本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及化合物1的分離制備方法及用途。主要涉及分離純化的過(guò)程，結(jié)構(gòu)確認(rèn)，免疫抑制活性及抗自身免疫性肝炎活性考察等。

背景技術(shù)：

自身免疫性肝炎(AIH)是由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的慢性進(jìn)行性肝臟炎癥性疾病，其臨床特征為不同程度的血清轉(zhuǎn)氨酶升高、高γ-球蛋白血癥、自身抗體陽(yáng)性，組織學(xué)特征為以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)為主的界面性肝炎，嚴(yán)重病例可快速進(jìn)展為肝硬化和肝衰竭。該病在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，在歐美國(guó)家發(fā)病率相對(duì)較高，在我國(guó)其確切發(fā)病率和患病率尚不清楚，但國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的病例數(shù)呈明顯上升趨勢(shì)。根據(jù)血清自身抗體可將自身免疫性肝炎分為3型，Ⅰ型AIH最為常見，相關(guān)抗體為ANA和(或)SMA；II型AIH的特征為抗-LKM1陽(yáng)性；Ⅲ型AIH的特征為血清抗-SLA/LP陽(yáng)性。

天然產(chǎn)物是藥物最常見的來(lái)源，據(jù)統(tǒng)計(jì)，從上世紀(jì)八十年代年至今，每年30-40％的上市藥物直接或間接來(lái)源于天然產(chǎn)物，其中2010年，天然產(chǎn)物相關(guān)來(lái)源的藥物比例高達(dá)50％。植物次生代謝產(chǎn)物的種類極為豐富，隨著近年對(duì)其研究的不斷增多，越來(lái)越多活性強(qiáng)的化合物被發(fā)現(xiàn)，為新藥的研發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。因此，從蘭科植物金線蓮(Anoectochilus roxburghii)中分離具有抗自身免疫性肝炎作用的天然產(chǎn)物具有極為重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供具有抗自身免疫性肝炎作用活性的化合物，還提供該化合物的制備方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是：本發(fā)明提供的具有抗自身免疫性肝炎作用活性的化合物具有以下式(1)所示的結(jié)構(gòu):

本專利申請(qǐng)中也將該式(1)所示結(jié)構(gòu)的化合物稱為化合物1：金線蓮苷(Kinsenoside(3-(R)-3-β-D-Glucopyranosyloxybutanolide))。為糖苷類化合物。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)植物金線蓮(Anoectochilus roxburghii)水提取物進(jìn)行分離純化，得到化合物金線蓮苷，具體結(jié)構(gòu)如式(1)所示。通過(guò)對(duì)化合物的免疫抑制活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)化合物能夠在體內(nèi)及體外對(duì)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一定的抑制活性，可以作為治療自身免疫性肝炎藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物。本專利申請(qǐng)實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金線蓮苷對(duì)自身免疫性肝炎具有較好的治療作用，其機(jī)制在于該化合物對(duì)VEGFR2激酶具有較好的抑制作用，且可有效抑制代謝相關(guān)通路JAK2-STAT3與炎癥相關(guān)通路PI3K-AKT。

附圖說(shuō)明

圖1.金線蓮苷色譜檢測(cè)條件，用于檢測(cè)金線蓮苷在金線蓮全草中的含量。

圖2.化合物1對(duì)自身免疫性肝炎療效考察結(jié)果及其對(duì)CD8⁺的作用(A：肝臟病理學(xué)圖片；B：AST及ALT含量；C：金線蓮苷治療后炎癥浸潤(rùn)及組織損傷均出現(xiàn)減少；D：CD8⁺T細(xì)胞的增殖作用；E：CD8⁺抗體可有效減輕自身免疫性肝炎肝損傷；F：金線蓮苷對(duì)CD8⁺細(xì)胞無(wú)毒性。該圖主要表明金線蓮苷對(duì)于自身免疫性肝炎治療作用，是療效的整體考察，同時(shí)證實(shí)CD8⁺細(xì)胞收到抑制后免疫性肝炎得到一定程度的改善，對(duì)后續(xù)研究的開展具有指導(dǎo)作用。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05,^**P<0.01；與對(duì)照組相比，^#P<0.05,^##P<0.01；與陽(yáng)性藥相比，^ΔP<0.05。

