本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種激活肺癌細(xì)胞中抑癌基因RUNX3表達(dá)的雙鏈saRNA分子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺癌是名副其實(shí)的“超級殺手”，其發(fā)病率和死亡率均居各種癌癥的首位。該病早期常無明顯癥狀，相當(dāng)多的患者就診時(shí)已處于中晚期并伴有轉(zhuǎn)移，喪失了手術(shù)機(jī)會，此時(shí)的治療以化療為主。但是中晚期肺癌總體對化療很不敏感，并且化療藥物具有強(qiáng)烈的毒副作用，對機(jī)體內(nèi)的大量正常細(xì)胞，如肝細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞等造成巨大的毒性。研發(fā)新的肺癌治療方法和治療藥物是全球科研及臨床工作者所面臨的重大課題。

近年的研究日益顯示：一些在正常細(xì)胞中本應(yīng)高表達(dá)的抑癌基因，在肺癌細(xì)胞中發(fā)生轉(zhuǎn)錄沉默，這些抑癌基因的轉(zhuǎn)錄沉默是肺癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要原因。重新激活肺癌細(xì)胞中被沉默的抑癌基因的轉(zhuǎn)錄活動，就可以有力的抑制癌細(xì)胞的惡性行為，逆轉(zhuǎn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這是一種安全可靠的治療肺癌的新思路。

RUNX3是一種重要的抑癌基因，最初被命名為急性髓性白血病 2 基因，以后又被稱作多瘤病毒強(qiáng)化因子結(jié)合蛋白2基因、核心結(jié)合因子 3基因。該基因編碼的蛋白，一方面作為 Wnt 信號通路的負(fù)調(diào)控因子，與 TCF4-β-catenin 形成復(fù)合體，阻止其與 c-MYC、cyclinD1 等靶基因的啟動子區(qū)結(jié)合而抑制這些原癌基因的轉(zhuǎn)錄；另一方面作為TGF信號通路的正調(diào)控因子，與SMAD3/SMAD4協(xié)同作用上調(diào)p21 和BIM等抑癌基因的表達(dá)。在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，RUNX3的轉(zhuǎn)錄常被沉默，導(dǎo)致癌細(xì)胞的無限增殖，使其獲得遷移、侵襲、耐藥、抗凋亡等一系列惡性行為。

與基因啟動子區(qū)序列同源的雙鏈小RNA 能特異性的作用于該基因的啟動子，激活該基因的轉(zhuǎn)錄活動，從而有效上調(diào)其表達(dá)，這類雙鏈小RNA被稱為小激活RNA (saRNA)。

本發(fā)明針對肺癌細(xì)胞中被異常沉默的抑癌基因RUNX3，首次設(shè)計(jì)合成了作用于其啟動子區(qū)-385 bp至 -361 bp 的saRNA，有效激活了肺癌細(xì)胞中RUNX3 的表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一種可激活肺癌細(xì)胞中抑癌基因RUNX3表達(dá)的雙鏈saRNA分子及其在研究領(lǐng)域和醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本發(fā)明公開的saRNA為一種新的RNA序列，將該saRNA轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞，可以有力抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力和腫瘤干細(xì)胞自我更新能力。該saRNA為以下雙鏈RNA分子中的任意一種：

正義鏈5’ -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCC- 3’

反義鏈5’ -GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGC- 3’；

或

正義鏈：5’ -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCCtt -3’

反義鏈：5’ -GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGCtt -3’。

本發(fā)明提出了一種saRNA重組質(zhì)粒，該saRNA重組質(zhì)粒包含前面所述的任意一種雙鏈saRNA分子的序列。利用這樣的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞，能夠有效的激活RUNX3基因的表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞增殖，從而能夠有效的治療肺癌。

本發(fā)明提出了一種激活RUNX3轉(zhuǎn)錄的試劑盒，所述試劑盒包含前面所述的任意一種雙鏈saRNA分子或saRNA重組質(zhì)粒。利用本發(fā)明的試劑盒能夠有效的激活肺癌細(xì)胞中RUNX3基因的表達(dá)。

