本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585c及其T細(xì)胞表位肽在結(jié)核病檢測(cè)試劑、疫苗和藥物制備中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病，調(diào)查結(jié)果顯示全世界有三分之一的人口處于潛伏感染，且有5％～10％在未來(lái)的生活中將可能發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。自1993年世界衛(wèi)生組織宣布結(jié)核病成為全球危機(jī)后，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，據(jù)WHO報(bào)告，每年新增結(jié)核病人約800萬(wàn)，每年約有200～300萬(wàn)人死于結(jié)核病。我國(guó)在22個(gè)結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家中位居第2位，全國(guó)第5次流行病學(xué)抽樣檢查結(jié)果顯示：全國(guó)130萬(wàn)人發(fā)病，占全球發(fā)病率的14.3％，我國(guó)也是全球27個(gè)耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，耐多藥結(jié)核病患病人數(shù)占據(jù)全球第一。每個(gè)未經(jīng)治療的活動(dòng)性肺結(jié)核病人能夠傳染10～15人。結(jié)核病已經(jīng)成為全球重要的衛(wèi)生問(wèn)題，需引起人們的高度重視。結(jié)核的早期診斷和預(yù)防治療對(duì)結(jié)核病的控制至關(guān)重要，研究者應(yīng)致力于開(kāi)發(fā)高效、敏感、特異的結(jié)核診斷檢測(cè)方法。臨床上肺結(jié)核癥狀表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、高熱等，容易與慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、肺炎、感冒等混淆，需要借助影像學(xué)、細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)等診斷方法方可確診。臨床上常用的是細(xì)菌學(xué)方法痰涂片鏡檢和痰培養(yǎng)，痰涂片鏡檢是世界范圍內(nèi)結(jié)核病檢查中使用最廣泛的技術(shù)，由于此法設(shè)備簡(jiǎn)便，適合在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的地區(qū)使用。但是由于對(duì)樣本中的菌含量要求高，因此該方法靈敏度不高，導(dǎo)致大量涂陰患者不被發(fā)現(xiàn)從而轉(zhuǎn)陽(yáng)，且涂陰患者具有傳染性，不容忽視，該方法無(wú)種特異性，靈敏度差，受痰液標(biāo)本和病情的影響。痰培養(yǎng)作為結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是存在培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，現(xiàn)在已有BACTECMGIT960系統(tǒng)等快速培養(yǎng)系統(tǒng)可在2周內(nèi)分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌，但由于其配制的培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)添加劑、雜菌抑制劑價(jià)格昂貴，無(wú)法在發(fā)展中國(guó)家廣泛推廣，并且快速培養(yǎng)與改良L-J培養(yǎng)相比污染率顯著增高，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。常用的用于人群篩查的檢測(cè)方法是皮膚結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)，使用的是結(jié)核菌純蛋白衍生物(PPD)，由于PPD中含有許多分枝桿菌種類(致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD診斷結(jié)核病的特異性較差，不能有效區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與卡介苗接種，結(jié)核的影像學(xué)檢查如常規(guī)的X線檢查、CT檢查、MRI檢查、超聲檢查等價(jià)格昂貴，且對(duì)身體造成一定傷害，特異性低，不適合用于常規(guī)的檢查診斷。目前以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法T-SPOT是利用IFN-γ特異性抗體捕獲經(jīng)結(jié)核抗原刺激的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后產(chǎn)生的IFN-γ，并以酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)顯色的方式表現(xiàn)出來(lái)，從斑點(diǎn)的數(shù)量來(lái)確定細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況，從單細(xì)胞水平評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能。以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外γ干擾素的檢測(cè)被用于結(jié)核病的輔助診斷，該檢測(cè)方法不僅能篩選出活動(dòng)性結(jié)核病人，同時(shí)也能檢測(cè)出潛伏期病人，從而能更好的預(yù)防和控制潛伏期結(jié)核，目前已有以結(jié)核分枝桿菌基因組RD1區(qū)編碼的結(jié)核特異性抗原ESAT-6和CFP-10的全蛋白或多肽為刺激物的商品化的IGRA檢測(cè)試劑盒，如QuantiFERON-TBGoldtest和T-SPOT，均呈現(xiàn)較高的靈敏性和特異性。