圖3.金線蓮苷抑制DC/Hepa1-6所致自身免疫性肝炎中CD8⁺T細(xì)胞活性(A：DC/Hepa1-6造模及實(shí)驗(yàn)流程；B：肝臟典型HE染色圖；C：金線蓮苷對(duì)CD86及MHC-II表達(dá)的影響；D：CD8⁺T細(xì)胞肝臟免疫組化結(jié)果；E：CD8⁺T細(xì)胞在脾臟、肝臟及胸腺中比例；F：CD8⁺T細(xì)胞毒性研究。該圖主要表明了金線蓮苷對(duì)于DC/Hepa1-6所致自身免疫性肝炎中CD8⁺T細(xì)胞毒性及抑制活性的影響，是對(duì)治療機(jī)制的初步考察。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05,^**P<0.01；與DC/Hepa1-6模型組相比，^#P<0.05,^##P<0.01；與無(wú)DCs組相比，^ΔP<0.05。

圖4.金線蓮苷通過(guò)上調(diào)共抑制分子表達(dá)對(duì)DCs細(xì)胞抗原進(jìn)行抑制(A：金線蓮苷對(duì)TCR表達(dá)無(wú)影響；B：PD-L1mRNA在DCs中的表達(dá)，PD-1,CTLA-4及CD28mRNA在T細(xì)胞中的表達(dá)；C：細(xì)胞穩(wěn)定性考察結(jié)果；D：IFN-γ及GzmB在不同器官中含量檢測(cè)結(jié)果。該圖反應(yīng)金線蓮苷對(duì)于DCs細(xì)胞系的影響，并通過(guò)對(duì)上述因子的檢測(cè)來(lái)考察存在的機(jī)制。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05,^**P<0.01；與模型組相比，^#P<0.05,^##P<0.01。

圖5.金線蓮苷對(duì)免疫細(xì)胞葡萄糖脂質(zhì)代謝及線粒體功能的影響(A：葡萄糖攝取值；B：NEFA表達(dá)量；C：GLUT-1基因表達(dá)量；D：GLUT-1蛋白表達(dá)量；E：DCs細(xì)胞、T細(xì)胞及DC調(diào)控的CD8⁺T細(xì)胞中MMP的含量。該圖反映了金線蓮苷對(duì)于免疫細(xì)胞的作用是通過(guò)影響其糖攝取及線粒體功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的，是藥物作用機(jī)制的初步探討。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05,^**P<0.01；與模型組相比，^#P<0.05,^##P<0.01。

圖6.金線蓮苷抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2的表達(dá)(A：金線蓮苷與蛋白虛擬對(duì)接結(jié)果；B：受體在DCs細(xì)胞、DC調(diào)控的CD8⁺T細(xì)胞及HSC-T6細(xì)胞中的表達(dá)情況；C：肝臟p-VEGFR2免疫組化結(jié)果；D：免疫熒光法檢測(cè)p-VEGFR2在DC調(diào)控的CD8⁺T細(xì)胞及HSC-T6細(xì)胞的表達(dá)量；E：SU5416(VEGFR2拮抗劑)與金線蓮苷對(duì)T細(xì)胞增殖的影響；F：HSC-T6增殖與ECM活化相關(guān)基因的表達(dá)量。該圖通過(guò)檢測(cè)金線蓮苷對(duì)VEGFR2表達(dá)的作用，對(duì)金線蓮苷產(chǎn)生作用的機(jī)制進(jìn)行深入闡述，最終確定該藥物作用與抑制VEGFR2密切相關(guān)。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05,^**P<0.01；與模型組相比，^#P<0.05,^##P<0.01；與無(wú)DC刺激組相比，^ΔΔP<0.01。

