本發(fā)明涉及一種microRNA標志物組及其在制備評價乳腺癌化療敏感性試劑盒中的應用，屬于基因檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10％，在婦女惡性腫瘤發(fā)病中僅次于子宮癌，已成為威脅婦女健康的主要因素，而且有發(fā)病率逐漸上升及年輕化的趨勢，成為嚴重威脅女性健康的重要殺手之一。近幾年來，乳腺癌的新輔助化療越來越廣泛地應用于臨床，但是由于腫瘤的高度異質(zhì)性，組織學類型、TNM分期均相同的腫瘤對同一治療方案的療效并不一致。有效的化療能夠降低腫瘤分期、提高手術(shù)切除率、消滅微小轉(zhuǎn)移灶減少遠處轉(zhuǎn)移。如果化療效果不佳，甚至化療期間腫瘤進展，不僅浪費了財力，也可能會使患者失去最佳治療機會，造成嚴重的后果，所以新輔助化療效果的預測顯得尤為重要。使用生物分子標志物指導乳腺癌化療一直受到人們的關(guān)注。已有研究顯示MDR1、BCRP、MRP等耐藥相關(guān)基因過表達的患者容易產(chǎn)生化療耐藥性。但是單一或少數(shù)幾個指標用于指導腫瘤化療的偏差較大。近年來，應用基因芯片檢測化療前腫瘤標本來預測腫瘤的化療效果逐漸受到研究人員的關(guān)注。有研究使用基因芯片顯示乳腺癌標本中92個基因的表達有助于預測初次化療的反應(Lancet.2003；362:362-9)。miRNA芯片是低密度芯片，可同時檢測一個標本中幾百至幾千種人類miRNA的表達，盡管其檢測量遠低于基因芯片(mRNA芯片、cDNA芯片)，但有趣的是，miRNA芯片在預測患者的預后、確定腫瘤分類或來源方面卻更準確(參見LancetOncol.2010；11:136-46.和JAMA.2008；299:425-36.)。因此結(jié)合miRNA芯片所示的表達情況，構(gòu)建乳腺癌耐藥miRNA表達譜，在預測腫瘤化療反應方面具有重要的臨床指導和應用價值。miRNA(micoRNA，微小RNA)是一類廣泛存在的小單鏈RNA，長度為18-25個核苷酸。它由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，不翻譯為蛋白質(zhì)，是一類能夠發(fā)揮調(diào)控作用的非編碼基因。miRNA通過與靶基因mRNA的3’-UTR區(qū)部分互補而抑制基因表達。某些情況下，miRNA結(jié)合形成的dsRNA可觸發(fā)類似RNA干擾的機制降解mRNA；或者，并不降解靶基因mRNA而是阻斷其蛋白質(zhì)翻譯，如此，負向調(diào)控靶基因的表達。隨著miRNA研究的不斷深入，近年來有很多涉及miRNA參與調(diào)控腫瘤化療耐藥的相關(guān)研究，某些在瘤組織中表達異常的miRNA被證實與化療耐藥或提高藥物敏感性相關(guān)。例如Zhu等發(fā)現(xiàn)miR-27和miR-451能夠通過上調(diào)乳腺癌細胞中耐藥基因MDR-1的表達，從而降低阿霉素對乳腺癌細胞的生長抑制作用。而miR-30c可通過調(diào)控YWHAZ增強乳腺癌細胞MCF-7/ADR對阿霉素的敏感性。目前，雖然miRNA在腫瘤耐藥方面已有部分研究，但到目前為止，miRNA表達譜在預測乳腺癌化療耐藥性的應用報道非常少。主要是由于目前對腫瘤耐藥方面的原理尚未完全研究清楚，因此在如何篩選主要評價的標志物方面導致困難，且由于乳腺癌化療前后的腫瘤標本不易于觀察評價乳腺癌細胞對化療的敏感性，導致篩選標志物后對其作用效果難于評價。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種microRNA標志物組及其在制備評價乳腺癌化療敏感性試劑盒中的應用。該microRNA標志物組可用于乳腺癌化療耐藥的預測、檢測或篩查；通過實時定量PCR檢測乳腺癌標本中標志物組中所涉及的5個miRNA(miR-638，miR-451a，miR-23a-3p，miR-214-3p和miR-200c-3p)的表達狀況，用于評判乳腺癌患者的化療效果。本發(fā)明技術(shù)方案如下：microRNA標志物組，由miR-638，miR-451a，miR-23a-3p，miR-214-3p和miR-200c-3p構(gòu)成，miR-638的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，miR-451a的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，miR-23a-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，miR-214-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，miR-200c-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。