本發(fā)明涉及基因重組技術，特別涉及一種重組人源嵌合GcFc基因片段及融合蛋白。

背景技術：

近年來，在生物制藥領域，人源化抗體和Fc融合蛋白兩類技術發(fā)展迅速。根據重鏈恒定區(qū)的不同，人源抗體可以分為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE 5類，其中IgG類抗體半衰期長達21天，人源化抗體藥物多為IgG形式。Fc融合蛋白，又稱抗體融合蛋白、Ig融合蛋白，是利用基因工程技術將具有活性功能的蛋白分子與抗體的Fc段通過鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基連接，形成類似于IgG分子的同源二聚體蛋白質，但無CH1區(qū)域和輕鏈。由于結構上的同源，使Fc融合蛋白不僅具備功能蛋白分子的全部生物學活性，還表現(xiàn)出與同種型的人IgG相當?shù)乃幬锎x動力學，具有長效的體內應用半衰期。

IgG的Fc段在消滅病原體或腫瘤細胞的免疫防御中起重要作用。IgG Fc的效應子功能包括兩種主要機制：1、與細胞表面的FcγR結合，發(fā)揮調理作用或抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)；2、與補體成分C1q結合，引發(fā)補體依賴的細胞毒作用(CDC)，從而裂解細胞。根據發(fā)現(xiàn)的先后順序和在血清中濃度的不同，IgG又可分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4四種亞型。在四種人IgG同種型中，IgG1和IgG3能有效地結合FcγR。IgG4與FcγR的結合親和力比IgG1和IgG3的低一個數(shù)量級，而IgG2與FcγR的結合低得難以測定。人IgG1和IgG3還能有效地結合C1q，激活補體級聯(lián)反應，發(fā)揮CDC效應。人IgG2對補體的固定很弱，而IgG4表現(xiàn)出極端缺乏激活補體級聯(lián)反應的能力。

在臨床上，除了有目的的利用抗體的ADCC或CDC效應治療疾病外，在有些時候，需要避免人源化抗體或Fc融合蛋白產生ADCC或CDC效應，亦即當人源化抗體或Fc融合蛋白結合于靶細胞表面時，抗體或融合蛋白的Fc區(qū)域要求必須不會介導不良效應子功能而裂解或除去這些細胞，因此，這類人源化抗體或Fc融合蛋白的Fc區(qū)域必須是非裂解性的，即在結合FcγR和C1q而觸發(fā)效應子功能方面，F(xiàn)c必須是無活性的。顯然，沒有一種天然的IgG同種型適合產生以上要求的人源化抗體或Fc融合蛋白。

制備非裂解性的人源化抗體或Fc融合蛋白，目前的策略是通過使天然Fc區(qū)域中的一些氨基酸突變而得到Fc變體，來消除其ADCC和CDC效應，但與此同時，氨基酸序列的局部改變不可避免的增加了Fc區(qū)域的免疫原性，不利于此類制劑的反復和長期應用。為了制備出穩(wěn)定性好、半衰期長、非裂解性且免疫原性低的人源化抗體或Fc融合蛋白，有必要開發(fā)出新型的Fc區(qū)域結構，本發(fā)明由此而來。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種重組人源嵌合GcFc基因片段及融合蛋白，至少能夠解決上述問題之一。

為實現(xiàn)上述目的，根據本發(fā)明的一個方面，提供了一種重組人源嵌合GcFc基因片段，包括三個依次連接的基因片段，三個基因片段的編碼序列依次如SeqNo.1～3所示。

在一些實施方式中，重組人源嵌合GcFc基因片段基因編碼序列如SeqNo.4所示。

相應地，本發(fā)明還提供了一種融合蛋白，包含免疫球蛋白的Fc段，F(xiàn)c段包含GcFc多肽，GcFc多肽由上述的重組人源嵌合GcFc基因片段編碼，GcFc多肽的氨基酸序列如SeqNo.5所示。

