本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的miRNA序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

microRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為19-25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。其在不同的物種間具有很高的同源性，可能調(diào)控著人類基因的1/3。microRNAs參與調(diào)控個體發(fā)育，細(xì)胞的增殖分化、周期等活動主要有三種方式：成熟的microRNA互補結(jié)合mRNA，RISC特異降解靶mRNA抑制mRNA的翻譯；成熟microRNA在不影響mRNA穩(wěn)定的前提下，與靶mRNA的3′UTR，抑制靶mRNA的表達(dá)；microRNA與剪切目標(biāo)mRNA聚腺苷酸末端配對結(jié)合后，靶mRNA被3′核酸外切酶水解，在轉(zhuǎn)錄后水平對靶mRNA進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。通過靶向不同的基因，microRNA實現(xiàn)其腫瘤細(xì)胞的功能調(diào)控。研究表明，越來越多的原癌或抑癌基因在腫瘤細(xì)胞與正常組織間的表達(dá)存在顯著差異，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在關(guān)聯(lián)性。運用microRNA的原癌或抑癌基因的功能，利用相關(guān)技術(shù)，或可實現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)治療的可能。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種核酸序列。

本發(fā)明所提供的核酸序列，為如下(A)或(B)：

(A)雙鏈RNA：所述雙鏈RNA由正義鏈和反義鏈組成，所述正義鏈具有序列表中序列1所示序列，所述反義鏈具有序列表中序列2所示序列；

(B)由一條單鏈RNA和一條單鏈DNA互補配對形成的嵌合雙鏈：所述嵌合雙鏈中的所述單鏈RNA具有序列表中序列1所示序列，所述單鏈DNA具有將序列表中序列2中的U替換為T后所示序列。

在本發(fā)明中，所述(A)中，所述正義鏈的序列具體為序列表中序列1，所述反義鏈具體為序列表中序列2。所述(B)中，所述單鏈RNA的序列具體為序列表中序列1，所述單鏈DNA的序列具體為將序列表中序列2中的U替換為T后所示序列。

根據(jù)需要所述核酸序列可經(jīng)過如下修飾中的至少一種：

(1)對所述核酸序列的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾(如磷酸二酯鍵中的氧被硫取代)；

(2)對所述核酸序列的核苷酸序列中的核糖的2′-OH的修飾(如2′-OH經(jīng)過甲氧基取代、氟取代或者脫氧修飾)；

(3)對所述核酸序列的核苷酸序列中的堿基的修飾(如LNA等修飾；膽固醇、甲氧基、硫代、氨基等修飾；3′或5′的特殊修飾，包括生物素、熒光基團及其它特殊標(biāo)記)。

進(jìn)一步，所述核酸序列為化學(xué)合成，可以進(jìn)行2′氟代(2′-F)、2′甲氧基(2′-OMe)、硫代(PS)和2′脫氧(2′-deoxy)化學(xué)修飾。修飾的核酸序列分子可分別表示如下：所述核酸序列-2′-F、所述核酸序列-PS、所述核酸序列-2′-OMe和所述核酸序列-2′-deoxy?；蚴呛塑账嵝蛄械?'p、5'巰基、5'NH2、5'Chol、5-Me-dC修飾、5'TET、5'Biotin3'NH2、3'Chol、3'BHQ-1、3'Dabcyl，或是C6S-S修飾等修飾。所述核酸序列分子有作用的重要腫瘤調(diào)控基因例如轉(zhuǎn)錄因子Jun等，但不僅限于該靶基因。

進(jìn)一步，含有所述DNA分子的重組載體或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的應(yīng)用，具體為：所述核酸序列或所述DNA分子或所述重組載體或重組菌在如下任一中的應(yīng)用：

(a1)制備用于抑制腫瘤生長的藥物，和/或抑制腫瘤生長；

(a2)制備用于抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物，和/或抑制腫瘤細(xì)胞增殖；

(a3)制備用于抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的藥物，和/或抑制腫瘤細(xì)胞侵襲；