上述microRNA標志物組在制備評價乳腺癌化療敏感性試劑盒中的應用。一種評價乳腺癌化療敏感性的試劑盒，包括：上述microRNA標志物組；以及microRNA快速提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、實時定量PCR試劑、人RNU6BmiRNA引物。上述microRNA快速提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、實時定量PCR試劑、人RNU6BmiRNA引物均可采用本領(lǐng)域常規(guī)市售試劑，如microRNA快速提取試劑可采用Bioteke公司銷售的貨號RP5301的試劑；反轉(zhuǎn)錄試劑(包括反應緩沖液，DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶復合物，去離子水)可采用TaKaRa公司銷售的貨號RR066A的試劑；實時定量PCR試劑(包括反應緩沖液，qPCR復合物，去離子水)可采用GeneCopoeia公司銷售的貨號AOMD-Q020的試劑；人RNU6BmiRNA引物可采用GeneCopoeia公司銷售的貨號HmiRQP9001的試劑。microRNA標志物組中各microRNA標志物的篩選過程：本發(fā)明通過miRNAmicroarray(miRNA表達譜芯片，可同時檢測2019個miRNA的表達情況)選擇耐藥組(MP1級)和敏感組(MP5級)各10例乳腺癌化療前原發(fā)灶標本進行分析，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)29個miRNA差異表達的miRNA。發(fā)明人根據(jù)經(jīng)驗結(jié)合差異倍數(shù)及P值，挑選了15個miRNA進一步通過實時定量PCR在190例臨床標本中驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個miRNA標志物：miR-23a-3p，miR-23b-3p，miR-200c-3p，miR-214-3p，miR-638和miR-451a在耐藥組和敏感組中存在差異表達，且與芯片結(jié)果相符；通過進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-23b-3p在ROC曲線(受試者工作特性曲線)分析中無統(tǒng)計學意義，發(fā)明人將5個miRNA標志物：miR-23a-3p，miR-200c-3p，miR-214-3p，miR-638和miR-451a通過Logistic回歸構(gòu)建了風險公式。該耐藥表達譜公式可以很好地區(qū)分化療效果的好壞，而且風險數(shù)值越高的患者其化療效果越差；而且比傳統(tǒng)的檢測單一miRNA指標以及隨機組合的5個miRNA具有更高的準確性和特異性。有益效果1、本發(fā)明首次采用新輔助化療的臨床樣本進行microarray分析，發(fā)明人通過篩選獲得了具有5個miRNA標志物的microRNA標志物組；針對上述5個miRNA標志物的檢測結(jié)果與已經(jīng)建立的風險公式進行比較，可以很好地區(qū)分化療效果的好壞，極大提高預測的準確性；2、本發(fā)明通過對所述microRNA標志物組研制相對應的檢測試劑盒，用于乳腺癌患者化療耐藥效果的預測，提供個性化治療方案，具有重要的臨床意義和很大的開發(fā)價值。附圖說明圖1、采用qRT-PCR方法在初篩(60例)、驗證(59例)、獨立(71例)和總體(190例)樣本中檢測了15個miRNA的表達結(jié)果柱狀圖；其中，圖1A為23a-3p的表達結(jié)果柱狀圖；圖1B為23b-3p的表達結(jié)果柱狀圖；圖1C為miR-638的表達結(jié)果柱狀圖；圖1D為200c-3p的表達結(jié)果柱狀圖；圖1E為miR-214-3p的表達結(jié)果柱狀圖；圖1F為miR-451a的表達結(jié)果柱狀圖；圖2、miR-4454，miR-4707-5p，miR-5100，miR-4286，miR-182-5p，miR-3656，miR-3940，miR-16-5p，miR-4488的表達結(jié)果圖譜；其中，圖2A為miR-4454的表達結(jié)果圖譜；圖2B為miR-4707-5p的表達結(jié)果圖譜；圖2C為miR-5100的表達結(jié)果圖譜；圖2D為miR-4286的表達結(jié)果圖譜；圖2E為miR-182-5p的表達結(jié)果圖譜；圖2F為miR-3656的表達結(jié)果圖譜；圖2G為miR-3940的表達結(jié)果圖譜；圖2H為miR-16-5p的表達結(jié)果圖譜；圖2I為