本發(fā)明涉及疫苗
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種重組人腸道病毒71型VP1乳酸球菌、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：手足口?。╤and,footandmouthdisease，HFMD）是由人類腸道病毒引起以發(fā)熱和手、足、口腔部位的皮疹或皰疹性咽峽炎為主要臨床特征的一種急性傳染病。HFMD在5歲以下兒童中高發(fā)，主要由腸道病毒71型（humanenterovirus71，EV71）和柯薩奇病毒A16型（CoxackievirusA16，CA16）兩種病原體引起的。重癥可導(dǎo)致神經(jīng)性病變?nèi)鐭o菌性腦膜炎、病毒性腦炎、急性遲緩性麻痹、心肌炎、新生兒敗血癥等，甚至造成短期內(nèi)猝死，對3歲以下兒童危害尤重。手足口病已成為我國亟需解決的重大公共衛(wèi)生問題。然而，目前尚無針對EV71和CVA16的特效抗病毒藥物，疫苗的使用被認為是控制病毒傳播的最佳方法，傳統(tǒng)的疫苗主要以靜脈注射為主，存在一定危險性，研究新的疫苗非常必要。研究發(fā)現(xiàn)腸道病毒的中和抗原決定簇主要位于暴露于病毒外的VP1上，是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白。而腸道免疫與腸道菌群有著密切關(guān)系。腸道菌群對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收、對抗病菌及免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。眾多研究證實，存在于腸道黏膜表面的益生菌對腸道黏膜具有雙重的保護作用，一方面它可以在腸道內(nèi)定值，維護腸道微生物菌群平衡；另一方面益生菌可直接作用于宿主的免疫系統(tǒng)，誘發(fā)腸道免疫，并刺激胸腺、脾臟和法氏囊等免疫器官發(fā)育。乳酸桿菌是益生菌中的一種，其廣泛存在于人和動物的胃腸道中，具有多種生理功能。目前正在開展的手足口病相關(guān)的疫苗一般為滅活疫苗、病毒樣顆粒疫苗、亞單位疫苗、減毒活疫苗以及表位肽疫苗等。從誘導(dǎo)免疫效果及保護率來看，目前最好的當屬滅活疫苗，已有5個EV71的甲醛滅活疫苗進入臨床試驗。在EV71相關(guān)的手足口病的防控方面具有一定效果。病毒樣顆粒疫苗較滅活疫苗稍差。效果較好的亞單位疫苗均采用桿狀病毒表達VP1蛋白。但由于中和抗原的數(shù)量及空間結(jié)構(gòu)的短缺，導(dǎo)致其誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性抗體的能力較差。中國申請專利201210557205.0，公開了一種重組豬流行性腹瀉病毒乳酸乳球菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用，利用RT-PCR擴增獲得豬流行性腹瀉病毒COE基因序列，設(shè)計表達引物，擴增PEDVCOE編碼序列，將其連接到乳酸乳球菌表達載體中，在電轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌NZ3900細胞內(nèi)得到重組菌，獲得豬流行性腹瀉病毒疫苗。該專利提出了一種利用乳酸球菌作為載體的豬流行性腹瀉病毒載體的方案，但針對人類的手足口病的口服免疫疫苗，并未見研究報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種重組人腸道病毒71型VP1乳酸球菌的構(gòu)建方法，通過該方法得到一種重組人腸道病毒71型VP1乳酸球菌，其可以作為口服疫苗應(yīng)用。本發(fā)明的目的在于提供一種重組人腸道病毒71型VP1乳酸球菌。本發(fā)明的目的在于提供一種重組人腸道病毒71型VP1乳酸球菌表達腸道病毒71型特異性抗體的方法。本發(fā)明的目的在于提供一種重組人腸道病毒EV71特異性抗體的應(yīng)用。根據(jù)目前國內(nèi)外關(guān)于人腸道病毒71型的疫苗研究最新進展，本發(fā)明提出一種口服疫苗方式，即使用乳酸球菌表達載體pNZ8048，構(gòu)建pNZ8048-EV71VP1重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到乳酸球菌MG1361中，構(gòu)建重組菌。之后使用重組菌飼喂小鼠，檢測其抗體產(chǎn)生情況及其中和病毒情況，衡量疫苗的免疫效果。