本發(fā)明涉及一種具有pH響應(yīng)的可快速釋放客體分子的納米載體及其制備方法與應(yīng)用，屬于納米材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基縮合成肽分子。肽分子廣泛存在于生物體并參與細(xì)胞或組織中重要的生命活動(dòng)，本身具有優(yōu)異的生物相容性與生物可降解性，是制備各種先進(jìn)生物材料的優(yōu)良原料。最近，人們發(fā)現(xiàn)許多肽分子(包括環(huán)狀肽、枝狀肽、兩親肽、共聚肽與芳香肽等)都具有非常強(qiáng)大的組裝性能，容易形成各種功能有序結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)與合成新的肽分子，利用自組裝技術(shù)構(gòu)筑新型功能納米材料并應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要研究意義。

目前，研究人員受生物體內(nèi)刺激響應(yīng)的啟發(fā)，結(jié)合超分子組裝技術(shù)，開(kāi)發(fā)了多種智能生物材料。與生物響應(yīng)相類(lèi)似，當(dāng)遇到刺激信號(hào)時(shí)，響應(yīng)型超分子組裝體會(huì)產(chǎn)生一系列相應(yīng)的變化，如解組裝與再組裝、形貌突變、相態(tài)轉(zhuǎn)變等。刺激源根據(jù)來(lái)源的不同主要分為內(nèi)部刺激源和外部刺激源。內(nèi)部刺激源包括pH、氧化/還原劑、酶與抗體等；外部刺激源主要有溫度、光、電場(chǎng)、磁場(chǎng)與超聲等。在所有刺激源中，pH是應(yīng)用最為廣泛的一種刺激條件，特別是作為抗癌藥物載體在提高藥物生物利用度和減少毒副作用方面優(yōu)勢(shì)非常突出。

另外，與持續(xù)釋放藥物體系相比較，爆炸性釋放對(duì)于許多特定的治療可能會(huì)有更多的優(yōu)勢(shì)和更好的效果，例如心臟病或心肌梗塞、急性缺血性腦中風(fēng)和嚴(yán)重的敗血癥等。最近，人們利用層層組裝技術(shù)開(kāi)發(fā)出了聚電解質(zhì)基膠囊系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了藥物分子的快速釋放，但是它們的直徑為幾個(gè)微米，大大限制了相關(guān)應(yīng)用。因此，非常有必要發(fā)展一種尺寸可調(diào)且可爆炸性釋放藥物的納米載體。

隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，各種優(yōu)異的功能性納米載體相繼被開(kāi)發(fā)，如金納米粒子、SiO₂納米粒子、氧化鐵納米粒子和聚合物納米粒子，這些粒子對(duì)各種疾病的診斷和治療展現(xiàn)出非常好的靈敏性和特異性，在生物醫(yī)藥方面非常有應(yīng)用前景(參見(jiàn)Nat.Protoc.,2015,10,90-105,Particle generation,functionalization and sortase A-mediated modification with targeting of single-chain antibodies for diagnostic and therapeutic use)。

基于生物肽或生物氨基酸(例如L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸，簡(jiǎn)稱(chēng)二苯丙氨酸)的多種納米結(jié)構(gòu)已被獲得，如：納米囊泡、納米管、納米纖維、納米顆粒及納米森林等，這些納米結(jié)構(gòu)可以充當(dāng)模板應(yīng)用于無(wú)機(jī)和有機(jī)納米材料的制備、也可與其他分子共組裝應(yīng)用于生物成像、藥物輸運(yùn)和腫瘤治療等方面(參見(jiàn)Chem.Soc.Rev.2010,39,1877-1890,Self-assembly and application of diphenylalanine-based nanostructure)。然而，迄今基于生物肽或生物氨基酸的納米載體還未能實(shí)現(xiàn)在不破壞藥物分子功能的前提下完成藥物的爆炸性釋放。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有pH響應(yīng)的可快速釋放客體分子的納米載體及其制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明納米載體的粒徑可調(diào)控，穩(wěn)定性好，能pH響應(yīng)的超快速釋放，藥物的封裝能力高；其制備方法簡(jiǎn)單、易操作。