本發(fā)明的重組人源嵌合GcFc基因片段的設計思路來源如下。

通過比較人和鼠的IgG同種型的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)CH2區(qū)域氨基末端附近的Fc部分在IgG Fc與FcγR的結合中起作用，已用基因工程抗體證明234位到237位基序的重要性。在四種人IgG同種型中，IgG1和IgG3與FcγR的結合能力最強，且具有相同的序列Leu234-Leu-Gly-Gly237。在以低親和力與FcγR結合的IgG4中，其序列含有單個氨基酸取代，Phe取代234位的Leu。在不結合FcγR的IgG2中，兩個取代和一個缺失形成，Val234-Ala-Gly237。為了進一步減少IgG4Fc與FcγR的結合和ADCC活性，可用Ala替代IgG4中的Leu235。用IgG2序列中的Pro233-Val-Ala235替代IgG1序列中的Glu233-Leu-Leu235，可使IgG1變體在小鼠中失去由FcγR介導清除靶細胞的能力。

IgG的C1q結合位點在CH2結構域上，點突變實驗證明IgG的Glu318-X-Lys320-X-Lys322對結合起重要作用。對Fc與C1q結合非常重要的另一部分序列位于人IgG的CH2區(qū)域羧基端附近。在四種人IgG同種型中，這部分中僅有一個位點顯示取代：用IgG1、IgG2和IgG3中的Pro331替代IgG4中的Ser331，可以部分增強IgG4的補體固定活性。而用Ser替代IgG1的Pro331則可使IgG1失去與C1q的結合親和力。

人IgG2不結合FcγR，但顯示出極弱的補體結合活性。具有Pro331Ser突變的Fcγ2變體比天然Fcγ2的補體活性更低，而且依舊是FcγR非結合子。IgG4Fc在激活補體級聯(lián)中有缺陷，且它與FcγR的結合親和力比最高活性的同種型(IgG1)的低一個數(shù)量級。與天然Fcγ4相比，具有Leu235Ala突變的Fcγ4變體表現(xiàn)出最小的效應子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的Fcγ1也表現(xiàn)出比天然Fcγ1低的效應子功能。這些Fc變體比各種天然人IgG Fc更適于制備非裂解性人源化抗體或Fc融合蛋白。在非裂解Fc的制備中也可引入其它替換，而不影響循環(huán)半衰期或導致不良的構型變化。

IgG4與FcγR的結合親和力比IgG1和IgG3的低一個數(shù)量級，且表現(xiàn)出極端缺乏激活補體級聯(lián)反應的能力，因此有研究者選擇應用IgG4的Fc制備非裂解性人源化抗體或Fc融合蛋白，但IgG4抗體容易發(fā)生半分子交換，或稱半抗體交換反應，IgG4分子重鏈間的二硫鍵并不穩(wěn)定，使得重鏈可以分開并隨機重組，由此形成帶有兩個不同抗原結合位點的不對稱抗體，一種天然雙特異性抗體。IgG4抗體發(fā)生半分子交換需要滿足三個條件：一是抗體鉸鏈區(qū)特殊模體(motif)；二是CH3結構域關鍵氨基酸殘基；三要有還原條件的存在。IgG各亞型的鉸鏈區(qū)都有一個CXXC蛋白模體(C：半胱氨酸；X：任意氨基酸)，2個半胱氨酸形成重鏈間的二硫鍵。如IgGl的核心鉸鏈區(qū)模體為226-CPPC-229(半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-半胱氧酸)，而IgG4的是226-CPSC-229(半胱氨酸-脯氨酸-絲氨酸-半胱氨酸)，228位脯氨酸變?yōu)榻z氧酸的這一改變使IgG4核心鉸鏈區(qū)更容易被還原，鏈間二硫鍵極易變成鏈內二硫鍵，重鏈間共價鍵連接遭到破壞，最終導致IgG4重鏈解開，形成“半分子”。通過引入氨基酸突變，研宄人員發(fā)現(xiàn)抗體分子的CH3結構域而不是核心鉸鏈區(qū)對半分子交換具有決定性作用。實驗發(fā)現(xiàn)，將IgGl和IgG4的整個CH3結構域相互交換之后，IgG4失去了半分子交換能力，而IgGl則可以進行半分子交換，如果只交換鉸鏈區(qū)，IgGl獲得不了這種半分子交換能力。IgG4CH3結構域的第409位精氨酸殘基(R)使2條重鏈之間CH3-CH3作用力減弱，有利于半分子交換進行。在有還原劑(如谷胱甘肽)存在，37℃的生理條件下IgG4半分子交換能有效的進行。由于半分子交換現(xiàn)象的存在，IgG4的Fc不是十分適合應用于人源化抗體或Fc融合蛋白的制備。此外，有文獻報道，肥大細胞表面存在與IgE Fc受體相似的IgG4Fc受體，IgG4與其結合后可介導肥大細胞釋放組胺等介質，可能在IgE介導的遲發(fā)性介質釋放中發(fā)揮作用。