(a4)制備用于抑制腫瘤細(xì)胞遷移的藥物，和/或抑制腫瘤細(xì)胞遷移；

(a5)制備用于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物，和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；

(a6)制備用于預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的藥物，和/或預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。

其中，所述預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)具體為預(yù)防腫瘤摘除術(shù)或放化療后殘余腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種藥物。

本發(fā)明所提供的藥物具有如下(a1)-(a6)功能中至少一種，其活性成分為所述核酸序列或所述DNA分子或所述表達(dá)盒、重組載體或重組菌；

(a1)抑制腫瘤生長；

(a2)抑制腫瘤細(xì)胞增殖；

(a3)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲；

(a4)抑制腫瘤細(xì)胞遷移；

(a5)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；

(a6)預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。

根據(jù)需要，所述藥物還可包括藥學(xué)上可接受的載體。所述藥學(xué)上可接受的載體應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明藥物中的雙鏈RNA分子相容。

進(jìn)一步，所述藥學(xué)上可接受的載體可為體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑，如脂質(zhì)體，聚乙烯亞胺(PEI)、陽離子納米聚合物等。或是傳統(tǒng)的藥物載體，糖類、淀粉、纖維素及其衍生物、植物油等滲緩沖液等?；蛘呤切滦退幬镙d體制劑：大分子物質(zhì)，如免疫球蛋白、白蛋白、纖維原、葡萄糖等；經(jīng)過或未經(jīng)過改造的細(xì)胞，如白細(xì)胞、紅細(xì)胞等；合成得到的生物可降解性大分子脂質(zhì)體，如靜脈乳、磁性球劑、玉脂聚糖球等；合成的非生物降解性大分子，如半滲透微囊、聚丙烯凝膠等。本發(fā)明的藥物可以制成各種醫(yī)學(xué)上可接受的劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、發(fā)病情況、給藥方式等因素中和考慮對病人進(jìn)行有益的劑量施用。具體劑型可包括口服液、注射劑、舌下含服劑等多種液體劑型，或通過加以適當(dāng)?shù)馁x形劑制備成粉劑、片劑、膠囊劑等多種其他劑型。較佳的制劑為保持核酸序列的效能、毒副作用低、給藥途徑適宜。

在本發(fā)明的實施例中，所述藥學(xué)上可接受的載體具體為脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen)。相應(yīng)的，所述藥物中，所述核酸序列和所述Lipofectamine2000的配比具體為(5-50)pmol：1μL，如(20-32)pmol：1μL，具體如20pmol：1μL，或者30pmol：1μL，或者50pmol：1μL。更加具體的，所述藥物中，所述核酸序列溶液的濃度為20μmol/L，所述核酸序列溶液和所述Lipofectamine2000的體積配比具體為(1-1.6)：1，如1：1，或者1.5：1，或者1.6：1。

所述藥物中還可以包括葡萄糖、生理鹽水或者緩沖液等。

在本發(fā)明中，所述腫瘤具體為肝癌；所述腫瘤細(xì)胞具體為肝癌細(xì)胞。更加具體的，所述肝癌細(xì)胞為HepG2細(xì)胞或SK-HEP-1細(xì)胞。

實驗證明，本發(fā)明所提供的核酸序列通過抑制肝癌腫瘤細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子Jun的表達(dá)，實現(xiàn)抑制腫瘤生長的作用。在動物水平，將腫瘤細(xì)胞接種裸鼠，隨后用所述核酸序列治療的實驗證明所述核酸序列能在體內(nèi)有效抑制腫瘤的生長。另外，在細(xì)胞水平，還證實了本發(fā)明所提供的核酸序列具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、抑制腫瘤細(xì)胞遷移和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。因此，本發(fā)明所提供的核酸序列作為一種新型小核酸類的抗腫瘤藥物，既能抑制體內(nèi)腫瘤的生長，降低腫瘤擴散風(fēng)險，也有望用于預(yù)防腫瘤切除或放療、化療后的殘余腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)。