本發(fā)明提供的具有pH響應(yīng)的可快速釋放客體分子的納米載體，所述納米載體由生物肽或生物氨基酸與交聯(lián)劑反應(yīng)制備得到；

所述生物肽包括二苯丙氨酸和/或二苯丙氨酸羧基端酰胺化的鹽酸鹽；

所述生物氨基酸包括苯丙氨酸；

所述交聯(lián)劑包括脂肪族二醛。

本發(fā)明中，二苯丙氨酸的結(jié)構(gòu)式如下式Ⅰ所示：

上述的納米載體中，所述脂肪族二醛為戊二醛和/或丁二醛；

所述二苯丙氨酸的構(gòu)型為L(zhǎng)型。

上述的納米載體中，所述納米載體的粒徑可為100～1000nm，具體可為400～700nm。

本發(fā)明具有pH響應(yīng)的可快速釋放客體分子的納米載體對(duì)pH刺激條件為生理pH條件；

本發(fā)明可快速釋放的客體分子為水溶性染料分子(帶負(fù)電荷的伊紅(Eosin)與帶正電荷的亞甲基藍(lán)(MB))、非水溶的染料分子(尼羅紅(NR))和抗癌藥物阿霉素(DOX)中的至少一種。

本發(fā)明還提供了上述的納米載體的制備方法，包括如下步驟：將生物肽溶液或生物氨基酸溶液與所述交聯(lián)劑溶液混合進(jìn)行席夫堿反應(yīng)，即得到所述具有pH響應(yīng)的可快速釋放客體分子的納米載體。

上述的制備方法中，溶解所述生物肽的溶劑為六氟異丙醇和/或二甲基亞砜；

所述生物肽溶液的濃度可為100mg/ml～150mg/ml，具體可為125mg/ml；

溶解所述生物氨基酸的溶劑可為水；

所述生物氨基酸溶液的濃度可為5mg/ml～50mg/ml，具體可為20mg/ml、5mg/ml～20mg/ml、20mg/ml～50mg/ml或15mg/ml～45mg/ml；

溶解所述交聯(lián)劑的溶劑選自水、乙醇和甲醇中的至少一種；

所述交聯(lián)劑溶液的質(zhì)量百分濃度可為0～25％，且不包括零，具體可為0.6％、0.12％、0.6％～0.12％。

上述的制備方法中，所述生物肽與所述交聯(lián)劑的摩爾比可為1：0.2～5，具體可為1:1、1：1.5～2.5或1：0.5～4；

所述生物氨基酸與所述交聯(lián)劑的投料摩爾比可為1:0.1～10，具體可為1:1、1:0.5～1.5。

上述的制備方法中，所述席夫堿反應(yīng)的溫度可為10～90℃，具體可為25℃、10～25℃、25～90℃、20～50℃或15～80℃；

所述席夫堿反應(yīng)的時(shí)間可為12～48h，具體可為24h、20～30h或15～40h。

本發(fā)明還提供了上述的制備方法制備得到的所述具有pH響應(yīng)的可快速釋放客體分子的納米載體。

本發(fā)明所述的納米載體應(yīng)用于作為藥物釋放載體材料中。

本發(fā)明所述的納米載體在制備具有生物相容性的納米材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)粒徑可調(diào)控：通過(guò)改變?nèi)軇w積和組裝基元的濃度，可以有效的調(diào)節(jié)納米載體的大小。

(2)穩(wěn)定性好：通過(guò)將二苯丙氨酸基納米載體的懸濁液加入到不同濃度的NaCl、KCl、KH₂PO₄以及不同pH的HCl溶液中，靜置并對(duì)其進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射及TEM表征，發(fā)現(xiàn)納米載體只會(huì)在鹽效應(yīng)作用下產(chǎn)生少量聚集，并不會(huì)造成結(jié)構(gòu)的破壞，說(shuō)明本發(fā)明納米載體對(duì)化學(xué)成分(NaCl、KCl、KH₂PO₄和HCl)保持了良好的穩(wěn)定性。