而Rv0585c(GI:15607725)是H37Rv基因組上的基因，基因全長(zhǎng)2388bp，編碼795個(gè)氨基酸，是一種保守膜蛋白，目前功能未知，可能是一種結(jié)核毒力相關(guān)蛋白，Rv0585c在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中存在，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)Rv0585c蛋白存在較多的T細(xì)胞表位，具有潛在的診斷效能。本發(fā)明建立在反向疫苗學(xué)的基礎(chǔ)上，利用計(jì)算機(jī)篩選出結(jié)核分枝桿菌可能的免疫原性抗原庫(kù)，然后利用生物信息學(xué)軟件TEpredict和IEDB預(yù)測(cè)結(jié)核抗原MHC-I類T細(xì)胞表位，通過(guò)固態(tài)合成法合成這些多肽，先利用人群免疫篩選試驗(yàn)對(duì)結(jié)核新抗原進(jìn)行篩選，篩選出免疫優(yōu)勢(shì)抗原之后，再通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其免疫原性進(jìn)行驗(yàn)證，最后經(jīng)驗(yàn)證得到的免疫優(yōu)勢(shì)抗原可一方面用于結(jié)核診斷，另一方面可用于卡介苗的改造。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585c的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585cT細(xì)胞表位肽及其應(yīng)用。本發(fā)明基于以下構(gòu)思：Rv0585c是結(jié)核分枝桿菌上的保守膜蛋白，主要參與細(xì)胞壁的加工過(guò)程，是可能的結(jié)核毒力相關(guān)蛋白。本發(fā)明基于T細(xì)胞IFN-γ釋放技術(shù)，利用生物信息學(xué)軟件TEpredict和IEDB對(duì)Rv0585c編碼基因上T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用固態(tài)合成法合成表位多肽，再通過(guò)T-SPOT法對(duì)結(jié)核病人、肺部其他疾病患者、健康人體內(nèi)的特異性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，從而評(píng)價(jià)該抗原用于結(jié)核檢測(cè)的靈敏度和特異性，同時(shí)通過(guò)人群免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選出Rv2201抗原蛋白上的免疫優(yōu)勢(shì)表位肽，再通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，確定免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位肽的免疫原性。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585c在制備結(jié)核檢測(cè)與診斷試劑中的應(yīng)用；其中，所述抗原蛋白R(shí)v0585c的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585cT細(xì)胞表位肽，所述表位肽選自P24、P26、P31，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:1-3所示。本發(fā)明還提供由所述T細(xì)胞表位肽衍生的表位肽或其類似物。本發(fā)明還提供編碼所述表位肽的DNA分子。本發(fā)明還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的表達(dá)盒及表達(dá)載體。本發(fā)明還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明還提供含有編碼所述表位肽的DNA分子的重組菌及其表達(dá)純化的重組蛋白。本發(fā)明還提供所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子、所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或所述重組菌及其表達(dá)純化的重組蛋白在制備結(jié)核檢測(cè)試劑、疫苗和藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種結(jié)核診斷試劑，所述診斷試劑中含有結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585c，或編碼所述抗原蛋白R(shí)v0585c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產(chǎn)生的重組蛋白；和/或，所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子和/或所述重組蛋白。本發(fā)明還提供含有上述診斷試劑的結(jié)核T-SPOT檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒還包括以下材料或試劑：①一抗：抗人或動(dòng)物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。