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種重組人腸道病毒71型VP1乳酸球菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：步驟一：設(shè)計引物，通過RT-PCR對腸道病毒71型VP1片段進行擴增；步驟二：將擴增后的VP1片段通過限制性內(nèi)切酶KpnI，XbaI雙酶切后回收，與經(jīng)過同樣酶修飾后回收的乳酸球菌表達載體連接構(gòu)建出重組質(zhì)粒，并將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒測序比對；步驟三：將獲得正確序列的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到乳酸球菌中，得到重組人腸道病毒71型VP1乳酸球菌；所述步驟一中引物序列分別為：上游序列：5’-CGGGGTACCATGGGGGACAGAGTGGCAGATGTGA-3’；下游序列：5’-CTAGTCTAGATTACTAAGTTGGTTTAATGGAATCACCA-3’。所述步驟一種EV71VP1基因的擴增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃終延伸5min。所述步驟二中乳酸球菌表達載體為pNZ8048，得到的重組質(zhì)粒為pNZ8048-EV71VP1。所述步驟三中的乳酸球菌為乳酸球菌MG1361。一種重組人腸道病毒71型VP1乳酸球菌，由上述的方法構(gòu)建所得。一種重組人腸道病毒71型VP1乳酸球菌表達腸道病毒71型特異性抗體的方法，包括以下步驟：步驟1：將重組人腸道病毒71型VP1乳酸球菌接種于MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜，然后按照1:100的比例再次接種到新鮮的MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD600達到0.5；步驟2：用1.5ng/mL的乳酸球菌誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)2-3h，得到腸道病毒71型特異性抗體。一種重組人腸道病毒71型VP1乳酸球菌表達腸道病毒71型特異性抗體的方法，所述步驟2是使用1.5ng/mL的乳酸鏈球菌素誘導(dǎo)對重組人腸道病毒71型VP1乳酸球菌進行誘導(dǎo)，通過SDS-PAGE和Westernblot分析腸道病毒71型VP1的表達情況。一種重組人腸道病毒71型特異性抗體，所述腸道病毒71型特異性抗體可應(yīng)用于手足口病中的口服疫苗。一種手足口病口服疫苗，所述手足口病口服疫苗包括權(quán)利要求9所述的腸道病毒71型特異性抗體。目前正在開展的手足口病相關(guān)的疫苗一般為針對EV71的單個病毒的滅活疫苗、病毒樣顆粒疫苗、亞單位疫苗、減毒活疫苗以及表位肽疫苗等。從誘導(dǎo)免疫效果及保護率來看，目前最好的當屬滅活疫苗，已有5個EV71的甲醛滅活疫苗進入臨床試驗。在EV71相關(guān)的手足口病的防控方面具有一定效果。病毒樣顆粒疫苗較滅活疫苗稍差。效果較好的亞單位疫苗均采用桿狀病毒表達VP1蛋白。但由于中和抗原的數(shù)量及空間結(jié)構(gòu)的短缺，導(dǎo)致其誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性抗體的能力較差。EV71基因組編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白分別為VP1-4，而研究發(fā)現(xiàn)腸道病毒的中和抗原決定簇主要位于暴露于病毒外的VP1上，因此其VP1片段刺激機體可以產(chǎn)生中和EV71的中和抗體。隨著人們腸道免疫的研究進步，為口服疫苗的研究與應(yīng)用提供基礎(chǔ)。腸道免疫與腸道菌群有著密切關(guān)系。腸道菌群對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收、對抗病菌及免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。眾多研究證實，存在于腸道黏膜表面的益生菌對腸道黏膜具有雙重的保護作用，一方面它可以在腸道內(nèi)定值，維護腸道微生物菌群平衡；另一方面益生菌可直接作用于宿主的免疫系統(tǒng)，誘發(fā)腸道免疫，并刺激胸腺、脾臟和法氏囊等免疫器官發(fā)育。乳酸桿菌是益生菌中的一種，其廣泛存在于人和動物的胃腸道中，具有多種生理功能。有研究人員用乳酸桿菌喂小白鼠，發(fā)現(xiàn)在小腸中SIgA+的漿細胞數(shù)量有所增加，在輪狀病毒導(dǎo)致的腹瀉嬰兒中，喂食乳酸桿菌后可使病程減短。益生菌刺激腸道淋巴細胞而發(fā)揮免疫保護作用。乳酸菌作為腸道內(nèi)有益菌，其不光起到調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群的作用，還可以作為抗原遞呈工具，刺激黏膜，引起免疫反應(yīng)，因此乳酸菌是設(shè)計口服疫苗的良好載體。