(3)pH響應(yīng)的超快速釋放：無(wú)論是水溶性還是非水溶性、正電荷還是負(fù)電荷的客體小分子都可以被封裝入納米載體中，并且在生理pH條件下可以選擇性的快速釋放負(fù)電荷染料分子與疏水性染料分子，釋放過(guò)程可在幾十秒或幾分鐘值內(nèi)完成。

(4)高的藥物封裝能力：納米載體可以封裝藥物分子阿霉素，封裝效率(EE)達(dá)到95％以上，同樣在中性pH或以上能展現(xiàn)了較快的釋放行為。

(5)本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，容易操作。

附圖說(shuō)明

圖1是納米載體的制備及客體分子封裝釋放示意圖。

圖2是自然干燥納米載體的掃描電鏡圖。

圖3是自然干燥納米載體的透射電鏡圖。

圖4是溶劑用量及組裝基元濃度對(duì)納米載體尺寸的影響。

圖5是納米載體的粒徑隨溶液濃度以及表面電勢(shì)隨時(shí)間變化的關(guān)系圖。

圖6是納米載體懸浮液的濁度隨pH增加的變化情況以及納米載體于不同pH值條件下的TEM圖；其中圖6a)為納米載體懸浮液的濁度隨pH增加的變化情況，圖6b)為pH值為5.0的TEM圖，圖6c)為pH值為5.6的TEM圖，圖6d)為pH值為6.5的TEM圖，圖6e)為pH值為7.2的TEM圖；圖6f)為pH值為8.1的TEM圖。

圖7是CLSM觀察的具有強(qiáng)烈熒光的納米載體；其中圖7a)為加入PBS(pH 7.2)前，納米載體熒光；圖7b)加入PBS(pH 7.2)時(shí)，納米載體熒光的變化情況；圖7c)加入PBS(pH 7.2)后，持續(xù)觀察納米載體熒光。

圖8為染料分子在PBS(pH 7.2)和pH 5.0緩沖溶液中的累積釋放量；其中圖8a)為Eosin的UV-Vis光譜分析；圖8b)為MB的UV-Vis光譜分析。

圖9a)為相同濃度納米載體裝載DOX前(虛線(xiàn))后(實(shí)線(xiàn))的UV-Vis光譜，插圖為納米載體裝載DOX前后的光學(xué)圖片；圖9b)為DOX在PBS(pH 7.2)和pH 5.0緩沖溶液中的累積釋放量分析。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中,苯丙氨酸的二聚體(二苯丙氨酸)的英文名為di-L-phenylalanine(Phe-Phe)，購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)為P4126；二苯丙氨酸羧基端酰胺化的鹽酸鹽(陽(yáng)離子二肽)的英文名為cationic dipeptide(H-Phe-Phe-NH₂·HCl)，購(gòu)自Bachem公司，貨號(hào)為G-2930。

實(shí)施例1、二苯丙氨酸納米載體的制備

1)將1mg生物肽二苯丙氨酸溶于8μl六氟異丙醇中，得到生物肽的六氟異丙醇溶液(又稱(chēng)為溶液a)，濃度為125mg/ml，4℃存放24小時(shí)以上使其充分溶解；

2)將2.4μl質(zhì)量百分濃度為25％的戊二醛的水溶液通過(guò)超純水稀釋到500μl，得到溶液b，濃度為0.12％；二苯丙氨酸與戊二醛的投料摩爾比為1：1；

3)將溶液b于65℃水浴加熱至恒溫充分溶解后，加入到溶液a中，經(jīng)席夫堿反應(yīng)，室溫(25℃)靜置24小時(shí)老化后，溶液變?yōu)榈S色濁液，離心除去上清液體即得本發(fā)明具有pH響應(yīng)的可快速釋放客體分子的納米載體。

