本發(fā)明涉及生物化工領域，具體地說是一種從ɑ-熊果苷發(fā)酵液中分離ɑ-熊果苷的方法。

背景技術：

熊果苷是一種氫醌苷類化合物，是酪氨酸酶的抑制劑，能阻斷多巴及多巴醌的合成，從而有效地抑制黑色素的生成，具有美白作用。天然提取物中含的是β-熊果苷，但ɑ-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的10倍以上，有效性和安全性高于β-熊果苷。ɑ-熊果苷化學合成比較難，易形成ɑ-熊果苷和β-熊果苷的混合物，分離難度大。因此越來越多的研究傾向于用微生物法或酶法合成ɑ-熊果苷。

公開號為CN1635139A的中國發(fā)明專利申請公開了一種發(fā)酵生產ɑ-熊果苷的方法，利用野油菜黃單胞菌，以氫醌和蔗糖為底物進行發(fā)酵，發(fā)酵液分別通過弱極性大孔吸附樹脂AB-8和極性大孔吸附樹脂S-8柱進行分離，然后通過真空干燥獲得純品。

公開號為CN102329838A的中國發(fā)明專利申請公開了一種以黑曲霉菌株轉化生產ɑ-熊果苷的方法，以氫醌和麥芽糖作為底物發(fā)酵，發(fā)酵液經Amberlite XAD-16或D101大孔吸附樹脂提取，得到ɑ-熊果苷。

以上兩件專利申請對于分離純化過程都是簡單提及，最終得到的產品無論從色澤還是純度上都有待于提高。

另外，生物法都是采用氫醌做底物，發(fā)酵結束后都會有少量的氫醌殘余，而氫醌是一種已知的皮膚致敏物，禁用于護膚品中，因此在ɑ-熊果苷的分離純化過程中若不能有效除去氫醌，會直接影響產品質量甚至導致產品不合格。

公開號為CN103483401A的中國發(fā)明專利申請?zhí)岢隽艘环N從ɑ-熊果苷發(fā)酵液中除去氫醌的方法，用磷酸三丁酯進行多次萃取與反萃取，并需引入無機鹽。該方法使得熊果苷純化工藝更加復雜化。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有方法過于復雜、成本高且效果不理想的技術問題，提供一種從ɑ-熊果苷發(fā)酵液中分離ɑ-熊果苷的方法，其可以提高ɑ-熊果苷的分離效率和產品質量。

本發(fā)明提供一種從ɑ-熊果苷發(fā)酵液中分離ɑ-熊果苷的方法，其特征是包括如下步驟：(1)將ɑ-熊果苷發(fā)酵液通過中空纖維膜過濾，除去菌體，得濾液；(2)將步驟(1)中得到的濾液調pH至酸性，然后將溶液通過中等極性的大孔吸附樹脂，收集流出液；(3)將步驟(2)中得到的流出液過低極性大孔吸附樹脂，之后用水沖洗柱子，再用乙醇溶液洗脫，得洗脫液；(4)將步驟(3)中得到的洗脫液經真空干燥濃縮至結晶析出時，放置，ɑ-熊果苷以結晶形式析出；(5)將步驟(4)中形成的ɑ-熊果苷結晶用有機溶劑懸起，過濾，并用有機溶劑洗滌，即可得到白色ɑ-熊果苷產品。

優(yōu)選地，步驟(1)中的中空纖維膜為截留分子量為6000-60000的中空纖維膜。

優(yōu)選地，步驟(2)中，調pH至酸性是指調pH至3-5。

優(yōu)選地，步驟(2)中，中等極性的大孔吸附樹脂，指Amberlite XAD-6、XAD-7、XAD-7HP或XAD-8樹脂。

優(yōu)選地，步驟(3)中的低極性的大孔吸附樹脂，指H103、H107或H1020樹脂，所述乙醇溶液的體積百分比濃度為10％-15％。

優(yōu)選地，步驟(5)中的有機溶劑為丙酮。

本發(fā)明中α-熊果苷的分離純化過程相對簡單，能夠徹底除去氫醌，所得α-熊果苷產品色澤度好(參見圖1)，純度高。用HPLC外標法檢測所得熊果苷的純度達99％以上(參見圖2)，HPLC檢測條件為：柱子：C18柱(4.6*150mm，3.5um)；流動相：90％含1/1000甲酸的水，10％甲醇；流速：0.3mL/min；柱溫：45℃。

