本發(fā)明屬于植物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一種水稻3號(hào)染色體上與結(jié)實(shí)率相連鎖的SSR引物對(duì)及其在選育水稻品種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

SSR標(biāo)記又稱(chēng)為simple sequence repeat，是目前最常用的微衛(wèi)星標(biāo)記之一。核心結(jié)構(gòu)是由2-6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸序列，通常都是保守性較強(qiáng)的單一序列，其兩側(cè)是相對(duì)保守和特異的單拷貝序列。根據(jù)特異保守的序列，可以人工合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)重復(fù)單元在數(shù)量上的變異，個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物在長(zhǎng)度上的變化就產(chǎn)生長(zhǎng)度的多態(tài)性，每一擴(kuò)增位點(diǎn)就代表了這一位點(diǎn)的一對(duì)等位基因。因此，PCR產(chǎn)物產(chǎn)生了長(zhǎng)度的多態(tài)性。SSR標(biāo)記建立在PCR技術(shù)上，由于具有共顯性、含量豐富、多態(tài)性高的特點(diǎn)，因此廣泛運(yùn)用在動(dòng)植物的遺傳育種研究上。

水稻結(jié)實(shí)率是影響產(chǎn)量的重要因子，利用SSR和各類(lèi)標(biāo)記，群體進(jìn)行水稻結(jié)實(shí)率的定位與克隆的工作一直方興未艾。陳慶全等利用低結(jié)實(shí)率的秈稻材料和高結(jié)實(shí)率的秈稻品種T226為親本構(gòu)建重組自交系，對(duì)重組自交系的結(jié)實(shí)率進(jìn)行基因型和環(huán)境互作分析、QTL定位分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)17個(gè)與結(jié)實(shí)率相關(guān)的QTL，其中大部分QTL均只在1個(gè)或2個(gè)特定的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，而位于第3染色體MRG5959-MRG2180區(qū)間的qSSR3-1,共在6個(gè)環(huán)境中一致檢測(cè)到,貢獻(xiàn)率分別在各環(huán)境中均為最大(15.6-35.7％)、其增效的等位基因來(lái)源于親本T226(陳慶全，2007)。周勇等利用染色體單片段代換系定位水稻結(jié)實(shí)率QTLs，以廣陸矮4號(hào)和Japonica的85個(gè)染色體單片段代換系為研究材料，通過(guò)單因素方差分析和多重比較，對(duì)與結(jié)實(shí)率相關(guān)的QTLs進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個(gè)結(jié)實(shí)率QTLs，分布于水稻12條染色體中的7條染色體上(周勇，2013)。高云等利用染色體單片段代換系定位水稻結(jié)實(shí)率QTL，以秈稻品種揚(yáng)稻6號(hào)為受體、粳稻品種Japonica為供體構(gòu)建的一套染色體片段代換系為材料，利用多元回歸分析方法，結(jié)合Bin圖譜，對(duì)代換系上的結(jié)實(shí)率QTL進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，14個(gè)控制水稻結(jié)實(shí)率性狀的QTL，分別位于3-11染色體。貢獻(xiàn)率最大的QTL為qSSR5.1，貢獻(xiàn)率為49.76％，被定位在第5染色體上731482bp區(qū)間內(nèi)(高云，2014)。

目前，國(guó)內(nèi)研究對(duì)結(jié)實(shí)率的研究集中在QTL定位和基因克隆方面，在分子標(biāo)記輔助選擇育種和對(duì)育種材料中結(jié)實(shí)率相關(guān)位點(diǎn)的檢測(cè)較少。

大量的水稻結(jié)實(shí)率的相關(guān)QTL定位為水稻高結(jié)實(shí)率的育種奠定了理論基礎(chǔ)，然而多數(shù)QTL是基于兩種結(jié)實(shí)率有顯著差異的材料組配群體進(jìn)行研究，在后代群體中鑒定獲得。僅僅停留在定位的階段。他們具有以下缺點(diǎn)：

(1)僅在兩個(gè)親本材料中具有多態(tài)性，篩選到的與結(jié)實(shí)率相關(guān)的SSR標(biāo)記在特定群體中有相關(guān)關(guān)系。

(2)定位群體中與結(jié)實(shí)率相關(guān)的SSR標(biāo)記，尚未在育種材料中進(jìn)行檢測(cè)，尚未見(jiàn)到結(jié)實(shí)率相關(guān)SSR引物對(duì)不同結(jié)實(shí)率的水稻種質(zhì)進(jìn)行鑒定和聯(lián)系。因此利用率并不高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決水稻育種中對(duì)育種材料結(jié)實(shí)率的早期檢測(cè)問(wèn)題，以及解決與結(jié)實(shí)率相關(guān)QTL的聚合問(wèn)題，本發(fā)明提供一種水稻3號(hào)染色體上與結(jié)實(shí)率相連鎖的SSR引物對(duì)，用于檢測(cè)育種材料中結(jié)實(shí)率相關(guān)的本QTL是否存在。能夠快速判斷植株是否攜帶高結(jié)實(shí)率基因。利用傳統(tǒng)技術(shù)判斷水稻結(jié)實(shí)率要等到結(jié)實(shí)后肉眼觀察，如果差異小，要等到種子成熟以后計(jì)算，周期較長(zhǎng)。利用分子標(biāo)記輔助選擇，可以直接在苗期判斷是否含有高結(jié)實(shí)率QTL，快速方便。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻3號(hào)染色體上與結(jié)實(shí)率相連鎖的SSR引物對(duì)，所述的引物對(duì)的上游引物為Seq ID NO.1所示的序列，所述引物對(duì)的下游引物為Seq ID NO.2所示的序列。