②酶標(biāo)試劑：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人或動(dòng)物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標(biāo)準(zhǔn)品：培養(yǎng)板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應(yīng)板，陽(yáng)性對(duì)照孔中含有結(jié)核非特異性刺激抗原(如PHA等)，陰性對(duì)照孔含有PBS或基底液。④其他T-SPOT檢測(cè)所需的試劑及耗材。優(yōu)選地，一抗固定在上述微孔反應(yīng)板上。本發(fā)明是基于雙抗體夾心原理，采用T-SPOT法檢測(cè)抗原，實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：PVDF膜上包被的一抗作為捕獲抗體能夠結(jié)合細(xì)胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶標(biāo)二抗捕獲、顯色。兩種抗體為識(shí)別IFN-γ不同抗原表位的單克隆抗體。本發(fā)明還提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585c和/或所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子、所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或所述重組菌及其表達(dá)純化的重組蛋白在制備結(jié)核疫苗和抗結(jié)核藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種結(jié)核疫苗，其有效成分為結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585c，或編碼所述抗原蛋白R(shí)v0585c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產(chǎn)生的重組蛋白；和/或，所述表位肽、編碼所述表位肽的DNA分子和/或所述重組蛋白。本發(fā)明還提供一種抗結(jié)核藥物，其有效成分包括以結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585c和/或所述表位肽作為免疫原，輔以佐劑免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備的多克隆抗體，或者以結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585c和/或所述表位肽作為免疫原，輔以佐劑免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用雜交瘤技術(shù)或DNA重組技術(shù)，制備的識(shí)別所述結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585c及其T細(xì)胞表位肽抗原的人源化單克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585c和/或所述表位肽及其衍生的表位肽或其類似物在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染引起的特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。其是將人或動(dòng)物的淋巴細(xì)胞經(jīng)所述表位肽及其衍生的表位肽或其類似物抗原或它們的組合物刺激后，檢測(cè)T細(xì)胞或B細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。其中，結(jié)核特異性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包括：γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等。B細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包括抗體。針對(duì)結(jié)核特異性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫膠體金試驗(yàn)、細(xì)胞因子內(nèi)染色和T細(xì)胞增殖試驗(yàn)等。B細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。所述淋巴細(xì)胞來(lái)自人或動(dòng)物的外周血、靜脈血、腦脊液、胸腔積液或胸水等。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：(一)本發(fā)明利用結(jié)核分枝桿菌Rv0585c蛋白抗原及其T細(xì)胞表位肽作為刺激物用于結(jié)核分枝桿菌感染引起的特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫反應(yīng)，與以往采用完全抗原相比，能夠降低由于抗原不純?cè)斐傻募訇?yáng)性。(二)研究證明，本發(fā)明提供的抗原表位均能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此當(dāng)使用上述表位作為刺激物進(jìn)行體外T細(xì)胞γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)時(shí)，靈敏度顯著提高。(三)采用固相合成的方法合成表位多肽，有利于質(zhì)量控制，且成本較低，純度高，適合大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。(四)本發(fā)明的抗原蛋白R(shí)v0585c是結(jié)核毒力相關(guān)因子，T細(xì)胞反應(yīng)的高強(qiáng)度顯示該抗原具有較強(qiáng)的免疫原性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了Rv0585c及其T細(xì)胞表位具有良好的免疫原性，因此可用作新型結(jié)核疫苗候選抗原。