磺酸、肉桂酸、檸檬酸、依地酸、乙二磺酸、乙磺酸、富馬酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、羥乙酸、羥基馬來酸、羥基萘羧酸、羥乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、馬來酸、蘋果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕櫚酸、雙羥萘酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、對(duì)氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸和戊酸。合適的聚合物有機(jī)陰離子的實(shí)例包括、但不限于得自以下聚合物酸的那些：鞣酸、羧甲基纖維素。除非另外指出,對(duì)特定化合物的提及也包括其鹽形式。寡核苷酸的制備在一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供單獨(dú)地或與其它修飾的核苷和/或天然存在的核苷組合地使用本文所述的修飾的核苷來制備修飾的寡核苷酸的方法。寡脫氧核苷的自動(dòng)化合成是許多實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)實(shí)踐(參見例如，matteucci,m.d.和caruthers,m.h.,(1990)j.am.chem.soc.,103：3185-3191,其內(nèi)容通過援引加入本文)。寡核糖核苷的合成也是眾所周知的(參見例如scaringe,s.a.等人,nucleicacidsres.18：5433-5441(1990)，通過援用加入本文)。如上面所指出的，所述亞磷酰胺可用于通過化學(xué)合成將所述修飾的核苷摻入寡核苷酸中，并且所述三磷酸酯可用于通過酶促合成將所述修飾的核苷摻入寡核苷酸中(參見例如，vaught,j.v.等人(2010)j.am.chem.soc.,132,4141-4151；gait,m.j.“oligonucleotidesynthesisapracticalapproach”(1984)irlpress(oxford,uk)；herdewijn,p.“oligonucleotidesynthesis”(2005)(humanapress,totowa,nj)(它們各自通過援引整體加入本文))。當(dāng)與寡核苷酸結(jié)合使用時(shí)，本文使用的術(shù)語“修飾”、“修飾的”和它們的任意變體是指，所述寡核苷酸的4種組成核苷酸堿基(即，a、g、t/u和c)中的至少一種是天然存在的核苷酸的類似物或酯。在一些實(shí)施方案中，所述修飾的核苷酸會(huì)賦予寡核苷酸核酸酶抗性。額外的修飾可以包括：主鏈修飾，甲基化，異常堿基配對(duì)組合例如異堿基(isobase)異胞苷(isocytidine)和異胍(isoguanidine)等等。修飾也可包括3'和5'修飾，如加帽。其它修飾可以包括：天然存在的核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)被類似物取代，核苷酸間修飾例如不帶電連接修飾(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和帶電連接修飾(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，嵌入劑修飾(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)、含有螯合劑的修飾(例如金屬、放射性金屬、硼和氧化性金屬等)，含有烷化劑的修飾和用修飾的連接修飾(例如α異頭核酸等)。而且，通常存在于核苷酸的糖中的任何羥基可以被膦酸酯基團(tuán)或磷酸酯基團(tuán)替代，被標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基保護(hù)，或者被激活以制備與額外的核苷酸或固體載體的額外連接。5’和3’末端oh基團(tuán)可以被磷酸化或者被胺、約1到約20個(gè)碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)部分、聚乙二醇(peg)聚合物(在一個(gè)實(shí)施方案中，約10至約80kda)、peg聚合物(在另一個(gè)實(shí)施方案中，約20至約60kda)、或者其它親水的或疏水的生物的或合成的聚合物取代。多核苷酸也可以含有本領(lǐng)域通常已知的核糖或脫氧核糖的類似形式，包括2'-o-甲基、2'-o-烯丙基、2'-o-乙基、2'-o-丙基、2'-o-ch2ch2och3、2'-氟-或2'-疊氮基、碳環(huán)糖類似物、α-異頭糖、諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖的差向異構(gòu)糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環(huán)類似物和諸如甲基核苷的無堿基核苷類似物。如上面所指出的，一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵可被替代性的連接基替代。這些替代性的連接基包括其中磷酸酯被以下基團(tuán)替代的實(shí)施方案：p(o)s(“硫代磷酸酯(thioate)”)、p(s)s(“二硫代磷酸酯(dithioate)”)、(o)nrx2(“酰胺”)、p(o)rx、p(o)orx'、co或ch2(“甲縮醛(formacetal)”)，其中每個(gè)rx或rx'獨(dú)立地是h或取代的或未取代的任選含有醚(-o-)連接的烷基(c1-c20)、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中的所有連接不一定都是一致的。糖、嘌呤和嘧啶的類似形式的取代在設(shè)計(jì)終產(chǎn)物方面可能是有利的，替代性的主鏈結(jié)構(gòu)(如聚酰胺主鏈)也是如此。如果存在的話，可以在聚合物裝配之前或之后，實(shí)現(xiàn)對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾。核苷酸序列可以被非核苷酸組分中斷。在聚合以后，可以進(jìn)一步修飾多核苷酸，諸如通過與標(biāo)記組分的綴合。本文使用的“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換地用于指示核苷酸的聚合物，且包括dna、rna、dna/rna雜交物以及這些類型的核酸、寡核苷酸和多核苷酸的修飾，其中包括各種實(shí)體或部分在任意位置處與核苷酸單元的連接。術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括雙鏈或單鏈分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸和多核苷酸是比術(shù)語適體更廣的術(shù)語，因而，術(shù)語核酸、寡核苷酸和多核苷酸包括作為適體的核苷酸的聚合物，但是術(shù)語核酸、寡核苷酸和多核苷酸不限于適體。