附圖說明

圖1為CCK-8方法檢測實施例1制備的2′-OH核酸序列抑制腫瘤細(xì)胞增殖的折線圖；

圖2為實施例1制備的2′-OH核酸序列抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的柱形圖；

圖3為實施例1制備的2′-OH核酸序列抑制腫瘤細(xì)胞遷移的柱形圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中所涉及的定量實驗，均設(shè)置至少3個重復(fù)，結(jié)果取均值。

5周齡的雄性裸鼠：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(BALB/cNude401)。

Hep G2細(xì)胞：中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫(TCHu 72)。

SK-HEP-1細(xì)胞：中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫(TCHu 109)。

實施例1、核酸序列的制備

本發(fā)明中所述核酸序列為雙鏈RNA；所述雙鏈RNA由正義鏈和反義鏈組成，所述正義鏈的序列為序列表中序列1所示序列(5′-UGGGGGAGGAAGGACAGGCCAU-3′)，所述反義鏈的序列為序列表中序列2所示序列(5′-AUGGCCUGUCCUUCCUCCCCCA-3′)。選用一條隨機序列作為陰性對照(NC)，NC的正義鏈的序列為：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(序列3)，反義鏈的序列為：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(序列4)。所述核酸序列和所述陰性對照序列中的A、G、C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脫氧核苷酸。

所述核酸序列及所述陰性對照由上海生工(Sangon)生物工程股份有限公司合成。將本發(fā)明合成的由序列1和序列2組成的核酸序列命名為2′-OH-核酸序列。當(dāng)然，也可以將所述雙鏈RNA替換為由一條單鏈RNA和一條單鏈DNA互補配對形成的嵌合雙鏈；所述嵌合雙鏈中的所述單鏈RNA的序列為序列表中序列1所示序列(5′-

UGGGGGAGGAAGGACAGGCCAU-3′)，所述單鏈DNA的序列為將序列表中序列2中的U替換為T后所示序列(5′-AUGGCCUGUCCUUCCUCCCCCA-3′)；

實施例2、2′-OH-核酸序列對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

將實施例1制備的2′-OH核酸序列和陰性對照粉末分別溶解于DEPC水中，配成終濃度為20μmol/L的溶液。取對數(shù)期的肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞和SK-HEP-1細(xì)胞)，分別調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×10⁵細(xì)胞/mL，按每孔100μL接種于96孔板；置于37℃，含5％CO₂的孵箱中使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染時，分別將0.3μL的2′-OH核酸序列溶液(濃度為20μmol/L)和0.3μL的lipofectamine2000(Invitrogen)稀釋于25μL無血清培養(yǎng)液(Opti-MEM)中混勻，室溫孵育5分鐘，然后將上述核酸序列溶液與lipofectamine2000溶液混勻，于室溫靜置20分鐘，將約50μL的核酸序列-脂質(zhì)體復(fù)合物加到細(xì)胞培養(yǎng)板中(細(xì)胞生長融合率為65％)，分別培養(yǎng)0、24、48、72和96小時；小心吸去上清，加入90μL新鮮培養(yǎng)基，再加入10μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時，在酶聯(lián)免疫檢測儀450nm處測量各孔的吸光值；同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基，CCK-8)，每組設(shè)置5個復(fù)孔。OD450的值越大，說明活細(xì)胞數(shù)越多，即細(xì)胞增殖能力越強；反之，OD450的值越小，說明活細(xì)胞數(shù)越少，即細(xì)胞增殖能力越弱。

結(jié)果如圖1所示，圖1表明轉(zhuǎn)染實施例1制備的2′-OH核酸序列的腫瘤細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，與陰性對照組(NC)相比較，增殖速率明顯降低。