(五)本發(fā)明的檢測(cè)試劑可廣泛用于結(jié)核病的輔助診斷、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域。附圖說(shuō)明圖1顯示本發(fā)明實(shí)施例5中抗原蛋白R(shí)v0585c的T細(xì)胞表位肽P24、p26可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ(A)、IL-4(B)和IL-10(C)。實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例1結(jié)核分枝桿菌抗原基因Rv0585c的克隆及蛋白的表達(dá)純化Rv0585c(GI:15607725)是結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組編碼的保守膜蛋白，含795個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。根據(jù)其編碼基因序列(SEQIDNO:5)，設(shè)計(jì)引物，利用原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌)表達(dá)并純化獲得抗原蛋白R(shí)v0585c。實(shí)施例2結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585cT細(xì)胞表位肽的合成基于T細(xì)胞IFN-γ釋放技術(shù)，利用生物信息學(xué)軟件TEpredict和IEDB對(duì)Rv0585c編碼基因上T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用固態(tài)合成法合成表位多肽，再通過(guò)T-SPOT法對(duì)結(jié)核病人、肺部其他疾病患者、健康人體內(nèi)的特異性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，從而評(píng)價(jià)該抗原用于結(jié)核檢測(cè)的靈敏度和特異性。本實(shí)施例提供的結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585cT細(xì)胞表位肽選自P24、P26、P31，其氨基酸序列分別如SEQIDNO:1-3所示。實(shí)施例3結(jié)核T-SPOT檢測(cè)試劑盒的制備所述試劑盒基本組成如下：①實(shí)施例1制備的蛋白抗原Rv0585c和/或?qū)嵤├?合成的表位肽抗原：所述表位肽選自P24、P26、P31中的至少一種。②一抗：抗人或動(dòng)物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。酶標(biāo)試劑：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人或動(dòng)物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標(biāo)準(zhǔn)品：培養(yǎng)板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應(yīng)板，陽(yáng)性對(duì)照孔中含有結(jié)核非特異性刺激抗原(如PHA等)，陰性對(duì)照孔含有PBS或基底液。④其他T-SPOT檢測(cè)所需的試劑及耗材。將一抗固定在上述微孔反應(yīng)板上。該試劑盒是基于雙抗體夾心原理設(shè)計(jì)的，采用T-SPOT法檢測(cè)抗原，實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：PVDF膜上包被的一抗作為捕獲抗體能夠結(jié)合細(xì)胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶標(biāo)二抗捕獲、顯色。兩種抗體為識(shí)別IFN-γ不同抗原表位的單克隆抗體。實(shí)施例4抗原表位肽用于結(jié)核感染的臨床檢測(cè)1.外周血淋巴細(xì)胞的分離1.1受試對(duì)象①志愿者病例的篩選標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)癥狀、體征及胸部影像學(xué)檢查診斷為肺結(jié)核的，且痰培養(yǎng)為陽(yáng)性的肺結(jié)核患者。②肺部疾病患者的篩選標(biāo)準(zhǔn)：痰培養(yǎng)和痰涂片為陰性的肺部其他疾病，如塵肺、慢阻肺等肺部疾病患者。③健康志愿者的篩選標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)結(jié)核臨床癥狀、無(wú)結(jié)核病人密切接觸史、無(wú)其他疾病或感染。入選的結(jié)核病患者和志愿者年齡在15-80歲之間，從到結(jié)核病室就診的連續(xù)時(shí)間樣本中隨機(jī)選取。共采集了50例結(jié)核病志愿者、43例肺部疾病患者及55例健康志愿者血液樣本，采血時(shí)使用無(wú)內(nèi)毒素的肝素抗凝真空采血管采集外周靜脈血，每名志愿者采血約5ml～10ml。1)樣品于4小時(shí)內(nèi)用Ficoll-Hypaque分離液分離PBMCs。2)先將全血用RPMI-1640培養(yǎng)基1:1稀釋混勻，在離心管中加入一定體積的分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方，保持兩液面界面清晰，分離液、抗凝未經(jīng)稀釋全血、RPMI1640培養(yǎng)基體積為1:1:1，室溫(18～26℃)，800g離心20分鐘。3)離心結(jié)束后，管底是紅細(xì)胞，中間層是分離液，最上層是血漿層，血漿層與分離液層之間是白色云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)層。