通過本發(fā)明所述方法得到的α-熊果苷產品經核磁圖譜驗證確實為α-熊果苷(參見圖3A和圖3B)，α-熊果苷5.34ppm處偶合常數(shù)J＝3.6Hz， 區(qū)別于β-熊果苷此處的偶合常數(shù)J＝7.8，且從核磁圖譜上未看到雜質峰。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所得熊果苷產品性狀照片；

圖2為本發(fā)明所得熊果苷的HPLC圖譜；

圖3A為所得熊果苷的核磁圖譜氫譜；

圖3B為所得熊果苷的核磁圖譜碳譜。

具體實施方式

根據下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所描述的本發(fā)明。本發(fā)明實施例中所用到的試劑均從公開市場上購買。本發(fā)明中ɑ-熊果苷發(fā)酵液是指用氫醌做底物微生物發(fā)酵制備ɑ-熊果苷的發(fā)酵產物。

實施例1

將4Lɑ-熊果苷發(fā)酵液通過中空纖維膜過濾系統(tǒng)(膜的截留分子量為60000)除去菌體，過濾后的清液用1.0mol/L的鹽酸調pH 3.0,然后通過Amberlite大孔吸附樹脂XAD-7(1.5升)，流出液繼續(xù)通過大孔吸附樹脂H103(1.5升)，用3倍柱體積的水沖洗H103樹脂柱，后用4倍柱體積的體積百分比濃度10％的乙醇溶液洗脫，收集含ɑ-熊果苷的洗脫液，真空濃縮至大部分結晶析出時，于4℃環(huán)境中放置1小時，此時更多的晶體析出，用事先預冷的丙酮將結晶懸起，過濾，并用少量丙酮洗滌得ɑ-熊果苷純品。

實施例2

將4Lɑ-熊果苷發(fā)酵液通過中空纖維膜過濾系統(tǒng)(膜的截留分子量為30000)除去菌體，過濾后的清液用1.0mol/L的鹽酸調pH 4.0,然后通過Amberlite大孔吸附樹脂XAD-8(1.5升)，流出液繼續(xù)通過大孔吸附樹脂H103(1.5升)，用3倍柱體積的水沖洗H103樹脂柱，后用4倍柱體積的體積百分比濃度10％的乙醇洗脫，收集含ɑ-熊果苷的洗脫液，真空濃 縮至大部分結晶析出時，于4℃環(huán)境中放置1小時，此時更多的晶體析出，用事先預冷的丙酮將結晶懸起，過濾，并用少量丙酮洗滌得ɑ-熊果苷純品。

實施例3

將4Lɑ-熊果苷發(fā)酵液通過中空纖維膜過濾系統(tǒng)(膜的截留分子量為60000)除去菌體，過濾后的清液用1.0mol/L的鹽酸調pH 5,然后通過Amberlite大孔吸附樹脂XAD-7(1.5升)，流出液繼續(xù)通過大孔吸附樹脂H107(1.5升)，用3倍柱體積的水沖洗H107樹脂柱，后用4倍柱體積的體積百分比濃度15％的乙醇洗脫，收集含ɑ-熊果苷的洗脫液，真空濃縮至大部分結晶析出時，于4℃環(huán)境中放置1小時，此時更多的晶體析出，用事先預冷的丙酮將結晶懸起，過濾，并用少量丙酮洗滌得ɑ-熊果苷純品。

實施例4

將4Lɑ-熊果苷發(fā)酵液通過中空纖維膜過濾系統(tǒng)(膜的截留分子量為6000)除去菌體，過濾后的清液用1.0mol/L的鹽酸調pH 4.0,然后通過Amberlite大孔吸附樹脂XAD-6(1.5升)，流出液繼續(xù)通過大孔吸附樹脂H103(1.5升)，用3倍柱體積的水沖洗H103樹脂柱，后用4倍柱體積的體積百分比濃度15％的乙醇洗脫，收集含ɑ-熊果苷的洗脫液，真空濃縮至大部分結晶析出時，于4℃環(huán)境中放置1小時，此時更多的晶體析出，用事先預冷的丙酮將結晶懸起，過濾，并用少量丙酮洗滌得ɑ-熊果苷純品。