本研究使用乳酸菌作為表達宿主，表達EV71的中和抗原片段，并將重組菌作為口服疫苗飼喂小鼠，通過腸道粘膜免疫的方式使機體產(chǎn)生EV71的中和抗體，從而達到預(yù)防EV71傳播的效果。本發(fā)明是通過以下方案實現(xiàn)的：（1）使用RT-PCR的方法擴增EV71VP1片段。（2）將獲得RT-PCR片段酶切后與同樣酶切后的乳酸菌表達載體pNZ8048回收，然后構(gòu)建pNZ8048-EV71VP1重組質(zhì)粒。（3）將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到乳酸球菌MG1361中，用1.5ng/mL的乳酸菌誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，通過SDS-PAGE，Westernblot分析EV71VP1的表達情況。（4）將重組菌使用PBS稀釋10倍后飼喂6周齡的小鼠，檢測免疫后的抗體產(chǎn)生情況及抗體的中和病毒情況。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明使用乳酸菌作為表達宿主，表達EV71的中和抗原片段，并將重組菌作為口服疫苗飼喂小鼠，通過腸道粘膜免疫的方式使機體產(chǎn)生EV71的中和抗體，從而達到預(yù)防EV71傳播的效果。具體實施方式為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，下面結(jié)合實施例及圖1-3對本發(fā)明作進一步的說明，實施方式提及的內(nèi)容并非對本發(fā)明的限定。本發(fā)明中所用用的試劑，載體，菌株，均為商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明中所用的方法均為常用的分子生物學(xué)方法。實驗中的乳酸菌表達載體pNZ8048，乳酸菌MG1361，MC1061大腸桿菌，乳酸菌誘導(dǎo)劑Nisin均購自上海瑞楚生物有限公司。常用的DNAMARKER，蛋白MARKER，限制性內(nèi)切酶購自TAKARA公司。其他的常用的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。6周齡的SPF級Balb/c雌鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。引物參考Genbank號AY465356的基因設(shè)計引物，使用primier5.0軟件設(shè)計一對引物SEQNO.ID1-2。引物的兩端分別含有KpnI,XbaI酶切位點及保護堿基，引物由上海英俊公司合成。上游序列：5’-CGGGGTACCATGGGGGACAGAGTGGCAGATGTGA-3’下游序列：5’-CTAGTCTAGATTACTAAGTTGGTTTAATGGAATCACCA-3’。1、EV71VP1基因的擴增（1）病料組織來源于東莞市兒童醫(yī)院的臨床檢驗科，之前通過腸道病毒通用引物檢測陽性的病料。使用TAKARA的病毒DNA/RNA提取試劑盒（貨號9766）提取病毒RNA。提取方法按照試劑盒相應(yīng)的說明書的方法操作。（2）EV71VP1的RT-PCR擴增使用TAKARA一步法RT-PCR試劑盒（貨號RR057A）對提取的RNA進行擴增。反應(yīng)體系為：上游引物2ul，下游引物2ul，RNA模板2ul，2×PrimeScript1StepBuffer25ul，酶0.5ul，RNAfree水18.5ul。擴增條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，72℃終延伸5min。經(jīng)核酸電泳，檢測EV71RT-PCR擴增結(jié)果，大小約為909bp，擴增大小與實驗預(yù)期相符。2、EV71VP1基因乳酸菌表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化（1）將RT-PCR擴增獲得的EV71VP1片段經(jīng)過TAKARA純化試劑盒（貨號9761）純化，純化方法按照試劑盒中的說明書操作。將純化后的產(chǎn)物用KpnI,XbaI限制性內(nèi)切酶酶切，用同樣的酶酶切乳酸菌表達載體pNZ8048，將酶切后的產(chǎn)物分別用TAKARA純化試劑盒純化。之后使用TAKARA的T4DNA連接酶（貨號2011A）將純化后的EV71VP1片段與純化后的乳酸菌表達載體pNZ8048連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MC1061感受態(tài)細胞中，涂布于含有50ug/mL氯霉素的LB平板中。