用吸管吸取白色云霧狀細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移至15ml無(wú)菌離心管中，加入RPMI1640培養(yǎng)基至10ml，室溫下800g離心10分鐘。4)棄去上清，重懸后加入7mlRPMI1640培養(yǎng)基，700g離心10分鐘。5)棄去上清加0.5mlAIM-V培養(yǎng)基重懸沉淀。6)利用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，用AIM-V培養(yǎng)基配制500μl細(xì)胞濃度為2.5×106/ml的細(xì)胞懸液。2.抗原表位肽的準(zhǔn)備將實(shí)施例2中固相合成法合成的抗原表位肽用DMSO溶解，各條表位肽分別用含10％胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋至一定濃度后使用。3.T-SPOT檢測(cè)抗原表位肽特異性T細(xì)胞采用實(shí)施例3的試劑盒，向預(yù)包被一抗的微孔板中加入以下試劑，每個(gè)病人分別設(shè)6個(gè)檢測(cè)孔：陽(yáng)性對(duì)照孔(加100μl濃度為15μg/ml的植物血凝素PHA作為陽(yáng)性刺激物)、陰性對(duì)照孔(加100μlPBS作為陰性對(duì)照)、3個(gè)檢測(cè)孔(3個(gè)孔中分別加入100μl濃度為20μg/ml的4條表位肽P24、P26、P31中的一條)，每個(gè)孔中加入100μl上述稀釋好的PBMC，使每孔中PBMC的數(shù)量達(dá)25萬(wàn)個(gè)，將抗原與PBMC細(xì)胞置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時(shí)。4.洗板及結(jié)果判定洗去PBMC細(xì)胞和抗原刺激物，加100μl一抗室溫下孵育1小時(shí)，用PBS洗5遍，加二抗室溫孵育1小時(shí)，再用PBS洗5遍，加底物避光顯色7分鐘后，用純化水終止顯色，將培養(yǎng)板放在通風(fēng)口處晾干觀察板上的斑點(diǎn)數(shù)。結(jié)果判定(表1)：空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)＝N、檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)＝T、陽(yáng)性質(zhì)控孔斑點(diǎn)數(shù)＝P。表1T-SPOT結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)其中三條表位肽檢測(cè)50例結(jié)核病人、43例肺部其他疾病患者和55個(gè)健康人的結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。表2Rv0585c蛋白抗原三條表位肽檢測(cè)靈敏度和特異度統(tǒng)計(jì)表位肽靈敏度(％)特異度(％)P2414100P2612100P31697.963條多肽聯(lián)合2297.96檢測(cè)靈敏度＝(結(jié)核病患者檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)/結(jié)核病患者總數(shù))×100％檢測(cè)特異度＝1-(肺結(jié)核病患者檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)+健康志愿者檢測(cè)陽(yáng)性數(shù))/(肺部疾病患者總數(shù)+健康志愿者總數(shù))按照單條多肽檢測(cè)出陽(yáng)性即為陽(yáng)性的原則，經(jīng)計(jì)算得出Rv0585c蛋白抗原P24、P26、P31三條表位肽聯(lián)合檢測(cè)出結(jié)核病人的靈敏度為22％，特異度為97.96％。實(shí)施例5Rv0585cT細(xì)胞表位肽的免疫原性檢測(cè)1、為了驗(yàn)證Rv0585cT細(xì)胞表位肽的免疫原性，考慮到裸肽易降解且不易被抗原遞呈細(xì)胞識(shí)別的特性，將合成的裸肽與血藍(lán)蛋白(KLH)進(jìn)行偶聯(lián)，將偶聯(lián)得到的T細(xì)胞表位肽進(jìn)行免疫BALB/c小鼠。2、免疫小鼠篩選6周齡的雌性BALB/c小鼠48只，分為8組，PBS陰性對(duì)照組(PBS)，佐劑對(duì)照組血藍(lán)蛋白(KLH)對(duì)照組，結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Ag85B20μg低劑量組(Ag85B-L)、Ag85B50μg高劑量組(Ag85B-H)、Rv0585cP24多肽50μg低劑量組(P24-L)、Rv0585cP24多肽100μg高劑量組(P24-H)、Rv0585cP26多肽50μg低劑量組(P26-L)、Rv0585cP26多肽100μg高劑量組(P26-H)。將每組抗原與相應(yīng)的佐劑--多聚肌苷酸poly(I:C)50μl和雙十八烷基二甲基溴化銨(DDA)100μl充分乳化后采用皮下接種的方式免疫小鼠，每隔2周免疫一次，共免疫三次，末次免疫4周后進(jìn)行檢測(cè)。3、將上述免疫的小鼠處死后，在75％酒精中浸泡5分鐘，將小鼠固定在超凈臺(tái)中的泡沫板上，剪開(kāi)腹膜，分離出脾臟，將其置于裝有1640的平皿中。4、在200目的尼龍網(wǎng)上，用注射器內(nèi)芯輕輕研磨小鼠脾臟，將研磨的細(xì)胞通過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾。1000r/min離心5分鐘棄上清，收集細(xì)胞沉淀。5、將細(xì)胞沉淀輕輕振蕩使其松動(dòng)，按照2ml/只加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后，置于37℃溫箱中孵育10分鐘后，加入相當(dāng)于紅細(xì)胞裂解液2倍體積的1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)，1000r/min離心5分鐘棄上清，收集脾細(xì)胞沉淀。