圖7.金線蓮苷對(duì)JAK2-STAT3及PI3K-AKT信號(hào)通路的影響(A：金線蓮苷與VEGFR2抗體降低VEGFR2,PI3K,AKT,mTOR及NF-κB的表達(dá)與磷酸化；B：金線蓮苷與VEGFR2抗體抑制JAK2及STAT3的表達(dá)與磷酸化，同時(shí)升高SOCS3水平。該圖說(shuō)明了，金線蓮苷可通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2-STAT3及PI3K-AKT信號(hào)通路的機(jī)制對(duì)自身免疫性肝炎產(chǎn)生治療作用。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05,^**P<0.01；與模型組相比，^#P<0.05,^##P<0.01。

圖8.金線蓮苷對(duì)STAT3蛋白表達(dá)及DNA結(jié)合活性的研究(A：EMSA對(duì)DC調(diào)控的T細(xì)胞中STAT3的影響；B：p-STAT3核蛋白在DC調(diào)控的T細(xì)胞中的表達(dá)量；C：免疫熒光法檢測(cè)p-STAT3在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的熒光值；D：金線蓮苷作用于DC調(diào)控的T細(xì)胞及相關(guān)通路機(jī)制圖。該圖表明金線蓮苷作用的具體機(jī)制。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05,^**P<0.01；與模型組相比，^#P<0.05,^##P<0.01。

圖9.金線蓮苷給藥濃度篩選，金線蓮苷作用于細(xì)胞后，T細(xì)胞增殖情況(A)，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(B)，HSC-T6細(xì)胞增殖情況(C)，ALT及AST水平(D)。該實(shí)驗(yàn)主要用于確定動(dòng)物及體外實(shí)驗(yàn)金線蓮苷的給藥劑量。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與模型組相比，^#P<0.05,^##P<0.01；

圖10.金線蓮苷調(diào)控肝臟及脾臟DCs,CD8⁺T細(xì)胞及T_regs分布(A：CD3⁺T,CD4⁺T,CD8⁺T,T_regs,及NKT在肝臟及脾臟中的百分比；B：金線蓮苷在DC細(xì)胞中對(duì)CD86及MHC-II表達(dá)的影響；C：金線蓮苷在肝臟、脾臟及淋巴中對(duì)CD8⁺T細(xì)胞抑制作用。該圖主要是通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)金線蓮苷對(duì)多個(gè)小鼠器官中DCs,CD8⁺T細(xì)胞及T_regs分布情況，是用于評(píng)價(jià)治療效果的指標(biāo)。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05,^**P<0.01；與ConA模型組相比，^#P<0.05,^##P<0.01。

圖11.金線蓮苷對(duì)DC細(xì)胞的影響(A：CD86與MHC-II表達(dá)情況；B：CD11c⁺CCR7⁺DCs占比；C：CD11c⁺CFSE⁺DCs遷移至正常小鼠腹股溝與腸系膜的比例；D：MLR吸光度比較；E：熒光葡聚糖攝取與累積結(jié)果；F：IDO與ILT-3mRNA表達(dá)情況。該圖反映了DC細(xì)胞中金線蓮苷的作用情況。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與LPS造模組相比，^#P<0.05,^##P<0.01；與無(wú)DC刺激組相比，^ΔΔP<0.01。

圖12.金線蓮苷在體內(nèi)外用于調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用結(jié)果(A：CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T_regs分別在脾臟、淋巴及體外的比例；B：Foxp3mRNA在體外淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況；C：Foxp3mRNA在肝臟、脾臟及淋巴中的表達(dá)情況；D：CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T_regs在DC/Hepa1-6所致自身免疫性肝炎小鼠淋巴、脾臟中的占比；E：Foxp3mRNA在DC/Hepa1-6所致自身免疫性肝炎小鼠淋巴、脾臟中的表達(dá)情況。該圖反映了金線蓮苷在體內(nèi)外對(duì)于Foxp3mRNA及CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺轉(zhuǎn)化細(xì)胞的影響，對(duì)于了解金線蓮苷的作用機(jī)制具有重要意義。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05,^**P<0.01；與模型組相比，^#P<0.05,^##P<0.01。