挑去單菌落，經(jīng)過PCR鑒定陽性的，接種到含有50ug/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒。（2）取10ul質(zhì)粒DNA和40ulMG1361感受態(tài)細胞混勻，然后移入到預(yù)冷的2mm的電擊杯中，然后冰浴10min，電擊儀設(shè)置參數(shù)為：2000V，25μF，200Ohm。電擊結(jié)束后，立即取1mL預(yù)冷的SGM17打入電擊杯中。混勻菌懸液，取出混勻的菌懸液至1.5mLEP管中，30度孵育2小時。最后將菌懸液涂布于含有抗生素的MRS（含有0.5%(w/v)glucose,0.5Msucrose）培養(yǎng)皿上。EV71VP1基因在乳酸菌中的誘導(dǎo)表達將陽性重組菌及空質(zhì)粒對照菌pNZ8048/MG1361分別接種于50ug/mL氯霉素的MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜后，按照1:50的比例接種于5mL的新鮮的培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD600達到0.5。用1.5ng/mL的乳酸菌誘導(dǎo)劑（Nisin）誘導(dǎo)3h。終止培養(yǎng)后分別取1mL樣品，12000rpm/min,離心2min，用100ulPBS重懸菌體，加入200ul5mg/mL的溶菌酶，37℃放置30min，之后12000rpm離心5min，棄去上清，加入蛋白上洋緩沖液重懸沉淀，沸水煮沸10min，之后12000rpm離心10min，取上清液10ul跑SDS-PAGE，分析蛋白表達情況。表達產(chǎn)物的Westernblot鑒定跑完SDS-PAGE后，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，轉(zhuǎn)印時按照100v電壓，轉(zhuǎn)印1h，轉(zhuǎn)印結(jié)束后，使用EV71鼠多抗作為1抗血清，HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，使用DAB顯色試劑盒顯色，進行蛋白印跡分析。免疫接種將誘導(dǎo)后的EV71VP1重組乳酸菌在顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)為1×109個/mL，然后用PBS稀釋10倍，每只小鼠飼喂稀釋后的菌液5mL，實驗組、空質(zhì)粒重組菌組、PBS組各飼喂6只小鼠，間隔1周飼喂1次，共飼喂4次，最后一次采血分析抗體產(chǎn)生情況及中和病毒情況。同時通過肌肉免疫的方式免疫EV71野毒。抗體產(chǎn)生情況分析（1）ELISA檢測將實驗組的所有小鼠摘除研究取血，將采取到的血液經(jīng)過3000rpm，離心10min，取上清，獲得血清，將血清經(jīng)過56℃滅活30min，之后分裝保存于-80℃。頭一天用碳酸緩沖液包被純化后的EV71病毒，放于4℃過夜，之后使用5%的脫脂奶粉于37℃封閉2h，棄去封閉液，使用滅活后的血清第一排按照1:100稀釋，之后每排按照10倍梯度稀釋，直到血清的稀釋倍數(shù)為100萬倍為止，最后一排做陰性對照，37℃反應(yīng)1h，之后使用PBST洗5遍，拍干，每孔加入1:8000的二抗，37℃反應(yīng)30min，之后使用PBST洗5遍，每孔加入50ul的A液，之后在加50ul的B液，顯色后加2M的硫酸終止反應(yīng)。用同樣包被的板子檢測空質(zhì)粒重組菌及免疫PBS組的小鼠血清，經(jīng)過10倍稀釋后飼喂小鼠28d后的OD450的吸光值；A組為pNZ8048-EV71VP1/MG1361重組菌組，B組為PBS組，組為pNZ8048/MG1361重組菌結(jié)果見以下表1：ABC2.80.040.06（2）血清中和實驗將滅活后的血清按照1:4的稀釋倍數(shù)加到96孔細胞板的第一排，之后按照2倍的梯度稀釋，直到稀釋到1024倍，設(shè)最后一排為陰性對照，空質(zhì)粒重組菌的血清按照同樣的方法作為對照，之后每孔加50ul的100TCID50的病毒液，37℃，5%二氧化碳中培養(yǎng)1周，觀察血清的中和情況，結(jié)果見以下表2：將具有中和作用的血清與EV71混合，血清濃度按照細胞中和實驗的最高稀釋倍數(shù)添加，使病毒的含量為1000TCID50/10ul，之后腹腔注射到24h內(nèi)出生的乳鼠體內(nèi)，觀察2h，觀察乳鼠的生存情況。上述實施例為本發(fā)明較佳的實現(xiàn)方案，除此之外，本發(fā)明還可以其它方式實現(xiàn)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3