本發(fā)明提出了一種抗肺癌藥物，該藥物含有有效量的saRNA分子或saRNA重組質(zhì)粒，該抗肺癌藥物可以采用常規(guī)方法制備成相應(yīng)制劑，可通過皮下、肌肉、靜脈和局部等途徑給藥。

本發(fā)明具有特異性高、專一性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，能夠高效的激活肺癌細(xì)胞中被沉默的抑癌基因RUNX3的表達(dá)，在激活RUNX3表達(dá)的同時(shí)，不上調(diào)其它基因的表達(dá)，對正常細(xì)胞無毒害作用，是一種安全可靠、高效的抗肺癌手段。

附圖說明

圖1是化學(xué)合成的saRNA轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞SK-MES-1、H460、H446和A549后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測RUNX3 mRNA表達(dá)量的結(jié)果。圖中：縱坐標(biāo)表示相對于未處理組的RUNX3 mRNA相對表達(dá)量；橫坐標(biāo)表示未處理組、陰性對照組（NC），轉(zhuǎn)染30 nmol/L、60 nmol/L、90 nmol/L和120 nmol/L saRNA組。

圖2是WesternBlot檢測saRNA轉(zhuǎn)染SK-MES-1、H460和H446細(xì)胞后，RUNX3蛋白的表達(dá)量，NC指陰性對照組，saRNA指轉(zhuǎn)染90 nmol/L saRNA組。

圖3是化學(xué)合成的saRNA轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞SK-MES-1、H460和H446后，MTT法檢測saRNA對肺癌細(xì)胞增殖能力的影響。圖中：縱坐標(biāo)表示相對于陰性對照組的相對增殖率；橫坐標(biāo)表示轉(zhuǎn)染saRNA的濃度。

圖4是90 nmol/L saRNA轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞SK-MES-1、H460和H446后，對肺癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。圖 5 是90 nmol/L saRNA轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞SK-MES-1、H460和H446后，對肺癌細(xì)胞懸浮成球能力的影響。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1：saRNA激活RUNX3 基因的轉(zhuǎn)錄。

步驟一、試劑及其試劑準(zhǔn)備，以下實(shí)施例中，所使用的儀器：

熒光定量PCR儀（ABI 7500）；PCR儀（Biometra, T1 Thermobycler）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）等。

材料和試劑：RNAiMate (genepharma)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)，Trizol (天根)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (DRR014A PrimeScript?, TaKaRa)，SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）24 孔培養(yǎng)板（Nunc）等。

PCR引物：

RUNX3正向引物：5' -CAGCACCACAAGCCACTTCA- 3'

RUNX3反向引物：5' -GGTCGGAGAATGGGTTCAGTT- 3'

GAPDH正向引物：5' -TGTCCCCACTGCCAACGTGTCA- 3'

GAPDH反向引物：5' -GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT- 3'。

步驟二、化學(xué)合成saRNA

根據(jù)RUNX3啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游 385 bp至 361 bp的序列，設(shè)計(jì)saRNA:

正義鏈：5' -GCCCGCGGGGCUCCUAGCCCGCCCtt- 3'

反義鏈：5' -GGGCGGGCUAGGAGCCCCGCGGGCtt- 3'

將該序列在人類基因組數(shù)據(jù)庫中比對，確定沒有與它相同的其它序列。

步驟三、熒光定量PCR檢測RUNX3 mRNA表達(dá)水平。

S31、細(xì)胞培養(yǎng)：人肺癌細(xì)胞SK-MES-1、H460、H446和A549培養(yǎng)于含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

S32、細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染：將四種癌細(xì)胞以3.5×10⁴個(gè)/孔接種到24孔培養(yǎng)板中，每種細(xì)胞均設(shè)置未處理組、陰性對照組、30 nmol/L saRNA組、60 nmol/L saRNA組、90 nmol/L saRNA組和120 nmol/L saRNA組。37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，無雙抗無血清的培養(yǎng)基中，按siRNA-Mate^TM說明書中的步驟，將合成的saRNA按相應(yīng)的劑量轉(zhuǎn)染四種癌細(xì)胞。