當(dāng)指示核酸的修飾時(shí)，本文使用的術(shù)語“至少一個(gè)核苷酸”是指所述核酸中的一個(gè)、幾個(gè)或所有核苷酸，這指示，a、c、t、g或u中的任一個(gè)或全部在核酸中的任一次或所有出現(xiàn)可以被修飾或未被修飾。在其它方面，本公開內(nèi)容提供單獨(dú)地或與其它修飾的核苷和/或天然存在的核苷組合地使用本文所述的修飾的核苷來制備適體和somamer(在下面描述)的方法。在特定的實(shí)施方案中，使用如下所述的一般selex或改進(jìn)的selex方法制備所述適體和somamer。本文使用的“核酸配體”、“適體”、“somamer”和“克隆”可互換地用于指示對(duì)靶分子具有希望的作用的非天然存在的核酸。希望的作用包括、但不限于：結(jié)合靶、催化地改變靶、以修飾或改變靶或靶的功能活性的方式與靶反應(yīng)、共價(jià)地結(jié)合靶(如在自殺抑制劑的情況中)和促進(jìn)靶與其它分子之間的反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述作用是對(duì)靶分子的特異性結(jié)合親和力，這樣的靶分子是三維化學(xué)結(jié)構(gòu)而不是多核苷酸，其通過不依賴于watson/crick堿基配對(duì)或三螺旋形成的機(jī)理與所述核酸配體結(jié)合，其中所述適體不是具有被所述靶分子結(jié)合的已知生理功能的核酸。給定的靶的適體包括：通過以下方法從核酸的候選混合物中鑒別出的核酸，其中所述適體是所述靶的配體，所述方法包括：(a)使所述候選混合物接觸所述靶，其中在所述候選混合物中的與其它核酸相比具有增加的對(duì)所述靶的親和力的核酸可以與所述候選混合物的其余部分分開；(b)從所述候選混合物的其余部分中分離出親和力增加的核酸；和(c)擴(kuò)增所述親和力增加的核酸，以產(chǎn)生配體富集的核酸混合物，由此鑒別出所述靶分子的適體。已知親和相互作用是程度問題；但是，在該背景下，適體對(duì)其靶的“特異性結(jié)合親和力”是指，所述適體與其靶的結(jié)合親和力的程度通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于它與混合物或樣品中其它非靶組分的結(jié)合親和力?！斑m體”、“somamer”或“核酸配體”是一類或一種具有特定核苷酸序列的核酸分子的拷貝集合。適體可以包括任何適當(dāng)數(shù)量的核苷酸。“適體”表示超過一個(gè)這樣的分子集合。不同的適體可能具有相同或不同的核苷酸數(shù)量。適體可以是dna或rna，且可以是單鏈的、雙鏈的，或含有雙鏈或三鏈區(qū)域。本文使用的“somamer”或慢解離速率修飾適體(slowoff-ratemodifiedaptamer)表示具有改進(jìn)的解離速率特征的適體。可以使用在標(biāo)題為“methodforgeneratingaptamerswithimprovedoff-rates”的美國專利公開20090004667中描述的改進(jìn)的selex方法制備somamer。本文使用的“蛋白”與“肽”、“多肽”或“肽片段”同義地使用。“純化的”多肽、蛋白、肽或肽片段基本上不含有來自細(xì)胞、組織或無細(xì)胞來源(所述氨基酸序列得自于此)的細(xì)胞物質(zhì)或其它污染蛋白，或當(dāng)化學(xué)地合成時(shí)，基本上不含有化學(xué)前體或其它化學(xué)試劑。selex方法術(shù)語“selex”和“selex方法”在本文中互換地使用，通常是指以下二者的組合：(1)選擇以希望的方式(例如高親和力地結(jié)合蛋白)與靶分子相互作用的核酸，(2)擴(kuò)增那些選擇的核酸。selex方法可以用于鑒別對(duì)特定靶分子或生物標(biāo)志物具有高親和力的適體。selex通常包括：制備核酸的候選混合物，使所述候選混合物與希望的靶分子結(jié)合以形成親和復(fù)合物，使所述親和復(fù)合物與未結(jié)合的候選核酸分開，從所述親和復(fù)合物中分開并分離核酸，純化所述核酸，并鑒別特異性的適體序列。所述方法可以包括多個(gè)循環(huán)，以進(jìn)一步改進(jìn)所選擇的適體的親和力。所述方法可以包括在所述方法中的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)處的擴(kuò)增步驟。參見例如標(biāo)題為“nucleicacidligands”的美國專利5,475,096。selex方法可以用于制備共價(jià)地結(jié)合它的靶的適體以及非共價(jià)地結(jié)合它的靶的適體。參見例如標(biāo)題為“systematicevolutionofnucleicacidligandsbyexponentialenrichment:chemi-selex”的美國專利5,705,337。selex方法可以用于鑒別含有修飾的核苷酸的高親和力適體，所述修飾的核苷酸賦予所述適體改進(jìn)的特征，例如，提高的體內(nèi)穩(wěn)定性或改進(jìn)的遞送特征。這樣的修飾的實(shí)例包括：在核糖和/或磷酸酯和/或堿基位置處的化學(xué)取代。在標(biāo)題為“highaffinitynucleicacidligandscontainingmodifiednucleotides”的美國專利5,660,985中描述了selex方法鑒別出的含有修飾的核苷酸的適體，該專利描述了含有在嘧啶的5'-和2'-位處被化學(xué)修飾的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美國專利5,580,737(參見同上)描述了高度特異性的適體，所述適體含有一個(gè)或多個(gè)被2'-氨基(2'-nh2)、2'-氟(2'-f)和/或2'-o-甲基(2'-ome)修飾的核苷酸。也參見標(biāo)題為“selexandphotoselex”的美國專利申請(qǐng)公開20090098549，它描述了具有擴(kuò)展的物理和化學(xué)性質(zhì)的核酸文庫和它們?cè)趕elex和photoselex中的用途。selex也可以用于鑒別具有希望的解離速率特征的適體。參見標(biāo)題為“methodforgeneratingaptamerswithimprovedoff-rates”的美國專利公開20090004667(它通過援引整體加入本文)，它描述了用于制備可以結(jié)合靶分子的適體的改進(jìn)的selex方法。描述了用于產(chǎn)生適體和光適體的方法，所述適體和光適體具有更慢的與它們各自的靶分子解離的速率。所述方法包括：使所述候選混合物接觸靶分子，允許形成核酸-靶復(fù)合物，并執(zhí)行慢解離速率富集過程，其中具有快解離速率的核酸-靶復(fù)合物解離且不會(huì)重新形成，而具有慢解離速率的復(fù)合物保持完整。