miR-4488的表達結(jié)果圖譜；圖3、miR-23a-3p，miR-638，miR-200c-3p，miR-214-3p，miR-451a及這5個miRNA組成的標志物在初篩(60例)、驗證(59例)、獨立(71例)樣本中的ROC曲線分析圖；其中，圖3A為初篩樣本；圖3B為驗證樣本；圖3C為獨立樣本；圖4、miR-23b-3p在初篩(60例)樣本中的ROC曲線分析圖；圖5、miR-23b-3p，miR-23a-3p，miR-638，miR-200c-3p，miR-451a及這5個miRNA組成的表達譜在初篩(60例)、驗證(59例)、獨立(71例)樣本中進行ROC曲線分析圖；其中，圖5A為初篩樣本；圖5B為驗證樣本；圖5C為獨立樣本。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。實施例11.2009-2013年共190例乳腺癌組織標本(化療前乳腺癌穿刺標本和化療后乳腺癌手術(shù)切除標本，呈配對關(guān)系)，其中119例來自山東大學齊魯醫(yī)院(隨機分成兩組：初篩和驗證樣本)，為排除地域的差異，另外71例來自聊城市人民醫(yī)院的乳腺癌患者。根據(jù)新輔助化療化療效果，將190例病人進行MP(MillerPayne)治療反應評價分級，其中1、2級化療效果較差(即化療無反應或化療后腫瘤細胞減少小于30％)，稱為化療耐藥組；3、4、5級化療效果較好(化療后腫瘤細胞分別減少30-90％，90％以上及完全消失)，稱為化療敏感組。本研究中乳腺癌患者臨床參數(shù)，如表1所示。表1:初篩、驗證和獨立中各臨床樣本的參數(shù)信息2.Microarray芯片委托聯(lián)川生物(LCSciences)公司進行。微陣列實驗使用4～8μg總RNA樣品。使用Poly(A)聚合酶在總RNA3'端加上poly(A)尾巴，再將一個寡聚核苷酸標記與這個poly(A)尾巴連接(ligation)用于后續(xù)的熒光標記。雜交反應利用微循環(huán)泵(AtacticTechnologies)的循環(huán)作用在μParaflo微流體芯片上過夜進行。在微流體芯片上，每條檢測探針都是由一個化學修飾核苷酸編碼段(與目標microRNA互補(來源于miRBase，http://www.mirbase.org/)和一個由聚乙二醇組成的間隔段(擴大編碼段與基質(zhì)的間距)組成。檢測探針均使用PGR(photogeneratedreagent)化學法進行原位合成。雜交解鏈溫度是通過化學修飾檢測探針進行平衡。雜交使用含有質(zhì)量濃度為25％甲酰胺的100μL6×SSPE緩沖液(0.90MNaCl，60mMNa2HPO4，6mMEDTA，pH6.8)，雜交溫度為34℃。RNA與探針雜交后，與標記特異結(jié)合的Cy3染料在微流體芯片上循環(huán)流動進行染色。利用激光掃描儀(GenePix4000B，MolecularDevice)采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件(MediaCybernetics)進行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)分析首先是減除背景值，然后使用LOWESS過濾(Locally-WeightedRegression)進行信號歸一化。10例耐藥組(C)和10例敏感組(H)乳腺癌標本的芯片結(jié)果如表2所示。表2：在乳腺癌耐藥及敏感組織中差異表達的miRNA由表2的結(jié)果可以看出miR-23a-3p，miR-23b-3p，miR-638，miR-200c-3p，miR-214-3p和miR-451a的差異表達。實施例21.乳腺癌標本組織中miRNA的提?。翰捎肂ioteke公司的石蠟包埋組織中miRNA的提取試劑盒。(1)組織切片：將乳腺癌標本的蠟塊切成4μm的薄片10張；(2)切片脫蠟脫水：組織切片置入65℃恒溫箱1小時融蠟，而后浸泡于二甲苯75％、85％、95％及100％乙醇；(3)切片核染色：將切片置于新配制的蘇木素溶液中40-60s，輕柔沖洗并晾干；(4)組織挑?。河陲@微鏡下操作1ml注射器用其針尖將切片中癌組織部分輕輕刮下，置于240μlPTL溶液和10μl蛋白酶K的混合液中混勻；(5)miRNA提?。?)55℃和80℃水浴各10min。2)加入裂解液MRL(購自Bioteke公司)750μl混勻，并室溫放置3min。3)加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩10秒，室溫靜置2min。