實施例3、2′-OH-核酸序列抑制腫瘤細(xì)胞侵襲能力

將實施例1制備的2′-OH核酸序列按實施例2的分組及實驗體系進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染完成后，于37℃，含5％CO₂的孵箱中培養(yǎng)過夜，更換為含5％(體積分?jǐn)?shù))FBS的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24h。實驗前，用含0.5％(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM培養(yǎng)液按1：6稀釋50mg/L Matrigel(BD公司Matrigel TM貨號354234)，取60μL包被transwell小室底部膜的上室面，放37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育4小時，吸棄上清。轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞PC-3及DU145以胰酶消化，血球計數(shù)板計數(shù)，按5×103細(xì)胞/孔的濃度接種于transwell小室，下室加入血清濃度為20％的培養(yǎng)基700μL，37℃5％CO₂培養(yǎng)48h。取出小室，PBS洗一次。加入預(yù)冷的甲醇-20℃固定10min。棄凈甲醇后PBS清洗三遍。用棉簽輕輕刮去小室上表面的Matrigel膠，用PBS洗上表面3次。拿出小室倒置，風(fēng)干。將小室放入新的24-well中，加入200μL 0.1％結(jié)晶紫(配制方法：稱取0.1g結(jié)晶紫加100mL冰乙酸溶解完全，搖勻即得)，使膜浸沒，37℃染色30min。用ddH2O洗3次。小室風(fēng)干后，放入孔中，倒置顯微鏡下取若干視野，拍照計數(shù)，統(tǒng)計穿過膜的細(xì)胞數(shù)。穿過膜的腫瘤細(xì)胞數(shù)越多，說明腫瘤細(xì)胞的侵襲能力越強；反之，穿過膜的腫瘤細(xì)胞數(shù)越少，說明腫瘤細(xì)胞的侵襲能力越弱。

結(jié)果如圖2所示，圖2表明，與陰性對照組(NC)相比，轉(zhuǎn)染了實施例1制備的2′-OH核酸序列的腫瘤細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制。

實施例4、2′-OH-核酸序列抑制腫瘤細(xì)胞遷移能力。

將實施例1制備的2′-OH核酸序列和陰性對照粉末分別溶解于DEPC水中，配成終濃度為20μmol/L的溶液。取對數(shù)期肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞和SK-HEP-1細(xì)胞)，分別調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1.5×10⁶細(xì)胞/mL。按1.5×10⁶細(xì)胞/孔的濃度接種6孔板，混勻后于37℃5％CO₂培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染時，分別將8μL的2′-OH核酸序列溶液(濃度為20μmol/L)和5μL的lipofectamine2000(Invitrogen)稀釋于250μL無血清培養(yǎng)液(Opti-MEM)中混勻，室溫孵育5分鐘，然后將上述核酸序列溶液與lipofectamine2000溶液混勻，于室溫靜置20分鐘，將約500μL的核酸序列-脂質(zhì)體復(fù)合物加到細(xì)胞培養(yǎng)板中(細(xì)胞生長融合率為85％)。轉(zhuǎn)染后將6孔板于37℃5％CO₂培養(yǎng)過夜，用20μL槍頭比著直尺，在6孔板中均勻畫直線橫穿過孔，每孔三條。用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入3％(體積分?jǐn)?shù))FBS培養(yǎng)基。放入37℃5％CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0h、8、24、48h拍照。利用Image-ProPlus量出各照片劃痕的面積及長度，按劃痕寬度值＝劃痕面積面積/劃痕長度值，算出各劃痕寬度；進(jìn)而計算第48小時劃痕愈合率，第48小時劃痕愈合率＝(0h劃痕寬度-48h劃痕寬度)/0h劃痕寬度。劃痕愈合率越大，說明腫瘤細(xì)胞的遷移能力越強；反之，劃痕愈合率越小，說明腫瘤細(xì)胞的遷移能力越弱。

結(jié)果如圖3所示，圖3表明，與陰性對照組(NC)相比，轉(zhuǎn)染了實施例1制備的2′-OH核酸序列的腫瘤細(xì)胞的遷移能力受到明顯抑制。