另外，所述方法包括在候選核酸混合物的制備中使用修飾的核苷酸，以產(chǎn)生具有改進(jìn)的解離速率性能的適體(參見美國專利公開20090098549,標(biāo)題為“selexandphotoselex”)。(也參見美國專利7,855,054和美國專利公開20070166740)。這些申請(qǐng)中的每一篇通過援引整體加入本文?！鞍小薄ⅰ鞍蟹肿印被颉鞍小痹诒疚闹惺侵负怂峥梢砸韵Ｍ姆绞綄?duì)其起作用的任意化合物。靶分子可以是蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、病原體、有毒物質(zhì)、底物、代謝物、過渡態(tài)類似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、營養(yǎng)物、生長因子、細(xì)胞、組織、任一種前述物質(zhì)的任意部分或片段等，但不限于此?；旧先我獾幕瘜W(xué)或生物學(xué)效應(yīng)器可以是合適的靶。任意大小的分子均可以充當(dāng)靶。還可以以某些方式修飾靶，以增強(qiáng)靶和核酸之間的相互作用的可能性或強(qiáng)度。靶還可以包括特定化合物或分子的任意微小變化，例如，在蛋白的情況下，例如在氨基酸序列的微小變化、二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌僮骱托揎?，例如與標(biāo)記組分的綴合，所述綴合基本上不改變分子同一性?！鞍蟹肿印被颉鞍小笔且活惢蛞环N能夠結(jié)合適體的分子或多分子結(jié)構(gòu)的拷貝集合?！鞍蟹肿印被颉鞍小北硎境^一個(gè)這樣的分子集合。在標(biāo)題為“modifiedselexprocesseswithoutpurifiedprotein”的美國專利6,376,190中描述了其中靶是肽的selex方法的實(shí)施方案。化學(xué)合成在本文中描述了在本公開內(nèi)容中提供的化合物的化學(xué)合成方法。可以以已知的方式修改和/或改變這些和/或其它眾所周知的方法，以便促進(jìn)在本公開內(nèi)容中提供的其它化合物的合成。參考路線1，在一種方案中，如下制備本公開內(nèi)容的c-5位修飾的氨基羰基嘧啶：在堿的存在下，使在5-位被三氟乙氧基羰基修飾的嘧啶與胺反應(yīng)；和分離所述c-5修飾的氨基羰基嘧啶。在一些實(shí)施方案中，所述三氟乙氧基羰基嘧啶選自包括、但不限于具有以下結(jié)構(gòu)的化合物的化合物組：其中x選自包括、但不限于以下部分的組：-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3和-疊氮基，且其中可以被下述部分替代：碳環(huán)糖類似物、α-異頭糖、諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖的差向異構(gòu)糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環(huán)類似物和諸如甲基核苷的無堿基核苷類似物。在一些實(shí)施方案中，所述胺選自包括、但不限于以下化合物的組：式rnh2的化合物，其中r選自-(ch2)n-rx1；rx1選自：h*-ch3*表示所述rx1基團(tuán)與(ch2)n連接基的連接點(diǎn)其中rx4選自：支鏈或直鏈低級(jí)烷基(c1-c20)；鹵素(f、cl、br、i)；腈(cn)；硼酸(bo2h2)；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx2)；伯酰胺(conh2)；仲酰胺(conhrx2)；叔酰胺(conrx2rx3)；磺酰胺(so2nh2)；n-烷基磺酰胺(sonhrx2)；其中rx2和rx3獨(dú)立地選自：支鏈或直鏈低級(jí)烷基(c1-c20)；苯基(c6h5)；rx4取代的苯環(huán)(rx4c6h4)，其中rx4如上面所定義；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx5)，其中rx5是支鏈或直鏈低級(jí)烷基(c1-c20)；和環(huán)烷基，其中rx2＝rx3＝(ch2)n；且其中n＝0-10。在特定的實(shí)施方案中，所述胺選自：在一些實(shí)施方案中，所述堿是選自三乙胺、二異丙胺等的叔胺。參考路線1，本公開內(nèi)容還提供用于合成c-5修飾的氨基羰基嘧啶的3'-亞磷酰胺的方法，所述方法包括：在堿的存在下，使所述c-5修飾的氨基羰基嘧啶與氰基乙基二異丙基氯代亞磷酰胺反應(yīng)；和分離所述3'-亞磷酰胺。在一些實(shí)施方案中，所述c-5修飾的氨基羰基嘧啶具有以下結(jié)構(gòu)：其中r和x如上面所定義。在一些實(shí)施方案中，所述堿是選自三乙胺、二異丙胺等的叔胺。再參考路線1，本公開內(nèi)容還提供用于合成c-5修飾的氨基羰基嘧啶的5'-三磷酸酯的方法，所述方法包括：a)在堿的存在下，使具有下式的c-5修飾的氨基羰基嘧啶與乙酸酐反應(yīng)：其中r和x如上面所定義，隨后用酸裂解5’-dmt基團(tuán)，以形成具有以下結(jié)構(gòu)的3’-乙酸酯：b)對(duì)步驟a)的3’-乙酸酯進(jìn)行l(wèi)udwig-eckstein反應(yīng)，繼之以陰離子交換色譜；和c)分離具有以下結(jié)構(gòu)的c-5修飾的氨基羰基嘧啶的5’-三磷酸酯或其鹽：使用的堿選自包括、但不限于叔胺的組。在一些實(shí)施方案中，所述堿是吡啶。在步驟a中使用的酸選自包括、但不限于二氯乙酸、三氯乙酸和1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的組：。在一個(gè)替代方案中，所述三氟乙氧基羰基嘧啶具有以下結(jié)構(gòu)：參考路線2，通過在鈀催化劑和堿的存在下使路線2的化合物(7)與一氧化碳和三氟乙醇反應(yīng)，形成該化合物。所述堿選自包括、但不限于叔胺的組，所述叔胺選自三乙胺等。本公開內(nèi)容包括通過上述方法中的每一種制備的化合物。實(shí)施例下述實(shí)施例僅僅為了例證目的而提供，無意限制由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的且常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)在本文中描述的所有實(shí)施例?？梢匀鐦?biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(諸如sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第3版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,(2001))描述的那樣實(shí)現(xiàn)在下述實(shí)施例中描述的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)。使用下述的一般方法制備了在實(shí)施例1-3和5中描述的修飾的核苷。