4)低溫高速離心機12000rmp離心10min后，將水相小心吸出，加入其體積的0.6倍的體積百分比濃度為70％的乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入RA型吸附柱(購自Bioteke公司)；5)12000rmp離心45s，取柱下濾液，加入約其體積2/3的無水乙醇，顛倒混勻，轉(zhuǎn)至RB型吸附柱(購自Bioteke公司)中，10000rmp、4℃離心30s，棄濾液；6)加入漂洗液RW(購自Bioteke公司)750μl，12000rmp、4℃離心1min，棄濾液，重復一遍操作；7)將RB型吸附柱放回收集管中，12000rmp、4℃離心2min，靜置15min；8)向RB型吸附柱加入20～40μlRNasefreewater(購自Bioteke公司)，室溫放置3min，12000rmp、4℃離心1min，收集EP管中得到的microRNA，測濃度后保存于-80℃冰箱。2.qRT-PCR檢測：采用All-in-oneTMmiRNAqRT-PCR檢測試劑盒(購自GeneCopoeia公司)。miRNA的通用下游引物序列：CAGTGCGTGTCGTGGAG和人內(nèi)參U6引物(由GeneCopoeia公司設(shè)計合成)。RT反應條件：37℃1h；85℃5min。體系如下：(2)據(jù)芯片結(jié)果挑選出6種miRNAs(miR-23a-3p，miR-23b-3p,miR-638，miR-200c-3p，miR-214-3p和miR-451a)進行PCR驗證，其序列信息如表3所示：表3序號miRNAs名稱序列1miR-23a-3pAUCACAUUGCCAGGGAUUUCC2miR-23b-3pAUCACAUUGCCAGGGAUUACC3miR-200c-3pUAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA4miR-214-3pACAGCAGGCACAGACAGGCAGU5miR-638AGGGAUCGCGGGCGGGUGGCGGCCU6miR-451aAAACCGUUACCAUUACUGAGUU表4：相關(guān)miRNAs的引物信息表4miRNAs名稱上游引物序列miR-23a-3pGCCAGGGATTTCCAAAAmiR-23b-3pTGCCAGGGATTACCAAAmiR-200c-3pTGCCGGGTAATGATGGAAmiR-214-3pCAGGCACAGACAGGCAGTAAmiR-638GGGCGGGTGGCGGCCTAAAmiR-451aAAACCGTTACCATTACTGAGTTAAPCR反應(總體系20μL)：反應條件：預變性95℃10min；95℃10sec，60℃20sec，72℃10sec共40個循環(huán)。(6)數(shù)據(jù)處理：記錄各樣本平均CT值，按公式△CT＝CT(miRNA)-CT(U6)和2-△CT計算每個樣本中miRNA的相對表達量。使用t檢驗分析，以P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。(7)實驗結(jié)果：在60例初篩樣本中，與敏感組相比，miR-23a-3p，miR-23b-3p，miR-200c-3p和miR-214-3p在耐藥組中表達上調(diào)，miR-638和miR-451a在耐藥組中表達下調(diào)。隨后在59例驗證和71例獨立樣本中也分別均進行了qPCR檢測，并綜合分析了190例總體樣本中6種miRNA的表達情況，實驗結(jié)果較為一致，如圖1所示。此外，發(fā)明人檢測了9個miRNA標記物miR-4454，miR-4707-5p，miR-5100，miR-4286，miR-182-5p，miR-3656，miR-3940，miR-16-5p，miR-4488的表達，結(jié)果顯示其表達情況或與芯片結(jié)果不符，或不具有統(tǒng)計學差異，如圖2所示。實施例3利用GraphPadPrism5軟件對6種miRNA區(qū)分化療效果的特異性和靈敏性進行了受試者工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC曲線)分析。在60例初篩中，結(jié)果顯示miR-23a-3p，miR-200c-3p，miR-214-3pmiR-638和miR-451a(曲線下面積AUC＝0.656、0.727、0.660、0.658、0.729，P均<0.05)，具有較好的區(qū)分化療效果的特異性和靈敏性，如圖3A；而miR-23b-3p的分析結(jié)果顯示其AUC＝0.638(P>0.05)，差異沒有顯著統(tǒng)計學意義，如圖4所示。因此，去掉miR-23b-3p后，將其余5個指標采用Logistic回歸模型構(gòu)建了化療耐藥的風險公式：Riskscore＝(0.782×expressionofmiR-23a-3p)-(3.968×expressionofmiR-638)+(0.361×expressionofmiR-200c-3p)+(5.848×expressionofmiR-214-3p)-(2.598×expressionofmiR-451a)+0.562。