圖13.金線蓮苷對(duì)肝臟細(xì)胞和脂肪細(xì)胞代謝的影響結(jié)果(A：金線蓮苷對(duì)HSC-T6細(xì)胞中糖攝取、GLUT-4mRNA/蛋白表達(dá)、NEFA分泌及MMP的影響；B：肝臟NEFA表達(dá)情況；C：金線蓮苷對(duì)L-02細(xì)胞中糖攝取、GLUT-4mRNA/蛋白表達(dá)、NEFA分泌及MMP的影響；D：金線蓮苷對(duì)3T3-L1細(xì)胞中糖攝取、GLUT-4mRNA/蛋白表達(dá)、NEFA分泌及MMP的影響；E：金線蓮苷對(duì)成熟脂肪細(xì)胞中糖攝取、GLUT-4mRNA/蛋白表達(dá)、NEFA分泌及MMP的影響。該實(shí)驗(yàn)主要是評(píng)價(jià)金線蓮苷對(duì)小鼠肝臟及脂肪細(xì)胞代謝的影響，用于解釋其具體機(jī)制。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05,^**P<0.01；與模型組相比，^#P<0.05,^##P<0.01。

圖14.金線蓮苷對(duì)p-JAK2無(wú)作用(A：T細(xì)胞增殖作用的影響；B：調(diào)節(jié)細(xì)胞占比；C：MLR增殖情況；D：HSC-T6增殖情況)。該圖主要是探討金線蓮苷對(duì)于p-JAK2的作用，結(jié)果顯示其具體作用機(jī)制與p-JAK2無(wú)關(guān)。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05；與模型組相比，^##P<0.01，與無(wú)DC刺激組相比，^ΔΔP<0.01。

圖15：金線蓮苷的對(duì)應(yīng)異構(gòu)體Goodyeroside A對(duì)DC細(xì)胞、T細(xì)胞及HSC-T6細(xì)胞的作用(A：Goodyeroside A對(duì)PI3K-AKT及JAK2-STAT3均無(wú)影響；B：Goodyeroside A對(duì)MLR及細(xì)胞表現(xiàn)型均無(wú)影響；C：Goodyeroside A對(duì)T細(xì)胞增殖及T_reg變異均無(wú)影響；D：Goodyeroside A對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖，激活及ECM分泌的影響；E：Goodyeroside A在DC細(xì)胞、T細(xì)胞及HSC-T6細(xì)胞中對(duì)GLUT的表達(dá)無(wú)明顯影響)。該圖表明，金線蓮苷的異構(gòu)體對(duì)于活性無(wú)影響，說(shuō)明了上文中對(duì)于自身免疫性肝炎治療活性主要是金線蓮苷結(jié)構(gòu)作用，其藥效具有較強(qiáng)的專一性與獨(dú)特性。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05,^**P<0.01；與模型組相比，^#P<0.05,^##P<0.01，與無(wú)DC刺激組相比，^ΔΔP<0.01。

圖16.金線蓮苷對(duì)PI3K-AKT及JAK2-STAT3通路的作用結(jié)果(A：金線蓮苷對(duì)PI3K-AKT通路及GLUT相關(guān)mRNA表達(dá)結(jié)果；B：金線蓮苷對(duì)PI3K-AKT通路及GLUT相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果；C：金線蓮苷對(duì)L-02及3T3-L1細(xì)胞中信號(hào)分子表達(dá)的影響結(jié)果；D：金線蓮苷對(duì)JAK2-STAT3通路中信號(hào)分子表達(dá)影響的結(jié)果)。該圖說(shuō)明了，金線蓮苷對(duì)于PI3K-AKT及JAK2-STAT3通路的作用，主要用于深入了解金線蓮苷作用的分子機(jī)制。數(shù)據(jù)以(平均數(shù)+方差)表示，n＝3，與空白組相比，^*P<0.05,^**P<0.01；與740Y-P組相比，^#P<0.05,^##P<0.01。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：化合物1的制備、結(jié)構(gòu)鑒定及含量測(cè)定。