在本文中使用的命名法是基于matsuda等人nucleicacidsresearch1997,25：2784-2791所述的系統(tǒng)。路線1實(shí)施例1.5'-o-dmt-du-5-羧酰胺(3a-e)的合成5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(4-氟芐基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷(3a)。通過matsuda等人的方法(nomura,y.；ueno,y.；matsuda,a.nucleicacidsresearch1997,25∶2784-2791；ito,t.,ueno,y.；matsuda,a.nucleicacidsresearch2003,31∶2514-2523)制備原料5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-三氟乙氧基羰基-2'-脫氧尿苷(1)。將(1)(9.85g,15mmol)、4-氟芐胺(2a)(2.25g,18mmol,1.3當(dāng)量)、三乙胺(4.2ml,30mmol)和無水乙腈(30ml)的溶液在惰性氣氛下在60-70℃加熱2-24小時(shí)。通過薄層色譜法(硅膠60,5％甲醇/二氯甲烷)或hplc證實(shí)(1)向酰胺(3a)的定量轉(zhuǎn)化。在真空中濃縮反應(yīng)混合物，并使用在1％三乙胺/99％乙酸乙酯中的0-3％甲醇洗脫液，通過硅膠快速色譜法(still,w.c.；kahn,m.；mitra,a.j.org.chem.1978,43∶2923)純化殘余物。合并含有純產(chǎn)物的級(jí)分，并蒸發(fā)。通過與無水乙腈一起共蒸發(fā)，去除痕量的殘余溶劑，隨后在高真空下干燥，得到(3a)，為白色固體(6.57g,64％收率)。1h-nmr(300mhz,cd3cn)δ2.20-2.40(2h,m),3.28(2h,d,j＝4.3hz),3.76(6h,s),4.01(1h,dd,j＝3.8,4.2hz),4.26-4.30(1h,m),4.48(2h,bd,j＝6.1hz),6.11(1h,t,j＝6.5hz),6.85-7.46(13h,m),7.03-7.36(4h,m),8.58(1h,s),9.01(1h,t,j＝6.1hz)。ms(m/z)c38h36fn3o8的計(jì)算值681.25；測(cè)量值680.4[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-((r)-2-糠基甲基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷(3b)。如關(guān)于(3a)所述，使用(r)-2-糠基甲胺(2b)制備化合物(3b)，并分離，為白色固體(9.3g,94％收率)。色譜法的洗脫液是1％三乙胺/4％甲醇/95％乙酸乙酯。1h-nmr(cd3cn)δ1.51-1.57(1h,m),1.84-1.94(3h,m),2.18-2.38(2h,m),3.25-3.52(4h,m重疊),3.66-3.93(3h,m重疊),3.78(6h,s),3.97-4.02(1h,m),4.24-4.29(1h,m),6.12(1h,t,j＝6.5),6.86-7.47(13h,m),8.54(1h,s),8.83(1h,bs)。ms(m/z)c36h39n3o9的計(jì)算值657.27；測(cè)量值656.5[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-((s)-2-糠基甲基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷(3c)。如關(guān)于(3b)所述，使用(s)-2-糠基甲胺(2c)制備化合物(3c)，并分離，為白色固體(9.9g,99％收率)。1h-nmr(cd3cn)δ1.50-1.59(1h,m),1.84-1.95(3h,m),2.18-2.40(2h,m),3.24-3.50(4h,m重疊),3.69-3.97(3h,m重疊),3.78(6h,s),3.98-4.02(1h,m),4.25-4.30(1h,m),6.14(1h,t,j＝6.5),6.87-7.47(13h,m),8.54(1h,s),8.84(1h,bs)。ms(m/z)c36h39n3o9的計(jì)算值657.27；測(cè)量值656.5[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(2-(4-嗎啉代)乙基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷(3d)。如關(guān)于(3a)所述，使用2-(4-嗎啉代)-乙胺(2d)制備化合物(3d)，并分離，為白色固體(8.2g,80％收率)。色譜法的洗脫液是5％甲醇/2％三乙胺/93％二氯甲烷。1h-nmr(cd3cn)δ2.21-2.39(2h,m),2.39-2.41(4h,m),2.48(2h,t,j＝6.2hz),3.27-3.29(2h,m),3.41(2h,dt,j＝5.8,6.2hz),3.61-3.64(4h,m),3.78(6h,s),3.98-4.02(1h,m),4.25-4.30(1h,m),6.10(1h,t,j＝6.4),6.86-7.47(13h,m),8.55(1h,s),8.79(1h,bt,j～6hz)。ms(m/z)c37h42n4o9的計(jì)算值686.30；測(cè)量值685.7[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(2-(n-苯并咪唑酮基)乙基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷(3e)。如關(guān)于(3a)所述，使用n-苯并咪唑酮基-2-乙胺(2e)(casrn64928-88-7)制備化合物(3e)。色譜法的洗脫液是2％甲醇/1％三乙胺/97％二氯甲烷。分離純產(chǎn)物，為褐色固體(8.2g,74.5％收率)。1h-nmr(cd3cn)δ2.20-2.36(2h,m),3.27-3.29(2h,m),3.60(2h,q,j＝6.5hz),3.758(3h,s),3.762(3h,s),3.97(2h,t,j＝6.5hz),3.98-4.02(1h,m),4.27-4.30(1h,m),6.09(1h,t,j＝6.5hz),6.86-7.48(13h,m),6.91-7.10(4h,m),8.52(1h,s),8.76(1h,t,j＝6.1hz)。ms(m/z)c40h39n5o9的計(jì)算值733.27；測(cè)量值732.0[m-h]-。實(shí)施例2.5'-o-dmt-核苷ce-亞磷酰胺(4a-4e)的合成5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(4-氟芐基氨基羰基)-3'-o-[(2-氰基乙氧基)(n,n-二異丙基氨基)氧膦基]-2'-脫氧尿苷(4a)。