根據(jù)該公式，發(fā)明人將初篩中的每例患者的風險系數(shù)計算出來，并根據(jù)其系數(shù)的中位數(shù)作為截點，將初篩中的病例分成高風險組和低風險組。高風險的乳腺癌患者比低風險的患者更易于產(chǎn)生耐藥。而后再對高風險組和低風險組進行ROC曲線分析，結(jié)果顯示以這5種miRNA形成的標志物組具有較好的區(qū)分乳腺癌化療效果的特異性和靈敏性(AUC＝0.890，P＝0.000)。隨后以相同的中位數(shù)為截點在驗證樣本中進行了分析，結(jié)論發(fā)現(xiàn)高風險的乳腺癌患者發(fā)生耐藥的風險明顯增加(AUC＝0.839；P＝0.000；圖3B)。為了排除地域所造成的樣本差異，在71例獨立樣本中也進行了驗證(圖3C)。結(jié)果顯示以這5種miRNA形成的標志物組比單一miRNA預測乳腺癌化療效果的準確性更好。實施例4一種評價乳腺癌化療敏感性的試劑盒，包括：上述microRNA標志物組；以及microRNA快速提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、實時定量PCR試劑、人RNU6BmiRNA引物。上述microRNA快速提取試劑采用Bioteke公司銷售的貨號RP5301的試劑；反轉(zhuǎn)錄試劑(包括反應緩沖液，DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶復合物，去離子水)采用TaKaRa公司銷售的貨號RR066A的試劑；實時定量PCR試劑(包括反應緩沖液，qPCR復合物，去離子水)采用GeneCopoeia公司銷售的貨號AOMD-Q020的試劑；人RNU6BmiRNA引物采用GeneCopoeia公司銷售的貨號HmiRQP9001的試劑。所述microRNA標志物組，由miR-638，miR-451a，miR-23a-3p，miR-214-3p和miR-200c-3p構(gòu)成，miR-638的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，miR-451a的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，miR-23a-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，miR-214-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，miR-200c-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。對比例如實施例4所述的評價乳腺癌化療敏感性的試劑盒，不同之處在于：所述microRNA標志物組，由miR-23b-3p，miR-23a-3p，miR-638，miR-200c-3p和miR-451a構(gòu)成，miR-638的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，miR-451a的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，miR-23a-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，miR-200c-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，miR-23b-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。實驗例采用實施例4及對比例的試劑盒同時檢測了初篩(60例)、驗證(59例)、獨立(71例)樣本中miRNA的表達情況。綜合對比例中的5個miRNA，采用Logistic回歸模型構(gòu)建了化療耐藥的風險公式：Riskscore＝(0.781×expressionofmiR-23a-3p)+(1.606×expressionofmiR-23a-3p)-(3.534×expressionofmiR-638)+(0.414×expressionofmiR-200c-3p)-(2.746×expressionofmiR-451a)+0.655。根據(jù)該公式，計算每例患者的風險系數(shù)，進行ROC曲線分析，結(jié)果顯示在三批樣本中，以對比例這5種miRNA形成的標志物組具有雖然較好的區(qū)分乳腺癌化療效果的特異性和靈敏性；但相比于實施例4構(gòu)成的模型，曲線下面積較小，預測效力較弱，如圖5所示。提示實施例4的標志物組預測價值要優(yōu)于對比例。當前第1頁1 2 3