(一)如式(1)所示金線蓮苷

1.提取及分離條件

購(gòu)買于福建省永安市的金線蓮全草，干燥后以20倍當(dāng)量水煮沸提取，減壓蒸餾濃縮液，正相硅膠柱洗脫，洗脫條件氯仿:甲醇＝5:1。

2.金線蓮苷分析及含量測(cè)定方法

色譜柱：AQ-C18柱(月旭公司)；洗脫條件：1.0ml/min純水；檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例2：化合物1抗自身免疫性肝炎作用。

利用刀豆蛋白A進(jìn)行造模，化合物1的抗自身免疫性肝炎作用是先通過(guò)檢測(cè)小鼠血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ干擾素(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β1)及一氧化氮(NO)等進(jìn)行活性研究，初步判斷其機(jī)制；再對(duì)體內(nèi)體外CD8⁺T淋巴細(xì)胞的含量進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)判斷其主要機(jī)制；最后通過(guò)考察金線蓮苷對(duì)DC-T細(xì)胞通路干擾作用、金線蓮苷抑制的DC-T細(xì)胞受損機(jī)制、VEGFR2激酶抑制活性及對(duì)JAK2-STAT3與PI3K-AKT通路的抑制活性來(lái)確定其具體機(jī)制。結(jié)果如圖2至圖16及表1-7所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：金線蓮苷對(duì)自身免疫性肝炎具有較好的治療作用，其機(jī)制在于該化合物對(duì)VEGFR2激酶具有較好的抑制作用，且可有效抑制代謝相關(guān)通路JAK2-STAT3與炎癥相關(guān)通路PI3K-AKT。

表1.金線蓮苷及Goodyeroside A核磁數(shù)據(jù)(400MHz；in pyr-d₅；J in Hz)

表2金線蓮苷對(duì)小鼠肝功能影響檢測(cè)結(jié)果(means±SD,n＝6).

^**P<0.01compared with controls；^#P<0.05,^##P<0.01compared with ConA models；

^ΔP<0.05,^ΔΔP<0.01compared with silymarin group.

表3.金線蓮苷對(duì)自身免疫性肝損傷小鼠中炎性因子含量檢測(cè)結(jié)果(means±SD,n＝6).

^**P<0.01compared with controls；^#P<0.05,^##P<0.01compared with Con A models；^ΔP<0.05,^ΔΔP<0.01compared with silymarin group.

表4.金線蓮苷在T細(xì)胞缺失小鼠體內(nèi)對(duì)相關(guān)指標(biāo)影響的檢測(cè)結(jié)果(means±SD,n＝6).

^*P<0.05,^**P<0.01compared with controls；^#P<0.05,^##P<0.01compared with ConA models；^ΔP<0.05,^ΔΔP<0.01compared with anti-CD8group.

表5.金線蓮苷在DC/Hepa小鼠體內(nèi)對(duì)相關(guān)指標(biāo)影響的檢測(cè)結(jié)果(means±SD,n＝6).

^*P<0.05,^**P<0.01compared with controls；^#P<0.05,^##P<0.01compared with DC/Hepa models.

表6.KD虛擬對(duì)接分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)

^a Docking score/interaction potential of compounds with targets(kcal/mol).

^b See reference 1-3.

表7.金線蓮苷成藥性考察結(jié)果

Software name and version:ACD/Percepta 14.0.0.

^a Calculated octanol/water partition coefficient.

^b Molecular weight.

^c Hydrogen bond donors.

^d Hydrogen bond acceptors.

^e Plasma protein binding.

^f P-glycoprotein substrates.