在干燥的氬氣氛下，將dmt-保護(hù)的核苷(3a)(4.00g,5.9mmol)在無水二氯甲烷(40ml)中的溶液冷卻至約-10℃。加入二異丙基乙胺(3.1ml,17.6mmol,3當(dāng)量)，隨后逐滴加入2-氰基乙基二異丙基氯代亞磷酰胺(1.7ml,7.7mmol,1.3當(dāng)量)。將溶液攪拌1小時(shí)，并通過薄層色譜法(硅膠60,乙酸乙酯/己烷)證實(shí)反應(yīng)結(jié)束。在冰冷的2％碳酸氫鈉溶液(200ml)和乙酸乙酯(200ml)之間分配反應(yīng)混合物。用鹽水洗滌有機(jī)層，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，并濃縮。使用1％三乙胺/99％乙酸乙酯的流動(dòng)相，通過硅膠快速色譜法純化殘余物。合并含有純產(chǎn)物的級(jí)分，并在真空中蒸發(fā)(<30℃)。通過與無水乙腈一起共蒸發(fā)，去除痕量的殘余色譜溶劑，并在高真空干燥，得到(4a)，為白色穩(wěn)定泡沫(4.10g,80％收率)。1h-nmr(cd3cn,2種異構(gòu)體)δ1.02-1.16(12h,m),2.27-2.57(2h,m),2.51/2.62(2h,2t,j＝6.0/6.0hz),3.25-3.37(2h,m),3.50-3.79(4h,m重疊),3.738(3h,s),3.742(3h,s),4.13/4.16(1h,2q,j＝3.5/3.7hz),4.37-4.43(1h,m),4.44-4.47(2h,m),6.09/6.10(1h,2t,j＝6.4/7.1hz),6.83-7.44(13h,m),7.01-7.30(4h,m),8.58/8.60(1h,2s),8.98(1h,b,j～5.5hz),9.24(1h,bs)。31p-nmr(cd3cn)δ148.01(s),148.06(s)。19f-nmr(cd3cn)δ-117.65(m)。ms(m/z)c47h53fn5o9p的計(jì)算值881.36；測(cè)量值880.3[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-((r)-2-糠基甲基氨基羰基)-3'-o-[(2-氰基乙氧基)(n,n-二異丙基氨基)氧膦基]-2'-脫氧尿苷(4b)。如關(guān)于(4a)所述，制備化合物(4b)。分離非對(duì)映異構(gòu)的亞磷酰胺的1∶1混合物，為白色固體泡沫(3.15g,62％收率)。色譜法的洗脫液是1％三乙胺/20％己烷/79％乙酸乙酯。1h-nmr(cd3cn,2種異構(gòu)體)δ1.14-1.27(12h,m),1.51-1.59(1h,m),1.86-1.94(3h,m),2.27-2.59(2h,m),2.54/2.65(2h,2t,j＝6.0/5.7hz),3.27-3.38(2h,m),3.44-3.97(9h,m重疊),3.782(3h,s),3.786(3h,s),4.11-4.18(1h,m),4.39-4.48(1h,m),6.11/6.13(1h,2t,j＝5.6/6.1hz),6.96-7.47(13h,m),8.58/8.60(1h,2s),8.75(1h,bt,j～5.4hz),9.36(1h,bs)。31p-nmr(cd3cn)δ148.09(s),148.13(s)。ms(m/z)c45h56n5o10p的計(jì)算值857.38；測(cè)量值856.6[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-((s)-2-糠基甲基氨基羰基)-3'-o-[(2-氰基乙氧基)(n,n-二異丙基氨基)氧膦基]-2'-脫氧尿苷(4c)。如關(guān)于(4b)所述，制備化合物(4c)。分離非對(duì)映異構(gòu)的亞磷酰胺的1∶1混合物，為白色固體泡沫(3.74g,74％收率)。1h-nmr(cd3cn,2種異構(gòu)體)δ1.14-1.27(12h,m),1.51-1.59(1h,m),1.86-1.94(3h,m),2.28-2.51(2h,m),2.53/2.65(2h,2t,j＝6.0/6.0hz),3.25-3.41(2h,m),3.44-4.14(9h,m重疊),3.783(3h,s),3.786(3h,s),4.12-4.19(1h,m),4.40-4.49(1h,m),6.11/6.13(1h,2t,j＝6.3/6.3hz),6.86-7.48(13h,m),8.58/8.60(1h,2s),8.75(1h,bt,j～5.4hz),9.36(1h,bs)。31p-nmr(cd3cn)δ148.09(s),148.13(s)。ms(m/z)c45h56n5o10p的計(jì)算值857.38；測(cè)量值856.5[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(2-(4-嗎啉代)乙基氨基羰基)-3'-o-[(2-氰基乙氧基)(n,n-二異丙基氨基)氧膦基]-2'-脫氧尿苷(4d)。除了純化使用1％三乙胺/5％無水乙醇/94％乙酸乙酯的色譜洗脫液以外，如關(guān)于(4a)所述，制備化合物(4d)。分離非對(duì)映異構(gòu)的亞磷酰胺的1∶1混合物，為白色固體泡沫(3.9g,75％收率)。1h-nmr(cd3cn,2種異構(gòu)體)δ1.04-1.19(12h,m),2.28-2.59(2h,m),2.43-2.47(6h,m重疊),2.53/2.64(2h,2t,j＝6.2/6.2hz),3.27-3.76(8h,m重疊),3.61-3.65(4h,m),3.781(3h,s),3.789(3h,s),4.12-4.19(1h,m),4.39-4.49(1h,m),6.11/6.13(1h,2t,j＝5.2//5.2),6.86-7.48(13h,m),8.58/8.60(1h,2s),8.78(1h,bt,j～5.3hz),9.78(1h,bs)。31p-nmr(cd3cn)δ148.08(s),148.11(s)。ms(m/z)c46h59n6o10p的計(jì)算值886.4；測(cè)量值885.7[m-h]-。5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(2-(n-苯并咪唑酮基)乙基氨基羰基)-3'-o-[(2-氰基乙氧基)(n,n-二異丙基氨基)氧膦基]-2'-脫氧尿苷(4e)。除了純化使用1％三乙胺/10％無水甲醇/89％乙酸乙酯的色譜洗脫液以外，如關(guān)于(4a)所述，制備化合物(4e)。分離非對(duì)映異構(gòu)的亞磷酰胺的1∶1混合物，為白色固體泡沫(1.6g,31％收率)。1h-nmr(cd3cn,2種異構(gòu)體)δ1.03-1.18(12h,m),2.27-2.57(2h,m),2.52/2.63(2h,2t,j＝6.0/6.0),3.27-3.37(2h,m),3.49-3.80(6h,m重疊),3.732(3h,s),3.735/3.738(3h,2s),4.00(2h,bt,j～6.0hz),4.12-4.18(1h,m),4.30-4.47(1h,m),6.08/6.10(1h,2t,j＝6.3/6.3hz),6.85-7.48(13h,m),6.93-7.09(4h,m),8.57/8.60(1h,2s),8.82/8.83(1h,2bt,j～4.3/4.3hz),9.48(1h,bs)。