同IgG不同，IgM有兩種形式，分泌型和膜結合型，分泌型IgM為五聚體，由J鏈和二硫鍵連接五個IgM單體形成，分子結構呈環(huán)形，是Ig中分子最大者。μ鏈Cys414(Cμ3)和Cys575(C端的尾部)對于IgM的多聚化極為重要。在J鏈存在下，通過兩個鄰近單體IgMμ鏈Cys之間以及J鏈與鄰μ鏈Cys575之間形成二硫鍵組成五聚體。分泌型IgM的μ鏈在556位氨基酸后有20個氨基酸組成的尾片，C末端倒數(shù)第二個為Cys。膜表面型IgM的μ鏈在556位氨基酸后有41個氨基酸，其中富含帶負電氨基酸胞膜外區(qū)12個氨基酸，26個疏水性氨基酸組成的穿膜區(qū)以及胞漿區(qū)3個氨基酸。μ鏈含有5個同源區(qū)，其CH3和CH4相當于IgG的CH2和CH3，無鉸鏈區(qū)。IgG1、IgG2、IgG3的補體結合位點在CH2區(qū)內，而IgM補體結合位點在CH3區(qū)內，IgM無FcR結合能力。

本發(fā)明的有益效果如下。

本發(fā)明的重組人源嵌合GcFc基因片段，將SeqNo.1～3三段基因片段依次連接，如SeqNo.4所示。三個基因片段分別是IgG2的鉸鏈區(qū)及其CH2結構域N端的部分基因、IgG4的CH2結構域C端的部分基因、IgG2的CH3結構域基因。

由于IgG2的Fc段基因和IgG4的Fc段基因具有高度同源性，使重組的嵌合GcFc片段中的分別來源于IgG2的Fc段基因和IgG4的Fc段基因序列無縫嵌合，過渡自然，局部無突變氨基酸，重組成了人源嵌合GcFc片段。

重組人源嵌合GcFc基因片段編碼的GcFc多肽(228個氨基酸殘基，含鉸鏈區(qū))，其N端1～48個氨基酸序列與IgG2的鉸鏈區(qū)和CH2結構域N端的部分序列相一致，其19～119位氨基酸序列與IgG4的CH2結構域C端的部分基因編碼序列相一致，其C端113～228位氨基酸序列(不包括終止密碼子)與IgG2的CH3結構域基因編碼序列相一致。

該重組人嵌合GcFc基因片段，具有以下優(yōu)點：繼承了IgG4Fc無補體激活能力的特點；繼承了IgG2Fc極弱的FcγR結合能力；無IgG4半抗體重組(半分子交換)的弊端；IgG2Fc和IgG4Fc兩者無縫嵌合，過渡自然，局部無突變氨基酸，免疫原性最小化。

需要說明的是：本發(fā)明的重組人源嵌合GcFc基因片段并非是免疫球蛋白之不同結構域的雜合Fc區(qū)，而是根據免疫球蛋白的基因同源性，巧妙的將來源于不同免疫球蛋白Fc區(qū)的基因片段嵌合重組，表達人源免疫球蛋白嵌合Fc片段。該嵌合GcFc基因片的特點是：來源于不同免疫球蛋白的氨基酸殘基序列無縫嵌合，過渡自然，序列局部無突變氨基酸。其中，有的氨基酸殘基序列只來源于某一結構域的一部分，有的氨基酸殘基序列則橫跨兩個相鄰結構域的部分序列。此外，本發(fā)明的重組人源嵌合GcFc基因片段的概念中還包括鉸鏈區(qū)，鉸鏈區(qū)是本發(fā)明的重組人源嵌合GcFc基因片段不可分割的組成部分，特定的鉸鏈區(qū)序列是確保本發(fā)明的重組人源嵌合GcFc基因片段功能發(fā)揮不可缺少的一部分。因此，本發(fā)明的重組人源嵌合GcFc基因片段與免疫球蛋白之不同結構域的雜合Fc區(qū)具有本質不同。