本發(fā)明還提供了所述的水稻3號(hào)染色體上與結(jié)實(shí)率相連鎖的SSR引物對(duì)用于篩選水稻是否攜帶高結(jié)實(shí)率基因的方法，包括步驟：以待檢測(cè)的水稻基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1所述的SSR引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與低結(jié)實(shí)率的Japonica的條帶進(jìn)行對(duì)比，從而鑒定材料中是否含有高結(jié)實(shí)率的相關(guān)基因。

本發(fā)明還提供了所述的水稻3號(hào)染色體上與結(jié)實(shí)率相連鎖的SSR引物對(duì)在水稻輔助育種中的用途。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下有益效果：

(1)本發(fā)明提供的水稻3號(hào)染色體上與結(jié)實(shí)率相連鎖的SSR引物對(duì)，是與結(jié)實(shí)率QTL相關(guān)的連鎖SSR標(biāo)記，能夠在36份核心種質(zhì)中較為準(zhǔn)確鑒定高結(jié)實(shí)率材料和低結(jié)實(shí)率材料的特異條帶。能夠在育種材料中進(jìn)行早期的結(jié)實(shí)率的預(yù)測(cè)和對(duì)是否含有與結(jié)實(shí)率相關(guān)基因的判斷?？梢钥焖勹b定育種材料是否含有結(jié)實(shí)率相關(guān)的QTL。成本低廉，鑒定簡(jiǎn)單，指向性明確。

(2)本發(fā)明提供的水稻3號(hào)染色體上與結(jié)實(shí)率相連鎖的SSR引物對(duì)與結(jié)實(shí)率高度相關(guān)，是一個(gè)與結(jié)實(shí)率相關(guān)的QTL，貢獻(xiàn)率為11.90％，是一個(gè)新的未報(bào)道過(guò)的與結(jié)實(shí)率相關(guān)的QTL。

(3)本發(fā)明提供的水稻3號(hào)染色體上與結(jié)實(shí)率相連鎖的SSR引物對(duì)在36份結(jié)實(shí)率不同的核心種質(zhì)中檢測(cè)，能夠有效檢測(cè)高結(jié)實(shí)率的特異條帶和低結(jié)實(shí)率的特異條帶，快速高效在水稻植株幼苗前期確定水稻材料是否含有結(jié)實(shí)率相關(guān)QTL或是否含有高結(jié)實(shí)率基因。因此，利用本發(fā)明，可以快速高效鑒定水稻育種材料是否含有結(jié)實(shí)率相關(guān)QTL。

附圖說(shuō)明

圖1為為本發(fā)明的水稻3號(hào)染色體上與結(jié)實(shí)率相連鎖的SSR引物對(duì)在36份核心水稻種質(zhì)中擴(kuò)增產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)條帶；

有關(guān)附圖標(biāo)記的說(shuō)明：

1-DOZIANCLOUA::IRGC 56877-1；2-STG 556011::IRGC 4059-1；3-VILLAGUAY P A::IRGC 117259-1；4-RATHAL::IRGC 31524-1；5-CANELLA DE FERRO；6-VARY MADINIKA 3566::GERVEX 8448-C1；7-SULTANI；8-KERITING TINGGI；9-KU 115；10-SUTHUWEE::IRGC 8915-1；11-ORYZICA SABANA 10::IRGC 117018-1；12-WAS 198-B-3-1-3::C1；13-ANAYANSI::IRGC 77474-1；14-IR 5::IRGC 10321-1；15-PERUM KARUPPAN::IRGC 15524-1；16-LAL BAGDAR::IRGC 77272-1；17-TOKAMBANY 669::GERVEX 8406-C1；18-SALUMPIKIT::IRTP 4777-C1；19-E 5168::IRGC 68021-1；20-Japonica；21-TSIPALA FOTSY::IRGC 69973-1；22-YE TI ZHAN::IRGC 68296-1；23-PICONEGRO::IRGC 117022-1；24-NCS 130::IRGC 51879-1；25-YAKADA::IRGC 51096-1；26-GBUAPU 1::IRGC 63265-1；27-MANDRIRAVINA::IRGC 69960-1；28-BAKUNG(H)::IRGC 60220-1；29-ZALCHA::IRGC 62190-1；30-PAWHTUN::IRGC 33562-1；31-ATHKANDIRAM::IRGC 36507-1；32-PURBIA(KALANSAR)::IRGC 59189-1；33-SUDUWEE::IRGC 8972-1；34-IR 31917-45-3-2::IRGC 78132-1；35-PEH-KUH-TSAO-TU；36-XI NUO ZAO::IRGC 68279-1。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和本質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