31p-nmr(cd3cn)δ148.07(s),148.10(s)。實(shí)施例3.3'-o-乙?；?核苷(5a-5e)的合成5-(4-氟芐基氨基羰基)-3'-o-乙?；?2'-脫氧尿苷(5a)。將核苷(3a)(3.00g,4.4mmol)溶解于無水吡啶(30ml)和乙酸酐(3ml)的溶液中。將所述溶液攪拌過夜，并在真空中濃縮，得到3'-o-乙?；?核苷。通過與無水甲苯(10ml)一起共蒸發(fā)，去除殘余的溶劑。將殘余物溶解于無水二氯甲烷(10ml)中，并用在二氯甲烷(58ml)中的3％三氯乙酸處理。將紅色溶液攪拌過夜，在此期間產(chǎn)物結(jié)晶。將漿狀物冷卻至-20℃，過濾，并用乙醚洗滌。在真空中干燥殘余物，得到(5a)，為灰白色固體(1.10g,59％收率)。1h-nmr(cd3cn)δ2.07(3h,s),2.33-2.38(1h,m),2.50-2.52(1h,m),3.63-3.64(2h,m),4.10(1h,bdd,j＝3.1,5.1hz),4.46(2h,d,j＝6.0hz),5.19-5.26(2h,m重疊),6.15(1h,t,j＝7.0hz),7.15(2h,tt,j＝2.2,9.0hz),7.31-7.38(2h,m),8.79(1h,s),9.14(1h,bt,j＝6.1hz),11.95(1h,bs)。19f-nmr(cd3cn)δ-116.02(tt,j＝5.5,9.0hz))。ms(m/z)c19h20fn3o7的計(jì)算值421.13；測(cè)量值419.8[m-h]-。5-((r)-2-糠基甲基氨基羰基)-3'-o-乙酰基-2'-脫氧尿苷(5b)。通過關(guān)于(5a)所述的方法，從(4b)制備化合物(5b)，并通過從二氯甲烷和乙酸乙酯的混合物中沉淀來分離，為白色固體(1.27g,73％收率)。1h-nmr(cdcl3)δ1.57-2.02(4h,m),2.12(3h,s),2.46-2.50(2h,m),3.03(1h,bs),3.43-3.64(2h,m),3.75-3.97(2h,m),3.78-4.10(3h.m),4.20-4.21(1h,m),5.40-5.42(1h,m),6.35(1h,dd,j＝6.5,7.7hz),8.91(1h,t,j＝5.5hz),9.17(1h,s),9.44(1h,bs)。ms(m/z)c17h23n3o8的計(jì)算值397.15；測(cè)量值396.1[m-h]-。5-((s)-2-糠基甲基氨基羰基)-3'-o-乙?；?2’-脫氧尿苷(5c)。通過關(guān)于(5a)所述的方法，從(4c)制備化合物(5c)，并通過從二氯甲烷和乙醚的混合物中沉淀來分離，為淺橙色固體(1.35g,77％收率)。1h-nmr(cdcl3)δ1.57-2.03(4h,m),2.12(3h,s),2.47-2.51(2h,m),2.98(1h,bs),3.40-3.68(2h,m),3.78-3.95(2h,m),3.90-4.12(3h.m),4.20-4.21(1h,m),5.39-5.42(1h,m),6.33(1h,dd,j＝6.7,7.4hz),8.90(1h,t,j＝5.5hz),9.15(1h,s),9.37(1h,bs)。ms(m/z)c17h23n3o8的計(jì)算值397.15；測(cè)量值395.9[m-h]-。5-(2-(4-嗎啉代)乙基氨基羰基)-3'-o-乙酰基-2'-脫氧尿苷(5d)。將核苷(3d)(1.00g,1.37mmol)溶解于無水吡啶(10ml)和乙酸酐(1ml)的溶液中。將溶液攪拌過夜，并在真空中濃縮，得到3'-o-乙酰基-核苷。通過與無水甲苯(10ml)一起共蒸發(fā)，去除殘余的溶劑。將殘余物溶解于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(20ml)(leonard,n.j.tetrahedronletters,1995,36∶7833)中，并在約50℃加熱3小時(shí)。通過薄層色譜法(tlc)證實(shí)dmt基團(tuán)的完全裂解。通過將紅色溶液混合物倒入充分?jǐn)嚢璧募状?200ml)中終止反應(yīng)。在真空中濃縮得到的黃色溶液，并將殘余物溶解于熱的乙酸乙酯(20ml)中。在冷卻后，產(chǎn)物結(jié)晶，并在-20℃老化得到的漿狀物，隨后過濾，并用乙酸乙酯洗滌。分離3'-o-乙?；?核苷(5d)，為白色固體(0.46g,79％收率)。1h-nmr(dmso-d6)δ2.07(3h,s),2.32-2.45(7h,m重疊),2.49-2.52(1h,m),3.33-3.40(2h,m),3.57(4h,t,j＝4.5hz),3.60-3.63(2h,m),4.09(1h,bdd,j＝3.2,5.2hz),5.17-5.25(2h,m),6.14(1h,t,j＝7.0hz),8.74(1h,s),8.89(1h,bt,j＝5.4hz),11.90(1h,bs)。ms(m/z)c18h26n4o8的計(jì)算值426.18；測(cè)量值425.0[m-h]-。5-(2-(3-乙酰基-苯并咪唑酮-1-基)乙基氨基羰基)-3'-o-乙?；?2'-脫氧尿苷(5e)。除了在將dmt裂解反應(yīng)物倒入甲醇中時(shí)產(chǎn)物直接結(jié)晶以外，如關(guān)于(5d)所述，制備化合物(5e)。通過過濾分離二乙?；塑?5e)，為白色固體(0.55g,78％收率)。1h-nmr(dmso-d6)δ2.07(3h,s),2.30-2.37(1h,m),2.49-2.52(1h,m),2.63(3h,s)3.33(1h,bs),3.55-3.64(4h,m重疊),3.99(2h,t,j＝6.4hz),4.09(1h,bdd,j＝2.3,5.2hz),5.15-5.25(2h,m),6.13(1h,dd,j＝6.3,7.6hz),7.11(1h,ddd,j＝1.2,7.6,7.9hz),7.22(1h,ddd,j＝1.2,7.6,7.9hz),7.33(1h,dd,j＝0.8,7.9hz),8.02(1h,dd,j＝0.8,8.0hz),8.05(1h,bs),8.83(1h,bt),8.71(1h,s),11.87(1h,bs)。ms(m/z)c23h25n5o9的計(jì)算值515.17；測(cè)量值513.9[m-h]-。實(shí)施例4.3'-o-乙?；?核苷(5a-5d)的替代性合成還通過一個(gè)替代性的途徑(路線2)，從原料3'-o-乙?；?5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-碘-2'-脫氧尿苷(7)(vaught,j.d.,bock,c.,carter,j.,fitzwater,t.,otis,m.,schneider,d.,rolando,j.,waugh,s.,wilcox,s.k.,eaton,b.e.j.am.chem.soc.2010,132,4141-4151)，合成3'-o-乙酰基-核苷(5a-d)。