IgGl重鏈基因序列來源于GenBank:AF237583.1所公開的序列。IgG2重鏈基因序列來源于GenBank:AF237584.1所公開的序列。IgG3重鏈基因序列來源于GenBank:AF237585.1所公開的序列。IgG4重鏈基因序列來源于GenBank:JC036239.1所公開的序列。IgM重鏈基因序列來源于GenBank:AJ294734.1所公開的序列。IgGl、IgG2、IgG3、IgG4和IgM重鏈的其他等位基因也包括在本發(fā)明的權利要求中。

附圖說明

圖1為pEGFP-N1載體質粒結構示意圖；

圖2為pGcFc載體質粒酶切電泳檢測示意圖，其中，泳道1：DL15000Marker分子，泳道2為pGcFc載體酶切片段；

圖3是構建成功的pGcFc-N1質粒結構示意圖；

圖4為實施例2中嵌合GcFc氨基酸殘基序列。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。

實施例1 pGcFc-N1質粒構建。

1.全基因合成GcFc基因序列，克隆到pUC57載體，構建成pUC57-GcFc載體。

全基因合成GcFc基因序列，即將IgG2的鉸鏈區(qū)及其CH2結構域N端的部分基因SeqNo.1、IgG4的CH2結構域C端的部分基因SeqNo.3、IgG2的CH3結構域基因SeqNo.3合成為如SeqNo.4所示的基因片段。

其中，IgGl重鏈基因序列來源于GenBank:AF237583.1所公開的序列。IgG2重鏈基因序列來源于GenBank:AF237584.1所公開的序列。IgG3重鏈基因序列來源于GenBank:AF237585.1所公開的序列。IgG4重鏈基因序列來源于GenBank:JC036239.1所公開的序列。IgM重鏈基因序列來源于GenBank:AJ294734.1所公開的序列。

2.在兩個無菌的0.2ml EP管，分別取pUC57-GcFc載體和pEGFP-N1載體各10μL，用BamHⅠ和NotⅠ限制性內切酶酶切目的基因片段和目的載體，反應體系和反應條件如下：

pEGFP-N1載體質粒結構圖如圖1所示。BamHI和NotI酶切pEGFP-N1，可將EGFP基因片段切掉。

3.瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的目的基因片段條帶和線性化的載體，DNA回收試劑盒回收純化。

4.目的片段與線性化的目的載體連接，構建成pGcFc-N1載體，具體反應體系如下：

5.轉化感受態(tài)細胞：冰浴中將10μL連接產物分別加入至50μL Top10感受態(tài)細胞中，最后涂布于含Kan抗生素(100μg/mL)的LB平板過夜培養(yǎng)。

6.挑取數(shù)個菌落，進行PCR檢測。

7.陽性克隆測序驗證，將菌落PCR鑒定得到的陽性克隆送公司測序進行測序驗證，測序完成后，軟件比對測序結果，測序引物CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG。Blast比對分析：基因GcFc已成功替換pEGFP-N1載體的EGFP序列，原始序列與已知序列進行BLAST 100％一致。構建成功的pGcFc-N1質粒結構圖如圖3所示。

8.用質粒提取試劑盒進行質粒小提后，取構建完成的pGcFc-N1載體10ul，用BamHⅠ和NotⅠ限制性內切酶雙酶切，最后瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，結果如圖2所示。

實施例2 重組人源嵌合GcFc基因片段的表達。

將實施例1得到的pGcFc-N1載體轉染至表達細胞中，獲得嵌合GcFc氨基酸殘基，其氨基酸殘基序列如圖4所示。

圖4中，單下劃線標示的氨基酸殘基來源于IgG2的序列，包括IgG2的鉸鏈區(qū)序列、CH2結構域N端的部分序列、以及CH3結構域序列；灰色突出標示的氨基酸殘基來源于IgG4CH2結構域C端的部分序列。兩者無縫嵌合，過渡自然，局部無突變氨基酸，重組成了人源嵌合GcFc片段

在實施例1和實施例2中，實驗儀器采用超凈工作臺，PCR儀，君意JY600E電泳儀。主要實驗試劑：限制性內切酶(Thermo Scientific)，DNA回收試劑盒(中美泰和)，質粒提取試劑盒(中美泰和)，PrimeSTAR Max Premix(2×)(Takara)，T4DNA連接酶(Thermo Scientific)，XL1-BLUE MRF’感受態(tài)細胞，Top10感受態(tài)細胞。測序部分為艾基生物公司完成。

以上所述的僅是本發(fā)明的一些實施方式。對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。