實(shí)施例2、苯丙氨酸納米載體的制備

1)將20mg生物氨基酸苯丙氨酸溶于1mL超純水中，得到苯丙氨酸的水溶液(又稱(chēng)為溶液a)，濃度為20mg/ml，4℃存放24小時(shí)以上使其充分溶解；

2)取24μl質(zhì)量百分濃度為25％的戊二醛的水溶液即溶液b，濃度為0.6％；苯丙氨酸與戊二醛的投料摩爾比為1：1；

3)將溶液b加入到溶液a中，經(jīng)席夫堿反應(yīng)，室溫(25℃靜置24小時(shí)老化后，溶液變?yōu)榈S色濁液，離心除去上清液體即得本發(fā)明具有pH響應(yīng)的可快速釋放客體分子的納米載體。

實(shí)施例3、本發(fā)明實(shí)施例1所得二苯丙氨酸納米載體的表征

本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的納米載體掃描電鏡表征：將經(jīng)過(guò)離心洗滌的納米容器懸濁液(5μl)滴于硅片表面，真空將其抽干后，通過(guò)導(dǎo)電膠固定于樣品臺(tái)，通過(guò)濺射儀向其表面噴灑Au顆粒后于HITACHI S-4800掃描電鏡顯微鏡下觀察，其加速電壓為10kV；結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，本發(fā)明所得納米載體材料為單分散納米球，表面非常粗糙并有許多孔道結(jié)構(gòu)。

二苯丙氨酸納米載體透射電鏡表征：將經(jīng)過(guò)離心洗滌的納米球懸濁液(5μl)滴于銅網(wǎng)表面于真空將其抽干后于JEOL JEM-1011透射電鏡顯微鏡下觀察，其加速電壓為100kV；結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，本發(fā)明所得納米載體材料的納米球?yàn)閷?shí)心，粒徑為400～700nm。

本發(fā)明實(shí)施例2和1所得納米載體的表征結(jié)果與上無(wú)實(shí)質(zhì)性差別。

實(shí)施例4、二苯丙氨酸納米載體尺寸調(diào)控測(cè)試

將1mg FF所用的HFP體積從8μL逐漸增加到32μL或同比例增加FF與GA的量來(lái)控制組裝基元的濃度，并于Zetasizer Nano ZS ZEN3600動(dòng)態(tài)光散射儀器下表征本發(fā)明實(shí)施例1制備的二苯丙氨酸納米載體的粒徑。

所得結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)溶解1mg FF所用的HFP體積從8μL逐漸增加到32μL時(shí)，本發(fā)明二苯丙氨酸納米載體的粒徑被控制于700nm到400nm范圍內(nèi)；隨著組裝基元濃度的增加，納米載體的粒徑逐漸減小，說(shuō)明可以通過(guò)改變良溶劑HFP的量和組裝基元的濃度，可以有效的調(diào)節(jié)納米載體的大小。

實(shí)施例5、二苯丙氨酸納米載體在不同環(huán)境中的穩(wěn)定性測(cè)試

1)將300μL二苯丙氨酸納米載體懸濁液加入到不同濃度的NaCl或KCl溶液中(濃度范圍為0.0025mol/L到4mol/L)，靜置2h后，對(duì)其進(jìn)行DLS表征，并選具有代表性的樣品做SEM表征。

2)將300μL二苯丙氨酸納米載體懸濁液加入到12mmol/L KH₂PO₄水溶液中并保存15天，通過(guò)DLS監(jiān)測(cè)及TEM測(cè)試其粒徑隨時(shí)間的變化關(guān)系。

3)幾份300μL二苯丙氨酸納米載體懸濁液分別加入到不同pH的HCl溶液中(pH為4.6、3.8、3.2、2.5和1.9)，靜置15天，每天通過(guò)DLS監(jiān)測(cè)所有樣品的粒徑變化，并選取具有代表性的樣品進(jìn)行TEM表征及表面電勢(shì)檢測(cè)。