簡而言之，參考路線2，鈀(ii)-催化的碘化物的三氟乙氧基羰基化得到活化的酯中間體(8)。使(8)與胺(2a-d)(1.3當(dāng)量,三乙胺(3當(dāng)量),乙腈,60-70℃,2-24小時(shí))縮合，隨后裂解5'-o-dmt保護(hù)基(3％三氯乙酸/二氯甲烷或1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇,室溫)，得到(5a-d)，其與通過中間體(3a-d)(路線1)生成的產(chǎn)物相同。路線23'-o-乙酰基-5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-(2,2,2-三氟乙氧基羰基)-2'-脫氧尿苷(8)。給500ml厚壁玻璃壓力反應(yīng)器充入氬，并裝入3'-o-乙?；?5'-o-二甲氧基三苯甲基-5-碘-2'-脫氧尿苷(7)(15.9g,22.8mmol)、無水乙腈(200ml)、三乙胺(7.6ml,54.7mmol)和2,2,2-三氟乙醇(16.4ml,228mmol)。劇烈攪拌得到的溶液，通過抽空脫氣至<100mmhg持續(xù)2分鐘。給燒瓶充入氬，并加入雙(芐腈)二氯化鈀(ii)(175mg,0.46mmol)。將得到的黃色溶液再次脫氣，然后從氣體歧管充入一氧化碳(99.9％)(注意：毒氣！)。維持1-10psico的壓力，同時(shí)劇烈攪拌反應(yīng)混合物，并在60-65℃加熱12小時(shí)。過濾冷卻的反應(yīng)混合物(注意：毒氣)，以去除黑色沉淀物，并在真空中濃縮。在二氯甲烷(120ml)和10％碳酸氫鈉(80ml)之間分配橙色殘余物。用水(40ml)洗滌有機(jī)層，并經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾，并濃縮，剩下橙色泡沫(17g)。該粗產(chǎn)物原樣使用，或通過硅膠快速色譜法(使用30％己烷/1％三乙胺/69％乙酸乙酯洗脫液)進(jìn)一步純化，得到(8)，為無色固體泡沫(12.7g,80％收率)。1h-nmr(cd3cn))δ2.03(3h,s),2.37-2.56(2h,m),3.36-3.38(2h,m),3.78(6h,s),4.15-4.19(1h,m),4.37-4.55(2h,m),5.21-5.26(1h,m),6.09(1h,t,j＝6.1hz),6.84-7.46(13h,m),8.53(1h,s)。19f-nmr(cd3cn)δ-74.07(t,j＝8.8hz)。ms(m/z)c35h33f3n2o10的計(jì)算值698.21；測(cè)量值697.4[m-h]-。實(shí)施例5.核苷5'-o-三磷酸酯的合成5-(4-氟芐基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷-5'-o-三磷酸酯(三-三乙基銨鹽)(6a)。通過ludwig和eckstein的方法(ludwig,j.和eckstein,f.j.org.chem.1989,54∶631)，在500μmol規(guī)模(5x)，從3'-o-乙?；?核苷(5a)合成三磷酸酯(6a)。如在一般方法(下文)中所述，通過陰離子交換色譜法，純化在氨解和蒸發(fā)以后得到的粗三磷酸酯產(chǎn)物。三磷酸核苷的陰離子交換hplc純化的一般方法。使用hplc柱，通過陰離子交換色譜法，純化三磷酸核苷，所述柱裝有sourceq樹脂(gehealthcare)，安裝在制備型hplc系統(tǒng)上，在278nm進(jìn)行檢測(cè)。線性洗脫梯度采用2種緩沖液(緩沖液a：10mm三乙基碳酸氫銨/10％乙腈，和緩沖液b：1m三乙基碳酸氫銨/10％乙腈)，在洗脫過程中在環(huán)境溫度從低緩沖液b含量至高緩沖液b運(yùn)行所述梯度。希望的產(chǎn)物通常是最后從柱上洗脫的物質(zhì)，并顯示為跨約10-12分鐘保留時(shí)間的寬峰(較早洗脫的產(chǎn)物包括多種反應(yīng)副產(chǎn)物，最突出的是二磷酸核苷)。在產(chǎn)物洗脫過程中，收集幾個(gè)級(jí)分。通過在waters2795hplc上的反相hplc，使用waterssymmetry柱(pn:wat054215)分析級(jí)分。在genevacvc3000d蒸發(fā)器中蒸發(fā)含有純產(chǎn)物的級(jí)分(通常>90％)，得到無色至淡褐色樹脂。在去離子水中重構(gòu)級(jí)分，并合并，用于最終分析。通過使用hewlettpackard8452a二極管陣列分光光度計(jì)在278nm分析，進(jìn)行產(chǎn)物定量。經(jīng)由方程式a＝εcl計(jì)算產(chǎn)物收率，其中：a是紫外吸光度，ε是估計(jì)的消光系數(shù)，l是光路長度(1cm)。將粗產(chǎn)物(6a)溶解于約5ml緩沖液a(表1:制備型hplc條件1)中。每次純化注射包括：將約1ml該溶液的過濾等分試樣注射進(jìn)具有486檢測(cè)器的waters625hplc中，后者配有resourceq6ml柱(gehealthcare產(chǎn)品代碼：17-1179-01)，以12ml/分鐘，使用0％-100％緩沖液b的流動(dòng)相梯度，洗脫50分鐘。對(duì)于(6a)[ε估計(jì)13700cm-1m-1]，分離的純化產(chǎn)物是130μmol(26％收率)。1h-nmr(d2o)1.15(27h,t,j＝7.3hz),2.32-2.37(2h,m),3.07(18h,q,j＝7.3hz),4.06-4.17(3h,m重疊),4.42(2h,bd,j～0.7hz),4.49-4.53(1h,m),4.70(>7h,bs,hod),6.12(1h,t,j＝6.8hz),6.96-7.26(4h,m),8.45(1h,s)。19f-nmr(d2o)δ-116.18(m)。31p-nmr(d2o)δ-10.58(d,j＝20hz),-11.45(d,j＝20hz),-23.29(t,j＝20hz)。ms(m/z)c17h21fn3o15p3的計(jì)算值619.02；測(cè)量值618.0[m-h]-。表1.制備型hplc條件15-((r)-2-糠基甲基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷-5'-o-三磷酸酯(三-三乙基銨鹽)(6b)。如關(guān)于(6a)所述，從3'-o-乙?；?核苷(5b)合成三磷酸酯(6b)。在具有waters2489檢測(cè)器的waters2767制備型系統(tǒng)上，使用裝有196mlsource15q樹脂(gehealthcare產(chǎn)品代碼：17-0947-05)的watersap-5柱(waterspn:wat023331,50mmx100mm)，以單次注射純化粗產(chǎn)物(6b)。使用與上面相同的緩沖液，但是將洗脫梯度修改為25％至80％緩沖液b，以50ml/分鐘洗脫90分鐘(表2:制備型hplc條件2)。