S33、轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，Trizol提取總RNA，TaKaRa Primer Script RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR檢測樣本中RUNX3 mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參，采用2^-△△Ct法計(jì)算每個(gè)基因的相對mRNA表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 sec，60℃退火30 sec，循環(huán)40次。

S34、結(jié)果分析：saRNA能夠有效激活肺癌細(xì)胞中RUNX3基因的轉(zhuǎn)錄，具有一定的濃度依賴性。

實(shí)施例2：saRNA激活RUNX3蛋白表達(dá)的情況。

將人肺癌細(xì)胞SK-MES-1、H460和H446分別以1.5×10⁵個(gè)/孔接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)24 h，按siRNA-Mate^TM說明書中的步驟轉(zhuǎn)染，設(shè)陰性對照組和90 nmol/L saRNA組，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，吸除培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，加入100 μL細(xì)胞裂解液，在冰浴上裂解10 分鐘，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，10000 rpm離心5 分鐘后，取上清液測定蛋白濃度。每組取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完成后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉后進(jìn)行RUNX3一抗及羊抗兔二抗孵育，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯影。

結(jié)果分析：saRNA有效激活肺癌細(xì)胞中RUNX3蛋白的表達(dá)（圖 2）。

實(shí)施例3： saRNA對肺癌細(xì)胞增殖能力的影響。

將人肺癌細(xì)胞SK-MES-1、H460和H446以5×10³個(gè)/孔分別接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，按siRNA-Mate^TM說明書中的步驟轉(zhuǎn)染saRNA，設(shè)陰性對照組、30 nmol/L saRNA組、60 nmol/L saRNA組、90 nmol/L saRNA組和120 nmol/L saRNA組，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37℃繼續(xù)孵育4 h，吸除培養(yǎng)基，加入200 μL DMSO，490 nm波長測定吸光值。

結(jié)果分析： saRNA能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)濃度依賴性（圖 3）。

實(shí)施例4：saRNA對肺癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。

將三種癌細(xì)胞以3.5×10⁴個(gè)/孔接種到24孔培養(yǎng)板中，按siRNA-Mate^TM說明書中的步驟，將合成的saRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每種細(xì)胞均設(shè)陰性對照組和90 nmol/L saRNA組。于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染后24 h，收集細(xì)胞，以1000 個(gè)/孔的密度接種于6孔板，輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)培養(yǎng)1周。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加1:3醋酸/甲醇3 mL，固定15分鐘。結(jié)晶紫染液染10分鐘，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。在顯微鏡(低倍鏡)下計(jì)大于40個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，最后計(jì)算克隆形成率，克隆形成率= (克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

結(jié)果分析： saRNA能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞的克隆形成能力（圖 4）。

實(shí)施例5：saRNA對肺癌細(xì)胞懸浮成球能力的影響。

使用90 nmol/L 的saRNA和陰性對照序列轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞SK-MES-1、H460和H446，無血清培養(yǎng)液（1:1 DMEM/F12 medium，添加B-27和 N-2）中制成單細(xì)胞懸液，以1000個(gè)/孔的密度接種于超低吸附6孔板中，7天后，計(jì)數(shù)所形成的腫瘤球，并計(jì)算成球細(xì)胞比例。

結(jié)果分析： saRNA有力降低了成球細(xì)胞的比例（圖 5），說明該saRNA能夠抑制肺癌細(xì)胞中干細(xì)胞亞群的自我更新能力。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110> 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院

<120> 激活肺癌細(xì)胞中RUNX3表達(dá)的saRNA及其應(yīng)用

<160> 2

<210> 1

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

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<223>

<400> 1

gcccgcgggg cuccuagccc gccc

<210> 2

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列

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<223>

<400> 2

gcccgcgggg cuccuagccc gccctt