所得結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，NaCl、KCl、KH₂PO₄鹽溶液和不同pH值的HCl溶液只會(huì)在鹽效應(yīng)作用下使二苯丙氨酸納米載體粒子產(chǎn)生部分聚集，并不會(huì)對(duì)其造成結(jié)構(gòu)的破壞。

實(shí)施例6、pH誘導(dǎo)的二苯丙氨酸納米載體的爆炸性降解測(cè)試

將0.1mol/L的NaOH溶液逐滴滴加到二苯丙氨酸納米載體懸濁液中，同時(shí)進(jìn)行UV-Vis光譜測(cè)試，監(jiān)測(cè)濁度在650nm處的變化，通過(guò)TEM表征不同pH條件二苯丙氨酸納米載體粒子詳細(xì)的形貌變化，并將樣品置于培養(yǎng)皿中通過(guò)CLSM成像觀測(cè)其降解過(guò)程。

所得結(jié)果如圖6與圖7所示。

由圖6與圖7可知，說(shuō)明二苯丙氨酸納米載體在pH為中性或堿性的溶液中立即解組裝，這種特性可以使二苯丙氨酸納米載體作為一種潛在的可在生理pH條件下實(shí)現(xiàn)爆炸性釋放所裝載貨物的納米容器。

實(shí)施例7、客體小分子的封裝及pH響應(yīng)的快速釋放測(cè)試

對(duì)本發(fā)明實(shí)施例1所得的二苯丙氨酸納米載體進(jìn)行客體小分子的封裝及pH響應(yīng)的快速釋放測(cè)試。具體步驟如下：

將5mg/mL Eosin水溶液(50μL)、5mg/mL MB水溶液(50μL)、0.25mg/mL NR乙醇溶液(60μL)或4mg/mL DOX水溶液(25,50,75和100μL)分別加入到GA溶液中形成含0.12％GA水溶液0.5mL，再加入到8μL 125mg/mL的FF/HFP溶液中，室溫老化24h后，帶有不同顏色的沉淀出現(xiàn)于離心管底部。合并入二苯丙氨酸納米載體粒子中的水溶性分子的量用UV-Vis光譜并結(jié)合客體分子的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)確定。計(jì)算NR分子的合并量稍有不同：首先離心之后得到含NR的二苯丙氨酸納米載體沉淀，通過(guò)DMSO將其溶解之后再用UV-Vis光譜結(jié)合客體分子的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)確定。包封效率(Loading Efficiency,LE)與封裝效率(Encapsulation Efficiency,EE)分別通過(guò)如下公式Ⅰ和公式Ⅱ進(jìn)行計(jì)算：

包封于納米載體中的客體分子的質(zhì)量包封于納米載體中的客體分子的質(zhì)量+FF的質(zhì)量×100％公式Ⅰ

包封于納米載體中的客體分子的質(zhì)量初始加入的客體分子的質(zhì)量×100％公式Ⅱ

客體分子的快速釋放分別于PBS(pH 7.2)與另一種pH 5.0的緩沖溶液中進(jìn)行，其中在pH 5.0的緩沖溶液中的過(guò)程作為對(duì)照組。將含客體分子的FFNCs分別置于2mL PBS(pH 7.2)或pH 5.0的緩沖溶液中，立即離心收集上清液后，再向沉淀中加入等體積的釋放介質(zhì)，再離心收集，反復(fù)重復(fù)此過(guò)程直到PBS中幾乎沒(méi)有沉淀為止，收集到的上清液通過(guò)UV-Vis光譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定客體分子的量。

所得結(jié)果如圖8與圖9所示。

由圖8與圖9可知，二苯丙氨酸納米載體在生理pH條件下可以選擇性的快速釋放負(fù)電荷染料分子與疏水性染料分子，釋放過(guò)程可在幾十秒或幾分鐘值內(nèi)完成。此外，二苯丙氨酸納米載體也能封裝藥物分子阿霉素，封裝效率(EE)達(dá)到95％以上，在中性pH或以上也展現(xiàn)了較快的釋放過(guò)程。