在c18hplc柱上進(jìn)行第二次純化，以去除殘余的雜質(zhì)(表4:制備型hplc條件4)。對(duì)于(6b)[ε估計(jì)10200cm-1m-1]，分離的純化產(chǎn)物是325μmol(65％收率)。1h-nmr(d2o)1.17(27h,t,j＝7.3hz),1.49-1.63(1h,m),1.77-2.02(3h,m),2.34-2.39(2h,m),2.85-3.83(5h,m重疊),3.08(18h,q,j＝7.3hz),4.01-4.19(3h,m重疊),4.52-4.56(1h,m),4.70(>7h,bs,hod),6.15(1h,t,j＝6.8hz),8.48(1h,s)。31p-nmr(d2o)δ-10.50(d,j＝20hz),-11.51(d,j＝20hz),-23.25(t,j＝20hz)。ms(m/z)c15h24fn3o16p3的計(jì)算值595.04；測(cè)量值594.1[m-h]-。表3.制備型hplc條件35-((s)-2-糠基甲基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷-5'-o-三磷酸酯(三-三乙基銨鹽)(6c)。如關(guān)于(6a)所述，從3'-o-乙酰基-核苷(5c)合成三磷酸酯(6c)。在具有waters2489檢測(cè)器的waters2767制備型系統(tǒng)上，使用裝有196mlsource15q樹脂(gehealthcare產(chǎn)品代碼：17-0947-05)的watersap-5柱(waterspn:wat023331,50mmx100mm)，以單次注射純化粗產(chǎn)物(6c)。使用與上面相同的緩沖液，但是將洗脫梯度修改為25％至80％緩沖液b，以50ml/分鐘洗脫90分鐘(表2:制備型hplc條件2)。在c18hplc柱上進(jìn)行第二次純化，以去除殘余的雜質(zhì)(表4:制備型hplc條件4)。對(duì)于(6c)[ε估計(jì)10200cm-1m-1]，分離的純化產(chǎn)物是255μmol(51％收率)。1h-nmr(d2o)1.17(27h,t,j＝7.3hz),1.49-1.63(1h,m),1.78-2.01(3h,m),2.34-2.39(2h,m),2.85-3.82(5h,m重疊),3.09(18h,q,j＝7.3hz),4.01-4.19(3h,m重疊),4.52-4.56(1h,m),4.70(>7h,bs,hod),6.15(1h,t,j＝6.7hz),8.48(1h,s)。31p-nmr(d2o)δ-10.60(d,j＝20hz),-11.42(d,j＝20hz),-23.25(t,j＝20hz)。ms(m/z)c15h24fn3o16p3的計(jì)算值595.04；測(cè)量值594.1[m-h]-。5-(2-(4-嗎啉代)乙基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷-5'-o-三磷酸酯(二-三乙基銨鹽)(6d)。如關(guān)于(6a)所述，從3'-o-乙?；?核苷(5d)合成三磷酸酯(6d)。使用與用于(6a)的相同的設(shè)備和緩沖液純化粗產(chǎn)物(6d)，但是將梯度修改為在50分鐘洗脫內(nèi)緩沖液b從15％至60％，以提高產(chǎn)物的拆分(表3:制備型hplc條件3)。對(duì)于(6d)[ε估計(jì)10200cm-1m-1]，分離的純化產(chǎn)物是54μmol(11％收率)。1h-nmr(d2o)1.17(18h,t,j＝7.3hz),2.37-2.41(2h,m),2.91-2.98(2h,m),3.09(12h,q,j＝7.3hz),3.20-3.27(4h,m),3.87-3.90(4h,m),3.63-3.68(2h,m),4.10-4.18(3h,m重疊),4.56-4.60(1h,m),4.70(>7h,bs,hod),6.15(1h,bt,j＝6.3hz),8.48(1h,s)。31p-nmr(d2o)δ-9.99(d,j＝21hz),-11.90(d,j＝20hz),-23.19(t,j＝20hz)。ms(m/z)c16h27n4o16p3的計(jì)算值624.06；測(cè)量值623.1[m-h]-。表2.制備型hplc條件2表4.制備型hplc條件45-(2-(n-苯并咪唑酮基)乙基氨基羰基)-2'-脫氧尿苷-5'-o-三磷酸酯(二-三乙基銨鹽)(6e)。如關(guān)于(6a)所述，從3'-o-乙酰基-核苷(5e)合成三磷酸酯(6e)。使用與用于(6a)的相同的設(shè)備和緩沖液純化粗產(chǎn)物(6e)，但是將梯度修改為在50分鐘洗脫內(nèi)緩沖液b從15％至60％，以提高產(chǎn)物的拆分(表3:制備型hplc條件3)。對(duì)于(6e)[ε估計(jì)13700cm-1m-1]，分離的純化產(chǎn)物是101μmol(20％收率)。1h-nmr(d2o)δ1.17(18h,t,j＝7.3hz),2.17-2.36(2h,m),3.09(12h,q,j＝7.3hz),3.60-3.73(2h,m),4.01(2h,t,j＝5.4hz),4.03-4.15(3h,m),4.45-4.50(1h,m),4.70(>7h,bs,hod),6.04(1h,t,j＝6.6hz),6.95-7.12(4h,m),8.02(1h,s)。31p-nmr(d2o)δ-10.35(d,j＝20hz),-11.40(d,j＝20hz),-23.23(t,j＝20hz)。ms(m/z)c19h24n5o16p3的計(jì)算值671.04；測(cè)量值670.1[m-h]-。前述實(shí)施方案和實(shí)施例意圖僅僅作為實(shí)例。特定實(shí)施方案、實(shí)施例、或特定實(shí)施方案或?qū)嵤├脑囟疾粦?yīng)解釋為任何權(quán)利要求的關(guān)鍵的、必需的或重要的元素或特征。進(jìn)一步，在本文中描述的元素不是實(shí)踐所附權(quán)利要求所必需的，除非明確地描述為“必需的”或“關(guān)鍵的”。對(duì)公開的實(shí)施方案可以進(jìn)行各種改變、修改、替換和其它變化，而不背離所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍。說明書(包括實(shí)施例)應(yīng)被認(rèn)為是說明性的，而不是限制性的，而且所有這樣的修改和替換意圖包括在本發(fā)明的范圍中。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)當(dāng)由所附的權(quán)利要求和它們的法律等同方案(而不是又上面所給出的實(shí)施例)來確定。例如，在任何方法權(quán)利要求中敘述的步驟可以以任何可行的順序來執(zhí)行，并不限于在任何實(shí)施方案、實(shí)施例或權(quán)利要求中所表述的順序。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12