以下實(shí)施例中使用的儀器、試劑、試劑盒均可由市售得到；RM523為實(shí)施例中所述分子標(biāo)記。

實(shí)施例1：引物篩選

SSR引物下載于www.genomene.org；RM523 SSR引物序列如表1所示。表6中SSR的序列本身來(lái)自于公開(kāi)的網(wǎng)絡(luò)資源。

表1 RM523序列

實(shí)施例2：CTAB法提取水稻的總DNA，步驟如下：

(1)每一材料稱(chēng)取0.4-0.5g的新鮮葉片，在研缽中加入液氮迅速研磨粉碎，然后轉(zhuǎn)入2.0mL的無(wú)菌離心管中；干材料則在此之前先用粉碎器粉碎，并取粉末；

(2)每管加入預(yù)熱65℃的CTAB提取緩沖液(pH8.0)700μL，65℃水浴45min，每隔5min取出搖勻1次；

(3)加入700μL氯仿/異戊醇(24:1)輕柔混搖8min，然后12000r/min離心10min；

(4)取上清液轉(zhuǎn)入另一1.5mL的無(wú)菌離心管中，加入600μL預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，置于-20℃冰箱冷凍30min以上；

(5)將離心管以12000r/min離心10min，取沉淀；

(6)無(wú)水乙醇漂洗1次，離心后，小心去掉乙醇；

(7)晾干或風(fēng)干后加入滅菌水溶解，使終濃度達(dá)到20ng/μL，備用。

表2 CTAB提取液(1000ml)的配方pH＝8.0

表3 PCR反應(yīng)體系

然后采用東勝創(chuàng)新公司的ETC-811PCR擴(kuò)增儀，15μLPCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

預(yù)變性，95℃，5分鐘；

變性，95℃，40秒；

退火，55℃，30秒；

延伸，72℃，50秒；

重復(fù)2-4步驟，35個(gè)循環(huán)；

72℃延伸10分鐘，產(chǎn)物4℃保存。

PCR產(chǎn)物加2％溴酚藍(lán)3μL，95℃變性5分鐘，8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，參照Panaud等(1996)銀染和顯色方法改良的快速染顯技術(shù)進(jìn)行染色和讀帶，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小記錄標(biāo)記。

8％丙烯酰胺變性膠溶液由40％的丙烯酰胺母液(4℃保存)配置而來(lái)，配方如下表4、表5和表6。

表4 40％丙烯酰胺母液

表5 5×TBE緩沖液

表6 8％丙烯酰胺變性溶液

電泳步驟：

加入1×TBE電泳緩沖液700mL，插入48孔梳子，點(diǎn)樣1μL，恒功率80W，電泳45min。

染色方法(快速法)：

擴(kuò)增產(chǎn)物用8％聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離后，染色方法和步驟如下：

染色8-12min(1200mL染液中含硝酸銀1.5g，酒精100mL)；

去離子水迅速漂洗5-10秒；

顯影10min(1300mL顯液中含氫氧化鈉11g，37％的甲醛6mL)；

去離子水漂洗3-5min后取出晾干。

表7 36份核心種質(zhì)信息與結(jié)實(shí)率

如表7所示，利用SSR引物對(duì)結(jié)實(shí)率相關(guān)的QTL進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到一個(gè)與結(jié)實(shí)率高度相關(guān)的QTL位于3號(hào)染色體上，相關(guān)的SSR引物為RM523，該QTL貢獻(xiàn)率為11.90％。對(duì)36份均來(lái)自國(guó)家種質(zhì)庫(kù)的水稻品種按實(shí)例中的方法進(jìn)行水稻結(jié)實(shí)率鑒定，并進(jìn)行SSR標(biāo)記分析。結(jié)果分析，核心種質(zhì)的基因型和Japonica一樣的記為A，基因型與高結(jié)實(shí)率親本一樣的記為B。結(jié)實(shí)率在95％以上的品種有19份，其中18份為高結(jié)實(shí)率的帶型，占全部種質(zhì)的94.73％，結(jié)實(shí)率在80％以下的品種有15份，其中11份為Japonica帶型(參照?qǐng)D1)，占全部種質(zhì)的73.33％。

綜上所述，本發(fā)明的水稻3號(hào)染色體上與結(jié)實(shí)率相連鎖的SSR引物對(duì)RM523可以較明顯地區(qū)分同一環(huán)境條件下結(jié)實(shí)率高低的品種。

前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說(shuō)明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開(kāi)的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書(shū)及其等同形式所限定。