6、用1640培養(yǎng)基2ml/只重懸脾細(xì)胞，1000r/min離心5分鐘棄上清，收集脾細(xì)胞沉淀。用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞濃度。7、用含有10％FBS的1640培養(yǎng)基稀釋脾細(xì)胞，使其濃度為2×106/ml。每組取500μl脾細(xì)胞液置于24孔培養(yǎng)板中，PBS組和DP佐劑組脾細(xì)胞分別用Ag85B蛋白(5μg/ml)、Rv0585c的T細(xì)胞表位肽P24、P26(5μg/ml未偶聯(lián)KLH蛋白的裸肽)與脾細(xì)胞共同孵育，Ag85B-L和Ag85B-H組分別用500μl的Ag85B蛋白(5μg/ml)與脾細(xì)胞共同孵育，P24-L和P24-H組均用500μlP24多肽(5μg/ml未偶聯(lián)KLH蛋白的裸肽)與脾細(xì)胞共同孵育，P26-L和P26-H組均用500μl的P26多肽(5μg/ml未偶聯(lián)KLH蛋白的裸肽)與脾細(xì)胞共同孵育，每組加入500μl的無(wú)菌PBS和500μl植物血凝素(PHA)(5μg/ml)作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)檢測(cè)孔均做2個(gè)重復(fù)。將脾細(xì)胞與相應(yīng)的刺激物在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)后，收集細(xì)胞上清，采用ELISA法檢測(cè)上清中的IFN-γ、IL-4、IL-10。8、將IFN-γ單抗、IL-4單抗等用碳酸鹽緩沖液(pH＝9.6)，L-10單抗用碳酸鹽緩沖液(pH＝6.5)按照1:500倍稀釋后，按100μl/孔加入到96微孔板中，4℃包被過(guò)夜。9、用PBTS洗滌3遍后，拍干，加入含10％FBS的PBS液室溫封閉1小時(shí)。10、用PBST洗滌5遍后，將IFN-γ、IL-4、IL-10的標(biāo)準(zhǔn)品按照對(duì)應(yīng)的比例稀釋成相應(yīng)濃度，分別加入到各ELISA板上，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。其余加入100μl待檢測(cè)的細(xì)胞上清，室溫孵育2小時(shí)。11、用PBST稀釋5遍后，分別加入100μlIFN-γ、IL-4、IL-10各自的檢測(cè)抗體+HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。12、用PBST洗滌7遍后，加入TMB顯色液100μl，室溫孵育30分鐘后，加入終止液50μl終止反應(yīng)。13、酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm的吸光值，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)570nm的吸光值作為對(duì)照。14、結(jié)果分析：根據(jù)細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將檢測(cè)孔的OD值代入公式，計(jì)算每組小鼠各種細(xì)胞因子的終濃度。結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照PBS組和陰性對(duì)照KLH組相比，Rv0585c的T細(xì)胞表位肽P24能刺激小鼠產(chǎn)生較高濃度的IFN-γ(P＜0.05)、IL-4(P＜0.001)，且P24高劑量組產(chǎn)生IFN-γ(P＜0.001)、IL-4(P＜0.001)的量高于低劑量組。Rv0585c的T細(xì)胞表位肽P26能刺激小鼠產(chǎn)生高濃度的IFN-γ(P＜0.05)、IL-4(P＜0.001)、IL-10(P＜0.001)，且P24高劑量組產(chǎn)生IFN-γ(P＜0.001)、IL-10(P＜0.001)的量高于低劑量組。IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子，可以通過(guò)激活巨噬細(xì)胞從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除。IL-4和IL-10是Th2型細(xì)胞因子，促進(jìn)結(jié)核感染過(guò)程中的抗體產(chǎn)生。在結(jié)核感染中起到免疫調(diào)節(jié)作用。采用上述方法分別對(duì)Rv0585cT細(xì)胞表位肽P24、P26進(jìn)行細(xì)胞免疫原性檢測(cè)，結(jié)果表明，P24、P26也能夠刺激小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子?？梢?jiàn)，結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v0585c的三條T細(xì)胞表位肽，均能刺激結(jié)核病人產(chǎn)生IFN-γ，能有效區(qū)分結(jié)核病人和肺部其他疾患病人和健康人群，且三條多肽聯(lián)合診斷效率提高。Rv0585c及其T細(xì)胞表位肽均可作為一種檢測(cè)試劑用于結(jié)核病的診斷。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Rv0585c的T細(xì)胞表位肽P24和P26均能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ(P＜0.05)、IL-4(P＜0.001)、IL-10(P＜0.001)由此證明Rv0585c及其T細(xì)胞表位肽具有良好的免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，是一種免疫優(yōu)勢(shì)抗原，可以考慮用作結(jié)核分枝桿菌疫苗的構(gòu)建和制備。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3